李菲，李喆，胡文進，黃庶識，劉涇涇，黃媛林，王巧貞，潘信利*

(1.廣西科學院 廣西近海海洋環(huán)境科學重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西科學院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西科學院 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心/非糧生物質(zhì)酶解國家重點實驗室/廣西生物煉制重點實驗室/廣西生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530007；4.北京理工大學 材料學院，北京 100081)

1 引言

工業(yè)生物催化是以酶應用為核心，其具有位點和立體專一性的優(yōu)勢，通過基因克隆、突變和雜交等手段，用易錯PCR 方法構(gòu)建突變庫，結(jié)合高通量篩選策略來提高酶的活性、穩(wěn)定性、立體選擇性和非水反應性能[1]。鑒于生物催化的顯著優(yōu)勢，廣大學者和研發(fā)人員對各種生物功能酶展開深入研究。如黑曲霉Aspergillus niger963 的植酸酶基因，重組至畢赤酵母中表達，其植酸降解產(chǎn)量較原黑曲霉提高3 000 倍以上[2]；諾卡氏菌Nocardiasp.YS?2002 發(fā)酵腈水合酶活力最高達6 000 國際單位，并在大腸桿菌和畢赤酵母中獲得表達[3]。深海熱液口嗜熱厭氧古細菌熱球菌屬Thermococcussp.HJ21 產(chǎn)胞外耐熱酸性α-淀粉酶，最適溫度高達95℃[4]；肇東市日成酶制劑公司黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶，其酶活力可達20 000 U/mL，高于目前生產(chǎn)菌株的25 倍，在真菌基因工程菌中處于領(lǐng)先地位[5]。然而，隨著功能酶制品行業(yè)的迅速發(fā)展，進而顯露出不少弊端，主要體現(xiàn)在以下3 個方面[1]：（1）酶的種類單一，由多種原酶組成的多功能復合酶制劑發(fā)展滯后，難以滿足市場的需要；（2）酶活力低，產(chǎn)品的提取工藝和設備水平相對落后，導致一些產(chǎn)品的性價比低，缺乏市場競爭力；（3）酶制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的“三廢”會造成環(huán)境污染問題。因此，尋找高產(chǎn)多種功能酶的菌種資源成為解決這一瓶頸的重要方法，并能有效地推動我國酶制劑工業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

紅樹林作為獨特的潮間帶生態(tài)系統(tǒng)，對保護熱帶和亞熱帶的海岸線至關(guān)重要[6]。紅樹林系統(tǒng)常年受到海水周期性浸淹、波浪、強風、強流、徑流、沉積物、污水及廢水等因素的影響，形成了復雜的組成成分，加快了能量和物質(zhì)循環(huán)速度，增強了生產(chǎn)力和有機質(zhì)的降解活性。然而，微生物作為紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中種類豐富、數(shù)量龐大的組成部分，在碳固定、碳分解、氮固定和硫代謝等物質(zhì)和能量循環(huán)過程中起著關(guān)鍵作用[7]。此外，紅樹林微生物長期生活在高溫、高鹽、強風、缺氧和強紫外線等劣勢環(huán)境中，其遺傳物質(zhì)隨之不斷適應和進化[8]，代謝出結(jié)構(gòu)新穎、種類豐富、活性多樣的化合物[9]。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹林微生物的代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗氧化、細胞毒和殺蟲等生物活性[10-12]，且富含淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等多種功能酶及抗生素類化合物[13-16]。廣西茅尾海紅樹林自然保護區(qū)內(nèi)為熱帶過渡海洋性季風氣候，海陸交會使物質(zhì)積累豐富，蘊育著龐大的生物類群。針對這一特殊生境，本研究選取該保護區(qū)內(nèi)的土壤作為研究對象，通過8 種分離培養(yǎng)基、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，獲得紅樹林土壤中可培養(yǎng)放線菌的多樣性信息。采用點植法和透明圈法，以期獲得具有高產(chǎn)多種功能酶活性的菌株，為從海洋環(huán)境中尋找新的微生物資源提供理論依據(jù)和實踐指導。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

2.1.1 紅樹林土壤樣本

2018 年8 月從廣西茅尾海紅樹林自然保護區(qū)（21°44′53′′N，108°36′14′′E）中采集了3 處土壤樣本（每處相距5 m，由近岸紅樹林往外采集）。樣品裝于密封袋，4℃低溫保藏備用。

2.1.2 培養(yǎng)基

1）分離培養(yǎng)基

AGG、M7、P7、M10、M4、M5、M9 和P3（表1）。

2）純化培養(yǎng)基

改良ISP2 固體培養(yǎng)基[17]。

3）酶活篩選培養(yǎng)基

脲酶篩選培養(yǎng)基：尿素20.0 g，胰蛋白胨1.0 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.0 g，酚紅0.012 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL。酯酶篩選培養(yǎng)基：吐溫20 或吐溫80 10 mL，胰蛋白胨1.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL。過氧化氫酶和氧化酶活性篩選培養(yǎng)基以改良ISP2 固體培養(yǎng)基為載體。纖維素酶[18]、蛋白酶、淀粉酶[19]、幾丁質(zhì)酶[20]和褐藻膠裂解酶[21]篩選培養(yǎng)基參考了對應文獻配制。

2.2 實驗方法

2.2.1 菌株的分離純化

將土壤平鋪于無菌平皿中，經(jīng)65 ℃熱風干燥30 min。稱取2.0 g 樣品裝于20 mL 無菌水中搖勻；制成10?2和10?3稀釋度的樣液，取200 μL 梯度稀釋的樣液接種于8 種復合營養(yǎng)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)數(shù)天，及時觀察菌株的生長情況，挑取肉眼可見菌落進行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù)，以30%（V/V）甘油?ISP2 混合液作為保護劑，將純化好的菌株制成凍存管于?70℃條件下以保藏。

表1 分離培養(yǎng)基配方Table 1 Recipe of media for actinomycetes isolation

2.2.2 16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用chelex?100 樹脂[22]快速提取細菌的DNA 作為PCR 模板，并根據(jù)Walsh 等[23]的方法對其進行PCR擴增。擴增和測序引物選用27F 和1522R，參照李菲等[24]的方法設定PCR 反應條件。其中，潛在新菌株的PCR 擴增產(chǎn)物條帶用試劑盒進行切膠回收，將純化好的DNA 連接到pEASY?T1 克隆載體上，轉(zhuǎn)化至Trans?T1 感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂14.0 g，去離子水1 L)，培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落情況，挑取陽性克隆子，用PCR 法驗證克隆的片段大小。擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖?TAE 凝膠電泳檢測合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor 軟件整理后，利 用EzBioCloud 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.ezbiocloud.net/）進行在線比對[25]；以同源性最高菌株的有效序列作為參比對象，構(gòu)建Neighbor?Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支置信值設為Boostrap 1 000 次，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進行分析[26]。

2.2.3 放線菌的酶活性檢測

運用點植法將待測放線菌接種于酶活篩選培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)1～7 d。用透明圈法初步測定酯酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和褐藻膠裂解酶活性，觀察培養(yǎng)基上菌苔產(chǎn)生透明圈的情況；脲酶活性篩選則是觀察培養(yǎng)基變色情況，培養(yǎng)基變桃紅色則為陽性，反之則不變色。過氧化氫酶活性篩選是將5%的過氧化氫溶液滴加至每個菌苔，觀察菌苔產(chǎn)氣泡的情況，若產(chǎn)氣泡，則判定菌株具有過氧化氫酶活性。氧化酶活性篩選是將2%N,N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽溶液滴加至每個菌苔，觀察菌苔變色情況，若菌苔在30 s 內(nèi)變成紫紅色則判定菌株含有氧化酶活性，反之則無。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅樹林土壤放線菌的多樣性

廣西茅尾海紅樹林保護區(qū)內(nèi)紅樹林土壤中共分離到444 株放線菌，通過形態(tài)、大小和顏色等形態(tài)學特征去除部分冗余菌株，得到97 株放線菌進一步開展16S rRNA 基因測序分析，結(jié)果獲得63 種放線菌，隸屬于6 目13 科24 屬（圖1，表2）。鏈霉菌屬為優(yōu)勢類群，即菌種數(shù)為14，占所獲菌種數(shù)的22.22%；其他均屬為稀有放線菌，共49 種，占所獲菌種數(shù)的77.78%，其中微桿菌屬有8 種，占12.70%。

根據(jù)放線菌16S rRNA 基因序列相似性小于98.65%的菌株屬于不同物種的歸類原則[27]，對紅樹林土壤中分離到的放線菌進行新穎性分析，3 株放線菌的16S rRNA 基因序列（約1 500 bp）與其最近緣的典型菌株序列相似性均低于98.5%。其中，菌株Y1190 與微桿菌科的有效發(fā)表種Agromyces italicusDSM 16 388T(AT XF01000012)，B2965 和 Y1290 分別與諾卡氏菌科的有效發(fā)表種Gordonia oryzaeRS15-1ST(RKMH01000030)和Gordonia sediminisAMA 120T(MH013353)相似性最高，其相似率分別為97.42%、98.02%和98.35%?；?6S rRNA 基因序列，3 株潛在新種與其所在菌科中鄰近菌株構(gòu)建的Neighbor?Joining、Maximum?Likelihood和Maximum?Parsimony 系統(tǒng)進化樹，均能與其相似菌株在進化樹上聚為一簇。由此推測，菌株Y1190、B2965 和Y1290 可能分別為微桿菌科和諾卡氏菌科中的潛在新分類單元。需要進一步展開多相分類學鑒定工作，以確定菌株Y1190、B2965 和Y1290 的分類地位。

3.2 不同分離培養(yǎng)基的種屬分析

采用8 種分離培養(yǎng)基，從紅樹林土壤中共分離到63 種放線菌，分離效果見圖2 和表3。結(jié)果顯示，以菌屬數(shù)為主，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到次排序為P3、P7=M10、M4、M5=M7、AGG、M9；以菌種數(shù)為主，排序為P3、M10、P7、M4、M5、M7、AGG=M9；以菌株數(shù)為主，排序為M5、M10、P3、M4=P7、AGG、M7、M9。綜合3 個數(shù)值分析，P3、M10 和P7 培養(yǎng)基的分離效果顯著，分離到的放線菌種類和數(shù)量均較為豐富；其中，短桿菌屬、纖維微菌屬、假節(jié)桿菌屬和四折疊球菌屬類群僅在P3 培養(yǎng)基中獲得。結(jié)合多樣性指數(shù)分析（表3），P3 培養(yǎng)基分離的放線菌多樣性最好，其次是P7、M10、M4 和M7 培養(yǎng)基，M5、M9 和AGG 培養(yǎng)基的分離效果較差。P3 培養(yǎng)基主要以粗燕麥作為能源物質(zhì)，富含有各種維生素、微量元素和纖維等物質(zhì)，但水溶性較差，屬于寡營養(yǎng)培養(yǎng)基。此外，本研究發(fā)現(xiàn)燕麥、甘油和海藻糖可作為分離紅樹林生境的理想碳源；脯氨酸、天門冬氨酸和水解酪素為理想氮源。

3.3 放線菌的酶活性篩選結(jié)果

圖1 紅樹林土壤放線菌的16S rRNA 基因序列Neighbor?Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of actinomycetes from mangrove soil based on 16S rRNA sequences

表2 紅樹林土壤放線菌的分布Table 2 Distribution of actinomycetes from mangrove soil

圖2 不同培養(yǎng)基分離到放線菌的種類數(shù)量Fig.2 Quantities of species isolated from different media

表3 不同培養(yǎng)基分離到的細菌多樣性Table 3 Bacterial diversity isolated from different media

圖3 部分放線菌的酶活檢測效果圖Fig.3 Renderings of enzyme activity in some actinomycete

圖4 56 株放線菌的酶活篩選結(jié)果Fig.4 Enzyme-producing activities of 56 actinomycetes

以尿素、吐溫20、吐溫80、羧甲基纖維素鈉、膠體幾丁質(zhì)、可溶性淀粉和脫脂奶粉等原料作為篩選底物，對63 株不同種的放線菌進行功能酶活性篩選（圖3，圖4）。結(jié)果表明，從所測菌株中篩選到56 株放線菌在至少1 種功能酶活性檢測中顯示陽性，總陽性率為88.89%；篩選到具有2 種以上酶活性的放線菌為31 株，總陽性率為49.21%。表4 所示，產(chǎn)脲酶、酯酶、過氧化氫酶、纖維素酶、蛋白酶、氧化酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶和褐藻膠裂解酶活性的放線菌數(shù)分別為12 株、25 株、36 株、17 株、24 株、2 株、4 株、5 株和5 株，陽性率分別為19.05%、39.68%、41.27%、26.98%、38.10%、3.17%、6.35%、7.94%和7.94%。

4 結(jié)論與討論

放線菌是一種最具經(jīng)濟價值和生物技術(shù)價值的原核生物，是產(chǎn)生抗生素、酶及其抑制劑等功能活性物質(zhì)的主要來源。據(jù)報道，截至2002 年，已知的微生物活性次生代謝產(chǎn)物超過22 000 種，其中70%來自放線菌，20%來自真菌，7%由芽孢桿菌產(chǎn)生，1%～2%來源于其他細菌[28]。其中，放線菌因其豐富的生物化學多樣性、可大規(guī)模培養(yǎng)及易于遺傳操作等優(yōu)點，日益成為生產(chǎn)生物活性化合物和工業(yè)酶的重要資源[28]。據(jù)報道，來源于海洋的放線菌含有豐富的功能酶，紅樹林作為海洋特殊的生態(tài)系統(tǒng)，其放線菌在功能酶上的研究卻寥寥無幾[18,29-31]。本研究選取廣西茅尾海紅樹林自然保護區(qū)內(nèi)的紅樹林土壤作為研究對象，開展可培養(yǎng)放線菌多樣性分析，從中分離到可培養(yǎng)放線菌444 株，隸屬于6 目13 科24 屬63 種，分離到放線菌的優(yōu)勢菌群為鏈霉菌屬（22.22%）和微桿菌屬（12.70%），與各地紅樹林土壤中放線菌優(yōu)勢菌群的報道不盡相同，如馬來西亞熱帶紅樹林土壤中的鏈霉菌屬占59.80%[32]；印度洋紅樹林土壤中的鏈霉菌屬和馬杜拉菌屬分別占32.37% 和15.11%[31]；九龍江口紅樹林放線菌中的小單胞菌屬和鏈霉菌屬分別占81.38%和13.20%[33]；巴西紅樹林土壤中放線菌以微桿菌屬為主[34]；海南?？诒备蹗u紅樹林土壤放線菌主要以脫醌菌屬和微球菌屬為主[35]；海南三亞紅樹林底泥中放線菌以小單胞菌屬為主[36]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，紅樹林土壤中存在動球菌屬、四折疊球菌屬、短狀桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、科氏游動菌屬和Mycolicibacteriumsp.等放線菌類群，該部分放線菌僅在鹽湖、高鹽咸水灘和鹽場等高鹽環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)[37-38]。可見，紅樹林生境中富含耐鹽的放線菌類群。

表4 56 株放線菌的功能酶活性Table 4 Enzyme-producing activities of 56 actinomycetes

酶活檢測結(jié)果顯示，這一批紅樹林土壤放線菌中具有豐富的酶活特性且部分菌株的酶活特性顯著。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹林土壤中酶活代謝活力最強的類群為鏈霉菌屬，其次是微桿菌屬和短小桿菌屬，這與大部分的研究報道結(jié)果相似[19,34,39]。其中，產(chǎn)酯酶、過氧化氫酶和蛋白酶的放線菌數(shù)較高，這可能與紅樹林土壤富含動植物殘體所提供的脂素和蛋白類等營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。此外，紅樹林生境中有機質(zhì)較非紅樹林區(qū)域的豐富[40]，致使其生境放線菌具有多種功能酶活性，但本文研究結(jié)果顯示，具有2 種以上酶活功能的放線菌有31 株，僅占50%左右，且3 種以上酶活功能的菌株數(shù)更少了。究其原因可能是：（1）人工配置培養(yǎng)基的底物具有一定篩選作用；（2）紅樹林土壤受到海水周期性浸淹，海水中動植物殘體及紅樹植物代謝產(chǎn)生豐富有機質(zhì)，放線菌通過分解這些有機質(zhì)來生存；（3）紅樹林放線菌的生境特殊，其需具備多種功能酶特性，以便利用復雜多變的生境中微量的有機質(zhì)進行生存。后續(xù)將用活性追蹤對這56 株放線菌的功能酶進行分離、檢驗和分析，進一步確定其具體的作用機制。綜上所述，廣西茅尾海紅樹林保護區(qū)的放線菌資源豐富，在酶制劑應用方面具有較強的開發(fā)潛力，為后續(xù)篩選農(nóng)業(yè)應用微生物提供了依據(jù)。