基于轉(zhuǎn)錄組的葡萄花翅小卷蛾三類(lèi)解毒酶基因家族分析

白姣洋， 趙俊凝， 王 康， 陳茂華

西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100

葡萄花翅小卷蛾是影響世界葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量的一種重要經(jīng)濟(jì)害蟲(chóng)，2012年國(guó)家檢驗(yàn)檢疫中心將其列入檢疫性有害生物名錄(牛春敬等，2013)。該蟲(chóng)原產(chǎn)于意大利，后在地中海和歐洲地區(qū)迅速蔓延，現(xiàn)已擴(kuò)散至美洲阿根廷、智利、加利福尼亞等地區(qū)(Gilliganetal.，2011)。目前，我國(guó)尚未出現(xiàn)該蟲(chóng)入侵的相關(guān)報(bào)道(李俊峰等，2017)。

葡萄花翅小卷蛾隸屬鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricinae，其幼蟲(chóng)可取食多種經(jīng)濟(jì)作物的花和果實(shí)，寄主包括葡萄VitisviniferaL.、油橄欖OleaeuropeaL.、迷迭香RosmarinusoficinalisL.、鐵線(xiàn)蓮ClematisvitalbaL.、山茱萸Cornusspp.、忍冬LoniceraxylosteumL.、女貞LigustrumvulgareL.等在內(nèi)的40多種植物(Iroiattietal.，2011)，對(duì)不同寄主植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和次生代謝物具有廣泛適應(yīng)性。目前葡萄花翅小卷蛾的控制主要依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥(Akyol & Aslan，2010; Ifoulis & Savopoulou，2004)，而殺蟲(chóng)劑的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致該蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯等多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗藥性，造成該蟲(chóng)防治困難(蘇莎等，2020; Pasquinietal.，2018)。

當(dāng)昆蟲(chóng)遭遇植物防御性次生代謝物和農(nóng)藥等有毒外源化合物刺激時(shí)，其體內(nèi)的解毒酶會(huì)發(fā)生一系列變化，從而協(xié)助昆蟲(chóng)消除這些化合物對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的不利影響(陳澄宇等，2015； 段辛樂(lè)等，2015； 吳有剛等，2019)。Hatipogluetal.(2015)研究發(fā)現(xiàn)，采自土耳其的葡萄花翅小卷蛾產(chǎn)生抗藥性時(shí)，抗性品系與敏感品系蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶表達(dá)量存在差異。Navarro-Roldánetal.(2020)的研究也證實(shí)了不同性別葡萄花翅小卷蛾種群體內(nèi)解毒酶活性不同。昆蟲(chóng)的解毒酶基因家族主要包括細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450s，P450s)、羧酸酯酶(Carboxylesterases，CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GSTs)三大酶系。不同解毒酶對(duì)殺蟲(chóng)劑的代謝方式不同：CarE可使有機(jī)物的酯鍵發(fā)生斷裂，達(dá)到解毒效果；GST能促使體內(nèi)各種有毒物質(zhì)以非酶方式排出體外?？顾幮韵嚓P(guān)的P450基因主要為CYP4和CYP6家族的成員(張紅英等，2002)，這些基因在昆蟲(chóng)抗性種群中表達(dá)水平顯著上升。一般來(lái)說(shuō)，三大解毒酶可通過(guò)高表達(dá)、基因擴(kuò)增或基因突變等方式提高昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性。

迄今為止，對(duì)葡萄花翅小卷蛾抗性的研究主要集中在比較其對(duì)不同殺蟲(chóng)劑的抗性水平，而對(duì)抗藥性的分子機(jī)制知之甚少(Navarro-Roldánetal.，2020)，解毒酶相關(guān)的研究對(duì)該蟲(chóng)的抗藥性監(jiān)測(cè)和抗藥性治理具有重要的意義。

本研究對(duì)葡萄花翅小卷蛾的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)注釋信息獲取解毒酶基因，與棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(Hübner)和蘋(píng)果蠹蛾CydiapomonellaL.等鱗翅目昆蟲(chóng)的同源基因?qū)Ρ?，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，探究三大解毒酶家族基因的分類(lèi)和進(jìn)化特點(diǎn)，挖掘該蟲(chóng)的解毒酶基因序列，為進(jìn)一步研究葡萄花翅小卷蛾對(duì)殺蟲(chóng)劑和寄主植物的適應(yīng)性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 RNA樣本

葡萄花翅小卷蛾樣本由阿根廷門(mén)多薩省農(nóng)業(yè)衛(wèi)生與質(zhì)量研究所Gustavo Taret先生提供，成蟲(chóng)樣本保存于RNA保存液中；RNA的提取參照Direct-zol RNA Miniprep試劑盒(Zymo research, Irvine, CA)說(shuō)明書(shū)，DNase I處理去除DNA殘留。利用Nano Photometer測(cè)定儀和凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝及功能注釋

將滿(mǎn)足測(cè)序要求的高質(zhì)量葡萄花翅小卷蛾總RNA送至深圳華大基因科技有限公司，通過(guò)BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得原始數(shù)據(jù)；使用trimmomatic進(jìn)行過(guò)濾(去除包含接頭、未知堿基含量>5%和低質(zhì)量的reads)；利用Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行de novo組裝，然后使用Tgicl對(duì)組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類(lèi)去冗余，獲得unigene；通過(guò)Blast將組裝得到的unigene進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫(kù)Nr(non-redundant proteins reference sequences)、Nt (nucleotide sequence database)、KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 、Swiss-Prot、GO (gene ontology )、Pfam和KOG注釋。

1.3 三大解毒酶基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

以葡萄花翅小卷蛾3種解毒酶(P450、CarE和GST)基因的蛋白序列為基礎(chǔ)，在NCBI中下載鱗翅目物種昆蟲(chóng)3種解毒酶基因的蛋白序列，使用MEGA 7程序中的MUSCLE對(duì)不同物種的P450、GST和CarE氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(對(duì)于CarE和P450基因，選取>1000 bp的基因序列用于建樹(shù)分析)。3種解毒酶基因均采用MEGA 7軟件中的neighbor join (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝

為獲得葡萄花翅小卷蛾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用BGISEQ-500技術(shù)平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行RNA測(cè)序。測(cè)序樣品數(shù)據(jù)為6.4 Gb，經(jīng)Trinity和Tgicl軟件拼接共獲得44360個(gè)unigene，其總長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度、N50及GC含量分別為49864535、1124、2078 bp和42.81%，通過(guò)BUSCO軟件評(píng)估組裝結(jié)果為95%，表明轉(zhuǎn)錄組的組裝具有較高的完整性。

2.2 基因功能注釋

將組裝獲得的44360條unigene與7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，共有28065條unigene被注釋?zhuān)渲型ㄟ^(guò)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)成功注釋的unigene數(shù)量最多，共有26388條，在總unigene數(shù)中占比59.49%(表1)。Unigene注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的物種主要為棉鈴蟲(chóng)和柑橘卷葉蛾Amyeloistransitella(Walker)，分別占24.11%和16.94%(圖1)。此外，根據(jù)Nr注釋結(jié)果，本研究共注釋了144條解毒酶基因，其中包括91條P450酶系基因、22條GST酶系基因和31條CarE酶系基因。

表1 葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組unigene BLAST注釋結(jié)果

圖1 葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組unigene在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布

2.3 P450注釋分析及其與幾種鱗翅目昆蟲(chóng)P450的進(jìn)化關(guān)系

葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組中有91個(gè)CYP基因，在解毒酶基因中所占比例最大，選取核苷酸序列長(zhǎng)度大于1000 bp的33個(gè)P450基因進(jìn)行發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，33個(gè)P450基因可注釋到CYP4、CYP6、CYP9等家族，分屬于clade 2(2個(gè)基因)、clade 3(17個(gè)基因)、clade 4(8個(gè)基因)和線(xiàn)粒體clade(6個(gè)基因)(圖2)。葡萄花翅小卷蛾P(guān)450基因均能夠與鱗翅目的P450聚在一起，其中葡萄花翅小卷蛾CYP4、CYP6和CYP9家族基因與鱗翅目其他物種的同源數(shù)較多。

2.4 GST注釋分析及其與幾種鱗翅目昆蟲(chóng)GST的進(jìn)化關(guān)系

注釋結(jié)果顯示，在葡萄花翅小卷蛾中有22個(gè)GST基因，核苷酸序列長(zhǎng)度在590～1450 bp之間。將這些GST基因與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的同源基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，葡萄花翅小卷蛾與蘋(píng)果蠹蛾、云杉芽卷蛾Choristoneurafumiferana(Clem.)和棉鈴蟲(chóng)等昆蟲(chóng)的相應(yīng)GST蛋白可聚為一類(lèi)。注釋的葡萄花翅小卷蛾表達(dá)的GST分別屬于Microsomal(3個(gè))、Epsilon(7個(gè))、Delta(5個(gè))、Omega(3個(gè))、Sigma(2個(gè))、Zeta(1個(gè))和Theta(1個(gè))等GST亞家族，其中主要以Epsilon和Delta亞家族GST數(shù)量最多(圖3)。

2.5 CarE注釋分析及其與鱗翅目近緣物種的CarE進(jìn)化關(guān)系

羧酸酯酶又稱(chēng)脂族酯酶，是酯酶超基因家族中重要的一類(lèi)酶，根據(jù)其功能通常可分為消化解毒酶、激素與信息素代謝酶以及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白。在葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組中有31個(gè)CarE基因的轉(zhuǎn)錄本，選取基因長(zhǎng)度大于1000 bp的12個(gè)CarE基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)這些CarE基因根據(jù)功能大致可以分為3類(lèi)：一類(lèi)承擔(dān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；另一類(lèi)參與外源化合物消化和解毒，與棉鈴蟲(chóng)CarE聚為一類(lèi)；還有一類(lèi)是與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的蛋白，在葡萄花翅小卷蛾中主要為乙酰膽堿酯酶(圖4)。

3 結(jié)論與討論

葡萄花翅小卷蛾是葡萄等果樹(shù)上的重要害蟲(chóng)，作為重要的進(jìn)境檢疫性有害生物，該蟲(chóng)在我國(guó)尚未有入侵和發(fā)生的報(bào)道。開(kāi)展葡萄花翅小卷蛾代謝酶的完整分析，對(duì)于該蟲(chóng)入侵風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及防治措施制定具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)表達(dá)144個(gè)解毒酶基因，包含91個(gè)細(xì)胞色素P450基因、31個(gè)CarE基因和22個(gè)GST基因。這些解毒酶基因與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的同源基因存在較高的相似性。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同鱗翅目昆蟲(chóng)基因組中的解毒酶基因存在許多同源基因?qū)突蛉?，存在較高的保守性(艾均文等，2015)。葡萄花翅小卷蛾與其他鱗翅目昆蟲(chóng)的解毒酶同源基因可能具有相似的代謝機(jī)制。

圖2 葡萄花翅小卷蛾與其幾種鱗翅目昆蟲(chóng)CYP的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖3 葡萄花翅小卷蛾與幾種鱗翅目昆蟲(chóng)GST的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖4 葡萄花翅小卷蛾與幾種鱗翅目昆蟲(chóng)CarE的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

細(xì)胞色素P450是昆蟲(chóng)體內(nèi)一類(lèi)重要的解毒酶，其在生物轉(zhuǎn)化、內(nèi)源底物的催化以及外源物質(zhì)的代謝和解毒過(guò)程中具有重要作用(Guengerich，2001； Lietal.，2007; Feyereisen，1999； Rewitz，2004)。P450通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化、基因突變等多種機(jī)制影響昆蟲(chóng)對(duì)不同寄主適應(yīng)性和殺蟲(chóng)劑抗性(Bassetal.，2013； Wangetal.，2018)。葡萄花翅小卷蛾幼蟲(chóng)在不同寄主上的生長(zhǎng)速度、交配成功率、繁殖力都存在差異，這可能與其體內(nèi)P450解毒酶對(duì)植物次生代謝物質(zhì)的解毒能力有關(guān)(Denis & Jerme，2005)。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄花翅小卷蛾的P450基因主要屬于CYP4和CYP6家族，這2個(gè)家族的P450基因被證實(shí)與多種殺蟲(chóng)劑的抗性相關(guān)(郭亭亭等，2009； 楊帆和王進(jìn)軍，2008； Kimetal.，2017)。本研究組發(fā)現(xiàn)1個(gè)葡萄花翅小卷蛾的P450CYP6亞家族基因和蘋(píng)果蠹蛾的CYP6B2基因在系統(tǒng)樹(shù)上聚為一支，而CYP6B2被證實(shí)在蘋(píng)果蠹蛾對(duì)溴氰菊酯和谷硫磷的抗藥性中具有重要作用(Wanetal. 2019)；而葡萄花翅小卷蛾的1個(gè)CYP4亞家族基因和小菜蛾CYP4g15基因聚為一支，據(jù)報(bào)道，CYP4g15參與柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama對(duì)農(nóng)藥的代謝(Tianetal.,2019)；葡萄花翅小卷蛾另外1個(gè)CYP4亞家族基因和斜紋夜蛾SpodopteralitturaFabriciusCYP4C1基因聚為一支，CYP4C1被證實(shí)在多種昆蟲(chóng)對(duì)植物次生代謝物質(zhì)中具有重要作用(Huangetal.，2019)。

CarE在昆蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯以及擬除蟲(chóng)菊酯等多種殺蟲(chóng)劑的抗性中起重要作用(劉紅霞等，2012； 張柯等，2002； Wangetal.，2018)。CarE基因擴(kuò)增和基因突變可能介導(dǎo)昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性(Wangetal.，2018; Zhangetal.，2013)。羧酸酯酶CarE001A和CarE001H在棉鈴蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的代謝中具有重要的作用(Lietal.，2020)。羧酸酯酶RpCarE基因表達(dá)量的變化介導(dǎo)了禾谷縊管蚜RhopalosiphumpadiL.對(duì)異丙威和高效氯氟氰菊酯2種農(nóng)藥的抗性(Wangetal.，2018)。Navarro-Roldánetal.(2020)研究葡萄花翅小卷蛾對(duì)毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和噻蟲(chóng)啉3種殺蟲(chóng)劑的代謝解毒機(jī)制，發(fā)現(xiàn)酯酶活性顯著升高，羧酸酯酶活性增強(qiáng)可能介導(dǎo)該抗藥性。本研究共發(fā)現(xiàn)31個(gè)CarE基因，這些酯酶可能參與葡萄花翅小卷蛾體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、內(nèi)源與外源化合物的消化和解毒，其功能有待進(jìn)一步研究。

GST是昆蟲(chóng)體內(nèi)三大解毒酶之一，可以通過(guò)促進(jìn)殺蟲(chóng)劑的還原性脫氯化氫或與還原性谷胱甘肽發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)來(lái)代謝殺蟲(chóng)劑(Enayatietal.，2010)。GST還可以清除昆蟲(chóng)體內(nèi)殺蟲(chóng)劑作用過(guò)程中產(chǎn)生的有毒氧自由基。大量研究表明，GST與昆蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性有關(guān)(尤春燕等，2013； Fournieretal.，1992)，與抗性相關(guān)的昆蟲(chóng)GST基因分屬于Delta和Epsion 2個(gè)亞族(Caoetal.，2018; Vontasetal.，2001)。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲(chóng)GST可被植物次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)，并對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感性產(chǎn)生影響(陳鳳菊等，2003; 高希武等，1997)。本研究基于葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)22個(gè)GST基因，其中有12個(gè)GST基因?qū)儆诶ハx(chóng)特有的Delta和Epsion亞族，這2個(gè)亞家族的基因在昆蟲(chóng)對(duì)外源物質(zhì)的代謝中發(fā)揮非常重要的作用(Chen & Zhang，2015)，本研究鑒定的葡萄花翅小卷蛾各個(gè)GST基因的具體功能有待進(jìn)一步分析。