副豬嗜血桿菌病滅活疫苗與豬瘟活疫苗混合免疫時(shí)的免疫效力評(píng)價(jià)

翟路峰 ， 高 曼 ， 張國良 ， 朱巧艷 ， 金云云 ， 廖永洪 ， 田克恭

(1. 國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心 ， 河南 洛陽 471003 ； 2. 普萊柯生物工程股份有限公司 ， 河南 洛陽 471000)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種以高熱和內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血為特征的豬的高度接觸性傳染病[1]。副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS)引起的豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的接觸性細(xì)菌傳染病[1]。這2種疫病在我國臨床豬場(chǎng)均呈現(xiàn)出高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病，疫苗免疫是預(yù)防和控制這2種疫病最為有效的途徑[2-3]。我國臨床豬場(chǎng)疫病繁雜，受到多種傳染病的威脅，為使豬群免受疫病感染，多種疫苗需要在豬場(chǎng)中使用，而多次免疫接種容易引起豬只應(yīng)激反應(yīng)，且加重養(yǎng)殖人員的勞動(dòng)負(fù)擔(dān)。因此，在臨床免疫過程中，如何在保證疫苗免疫效果的同時(shí)減少免疫次數(shù)成為當(dāng)務(wù)之急。

通過2種或2種以上的疫苗混合免疫，達(dá)到一針兩防或者一針多防的效果，是近年來養(yǎng)殖場(chǎng)疫苗免疫過程中一種新的嘗試[4-7]。但并非所有疫苗都可以混合使用，已有研究表明，有些疫苗同時(shí)注射會(huì)對(duì)疫苗效力產(chǎn)生協(xié)同作用，有的會(huì)產(chǎn)生拮抗作用[8-11]。本試驗(yàn)通過副豬免疫攻毒試驗(yàn)和監(jiān)測(cè)免疫后豬瘟抗體水平對(duì)國內(nèi)首個(gè)水性佐劑副豬嗜血桿菌病滅活疫苗與豬瘟活疫苗混合免疫的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為這2種疫苗在臨床中的聯(lián)合使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗與細(xì)胞 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)，水性佐劑副豬嗜血桿菌病二價(jià)滅活疫苗(4型JS株+5型ZJ株)，均由普萊柯生物工程股份有限公司生產(chǎn)；ST細(xì)胞由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 菌毒種 副豬嗜血桿菌4型JS株、副豬嗜血桿菌5型ZJ株和豬瘟病毒Thiverval株由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.3 主要試劑 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液，均購自HyClone公司；豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，購自IDEXX公司；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，均購自BD公司；新生牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 21～28日齡健康仔豬，共40頭，CSFV抗體、HPS抗體均為陰性，購自洛陽周邊農(nóng)戶家。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 HPS滅活疫苗稀釋CSF活疫苗后CSFV含量測(cè)定 分別用HPS滅活疫苗和活疫苗專用稀釋液將CSF活疫苗稀釋成2 mL/頭份，將稀釋后的HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗在25 ℃條件下放置2 h，每隔1 h取樣，用含3%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基將樣品做10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度，與分散好的ST克隆細(xì)胞同步接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別測(cè)定HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗中的CSFV含量。

1.5.2 HPS滅活疫苗與CSF活疫苗混合免疫效果評(píng)價(jià)

1.5.2.1 動(dòng)物分組與免疫 將上述40頭健康仔豬隨機(jī)分為8個(gè)組，5頭/組。第1、2、3組試驗(yàn)豬于21～28日齡免疫HPS、CSF混合疫苗，2 mL/頭(含CSF活疫苗1頭份)，間隔3周，加強(qiáng)免疫HPS滅活疫苗，2 mL/頭；第4、5組試驗(yàn)豬于21～28日齡免疫HPS滅活疫苗，2 mL/頭，間隔3周，加強(qiáng)免疫HPS滅活疫苗，2 mL/頭；第6組試驗(yàn)豬于21～28日齡免疫CSF活疫苗，1頭份/頭；第7、8組試驗(yàn)豬不免苗作為對(duì)照。

1.5.2.2 HPS部分效力評(píng)價(jià) 第1、4、7組試驗(yàn)豬于二免后2周，腹腔注射1個(gè)最小發(fā)病劑量HPS 4型JS株菌液，第2、5、8組試驗(yàn)豬于二免后2周，腹腔注射1個(gè)最小發(fā)病劑量HPS 5型ZJ株菌液，攻毒后連續(xù)觀察14 d，觀察并記錄攻毒豬死亡和發(fā)病情況，攻毒后第14天對(duì)存活豬只進(jìn)行安樂死后剖檢，觀察并記錄各臟器病理變化，對(duì)各組試驗(yàn)豬發(fā)病情況進(jìn)行分析。

1.5.2.3 CSF部分效力評(píng)價(jià) 對(duì)第3組和第6組試驗(yàn)豬在免疫前、免疫后2、4、6、8周采血、分離血清。用IDEXX豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血清中CSFV抗體，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。用細(xì)胞中和試驗(yàn)法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血清CSFV中和抗體：以CSFV Thiverval株和ST細(xì)胞作為試驗(yàn)用病毒和細(xì)胞，將病毒液稀釋至200TCID50/100 μL，與等量2倍系列稀釋的被檢血清混合，37 ℃作用60 min，接種ST細(xì)胞，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)96 h，采用間接免疫熒光方法進(jìn)行染色和結(jié)果判定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 23.0軟件對(duì)CSFV抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 HPS、CSF混合疫苗中CSFV含量測(cè)定 將稀釋后的HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗在25 ℃條件下放置2 h，每隔1 h取樣，分別測(cè)定HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗中的CSFV含量，2 h內(nèi)均未見明顯下降。見表1。

表1 疫苗中CSFV含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of CSFV content in vaccines

2.2 HPS滅活疫苗與CSF活疫苗混合免疫效果評(píng)價(jià)

2.2.1 HPS部分效力評(píng)價(jià) 二免后2周，分別對(duì)HPS、CSF混合疫苗免疫豬和HPS滅活疫苗免疫豬進(jìn)行HPS 4型和HPS 5型強(qiáng)毒株攻毒，結(jié)果混合疫苗免疫豬HPS 4型強(qiáng)毒株和HPS 5型強(qiáng)毒株攻毒均能達(dá)到5/5保護(hù)，與HPS滅活疫苗免疫組效力相當(dāng)。見表2。

表2 2種疫苗免疫仔豬后HPS攻毒保護(hù)結(jié)果Table 2 HPS challenge protection results of piglets immunized with two vaccines

2.2.2 CSFV部分效力評(píng)價(jià) 用豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)混合疫苗免疫組和CSF活疫苗免疫組(第3組和第6組)試驗(yàn)豬免疫前、免疫后2、4、6、8周血清中的CSFV抗體，結(jié)果如圖1所示，混合疫苗免疫組免疫后2～8周CSFV抗體水平略高于CSF活疫苗免疫組，2個(gè)疫苗免疫組免疫后4、6、8周CSFV抗體水平存在顯著差異(P<0.05)。用細(xì)胞中和試驗(yàn)法檢測(cè)血清中CSFV中和抗體，結(jié)果2個(gè)組疫苗免后2、4、6、8周血清中CSFV中和抗體效價(jià)均差異不顯著(P<0.05)，見表3。

表3 2種疫苗免疫仔豬后不同時(shí)間CSFV中和抗體檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection of CSFV neutralizing antibody in piglets immunized with two vaccines at different time points

圖1 2種疫苗免疫仔豬后不同時(shí)間CSFV ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of CSFV ELISA antibody in piglets immunized with two vaccines at different time points*：P<0.05

3 討論

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化程度的發(fā)展，我國的生豬養(yǎng)殖企業(yè)不論在飼養(yǎng)管理還是疫病防控方面都取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但與此同時(shí)還存在一個(gè)棘手的問題——我國豬群疫病繁雜，免疫疫苗種類多，這不僅加重了養(yǎng)殖場(chǎng)的勞動(dòng)負(fù)擔(dān)，多次免疫刺激還增加了豬群應(yīng)激反應(yīng)的概率。因此，如何在原有免疫程序基礎(chǔ)上減少免疫次數(shù)且不影響疫苗免疫效果成為當(dāng)務(wù)之急。為此，已有部分養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了不同疫苗混合免疫的嘗試。

不同疫苗進(jìn)行混合免疫不僅要求免疫途徑一致、免疫時(shí)間相近，還需要考慮疫苗佐劑、滅活劑等諸多因素。不同佐劑系統(tǒng)的滅活疫苗相混可能會(huì)出現(xiàn)分層、破乳等情況，必然會(huì)對(duì)疫苗的免疫效果造成影響。滅活疫苗與活疫苗混合使用時(shí)要求滅活疫苗不能為以油為連續(xù)相的佐劑系統(tǒng)，且滅活疫苗的pH適宜活疫苗抗原的存活，滅活劑殘留足夠低，對(duì)活疫苗抗原無殺滅作用?？紤]到以上各種因素之后，不同疫苗混合免疫后是否會(huì)相互干擾還需在靶動(dòng)物上進(jìn)行效力評(píng)價(jià)。

豬瘟和副豬嗜血桿菌病是臨床豬場(chǎng)2種常見傳染病，臨床上這2種疫苗免疫時(shí)間接近，首免均在21～28日齡左右。本試驗(yàn)用商品化水性佐劑副豬滅活疫苗作為稀釋液稀釋豬瘟活疫苗制成混合疫苗，室溫條件下放置2 h，豬瘟病毒含量未見下降，說明副豬滅活疫苗對(duì)豬瘟病毒無殺滅作用。用HPS、CSF混合疫苗免疫仔豬，并進(jìn)行HPS 4型、HPS 5型強(qiáng)毒株攻毒，保護(hù)效果與單純免疫副豬滅活疫苗無明顯差異。監(jiān)測(cè)混合疫苗免疫后試驗(yàn)豬血清中CSFV ELISA抗體和中和抗體，結(jié)果顯示，2個(gè)疫苗免疫組免后2～8周CSFV中和抗體滴度差異不顯著，而混合疫苗免疫組CSFV ELISA抗體還略高于單純豬瘟活疫苗免疫組，這可能與副豬滅活疫苗中佐劑成分對(duì)豬瘟活疫苗的免疫效果起到了促進(jìn)作用有關(guān)。綜上所述，本試驗(yàn)中所用副豬嗜血桿菌滅活疫苗和豬瘟活疫苗可以混合后進(jìn)行一次性注射，達(dá)到“一針兩防”的效果，為臨床中簡(jiǎn)化這2種疫苗的免疫程序提供理論參考。