王冠賢，李寶林，唐愛民，黃永湘

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最普遍的變性關節(jié)疾病之一，以關節(jié)軟骨降解為特征[1-2]。在OA發(fā)病期間，軟骨細胞激活了促炎細胞因子，例如白介素-1β(IL-1β)，它可以刺激基質金屬蛋白酶(MMPs)和聚集蛋白聚糖酶(一種整合素樣和金屬蛋白酶與血小板反應蛋白，ADAMTS)的表達[3]。這些與基質降解相關的蛋白水解酶促成細胞外基質(ECM)的降解和軟骨的破壞，并最終加劇了OA的病理過程[4]。結締組織生長因子(CTGF)是一種富含半胱氨酸的分泌蛋白，在多種組織中作為轉化生長因子-β1(TGF-β1)的下游介質發(fā)揮作用[5]。在關節(jié)炎中觀察到CTGF的上調，由TGF-β1介導的CTGF參與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)展，抑制CTGF會減弱IL-1β介導的膝骨OA模型炎性反應[6-7]。山茱萸總甙是山茱萸果實提取物，中醫(yī)認為其具有補肝腎、澀精氣、固虛脫的功效，其可治療腰膝酸痛、眩暈、耳鳴、陽痿、遺精、小便頻數(shù)，肝虛寒熱，虛汗不止，心搖脈散[8]。有研究顯示，山茱萸總甙可促進成骨方向的骨代謝轉變，提高骨密度，防治骨質疏松[9]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸總甙具有明顯抗炎作用[10]。但山茱萸總甙對OA的影響和作用機制尚未有研究。本研究擬基于TGF-β1/CTGF信號通路觀察山茱萸總甙對人骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖和凋亡的影響，為OA的治療提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試藥試劑：山茱萸總甙(原料藥，純度98%，成都嘉葉生物科技有限公司生產(chǎn))；羅非昔布(原料藥，純度99%，杭州甫洛生物科技有限公司生產(chǎn))；青霉素、紅霉素(美國Sigma公司生產(chǎn))；重組人IL-1β(生工生物工程上海股份有限公司生產(chǎn))；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(上海傳秋生物科技有限公司生產(chǎn))；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所生產(chǎn))；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海復申生物科技有限公司生產(chǎn))；RNAisoPlus試劑(寶日醫(yī)生物技術北京有限公司生產(chǎn))；逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司生產(chǎn))；SYBR Premix Ex TaqⅡ實時熒光定量PCR試劑盒(武漢優(yōu)博生物技術有限公司生產(chǎn))；RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司生產(chǎn))；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海登寧科技有限公司生產(chǎn))；TGF-β1、CTGF單克隆抗體(上海聯(lián)邁生物工程有限公司生產(chǎn))；β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn))；鼠抗人二抗(青島捷世康生物科技有限公司生產(chǎn))。(2)儀器設備：ICX41型倒置顯微鏡(舜宇光學科技有限公司生產(chǎn))；MB16-414型酶標儀(上海皓莊儀器有限公司生產(chǎn))；FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司生產(chǎn))；Mx3005P型實時熒光定量PCR儀(安捷倫科技中國有限公司生產(chǎn))；E-Gel Imager型凝膠成像系統(tǒng)(美國Invitrogen公司生產(chǎn))。

1.2 實驗方法 2020年4—5月于海南省儋州市人民醫(yī)院實驗室進行實驗。

1.2.1 OA細胞培養(yǎng)：將本院OA患者進行膝關節(jié)置換術的軟骨組織使用胰酶消化成細胞懸液，而后加入含10% FBS、200 U/ml青霉素、100 U/ml紅霉素的DMEM培養(yǎng)基。用IL-1β受體處理軟骨細胞建立OA細胞模型。OA細胞達到70%融合率，將培養(yǎng)基換成含0.5%FBS和含有抗生素的DMEM，并加入重組人IL-1β，作用時間24 h以模擬OA軟骨細胞。在24 h后更換營養(yǎng)液，然后每3天更換一次營養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長直至細胞匯合達到85%后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 分組用藥：OA軟骨細胞根據(jù)給藥不同分為4組，OA軟骨細胞組不做任何處理；山茱萸總甙低、高劑量組分別加入山茱萸總甙，濃度分別為200、400 μg/ml(預試驗求出山茱萸總甙對OA軟骨細胞ED50為800 μg/ml，以1/4、1/2 ED50為低、高劑量水平)；羅非昔布組加入羅非昔布200 μg/ml[11]。每組細胞設6個復孔，再培養(yǎng)72 h。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 OA軟骨細胞活力檢測：將培養(yǎng)結束的細胞接種在96孔板中(1×104個細胞/孔)，孵育24 h直至細胞黏附。然后移除培養(yǎng)基，并用含有DMSO作為載體對照的新鮮培養(yǎng)基代替，并將細胞再孵育48 h。向每個孔中加入MTT 20 μl，并將混合物在37℃、5%CO2環(huán)境下溫育4 h。而后小心除去培養(yǎng)基，并加入DMSO 150 μl 以溶解由活細胞從MTT產(chǎn)生的甲基紫。使用酶標儀在490 nm下讀取光密度(OD值)。細胞存活率=(實驗組OD值-蒸餾水調零組OD值)/(OA軟骨細胞組OD值-蒸餾水調零組OD值)×100%。

1.3.2 OA軟骨細胞群落數(shù)測定：選擇處于指數(shù)生長期的細胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，用梯度因子進一步稀釋細胞懸浮液，將約500個細胞加入培養(yǎng)皿中，在37℃下培養(yǎng)2～3周直至出現(xiàn)可見的群落，用PBS輕輕洗滌培養(yǎng)皿2次，將群落用5 ml甲醇固定15 min，用吉姆薩染色10～30 min然后計數(shù)。

1.3.3 OA軟骨細胞凋亡水平測定：細胞培養(yǎng)結束后，將細胞用DMSO刺激48 h，然后收集進行分析。使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒在流式細胞儀上分析細胞凋亡。

1.3.4 OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA水平測定：使用RNAiso Plus分離細胞總RNA，再進行逆轉錄反應合成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒在實時熒光定量PCR儀上進行反應。反應條件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，62℃ 40 s，72℃ 20 s，最后在72℃延伸5 min。將TGF-β1、CTGF表達標準化為內參基因U6。各引物序列：TGF-β1正向5’-TGGACTGACAACTACGTACT-3’和反向5’-GGTTAAAACTGAATGGTAGTGAC-3’；CTGF正向5’-CGTACTTCAGTGCATGACGAA-3’和反向5’-TGACGTGGTCGTACGT-3’；U6正向5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’和反向5’-TGACGTAATCGGTAGTGTAC-3’。引物均由北京普利萊基因技術有限公司合成。2-△△Ct算法定量評估TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量。

1.3.5 OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白水平測定：細胞培養(yǎng)結束后，將細胞用冷PBS洗滌3次，并在裂解液中溶解。處理30 min后，收集上清液，并通過Bradford試劑盒對蛋白濃度進行定量。將40 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移至PVDF膜。將膜用封閉緩沖液封閉1.5 h，然后與TGF-β1、CTGF、β-actin一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃ 下孵育過夜,加入鼠抗人二抗(1∶5 000稀釋)，使用凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶；蛋白質水平的半定量分析被標準化為β-actin水平。

2 結 果

2.1 各組OA軟骨細胞OD值、存活率比較 與OA軟骨細胞組比較，羅非昔布組及山茱萸總甙低、高劑量組OD值、存活率明顯升高(P<0.05)；與羅非昔布組比較，山茱萸總甙低劑量組OD值、存活率明顯降低(q/P=8.954/0.000、8.321/0.000)，山茱萸總甙高劑量組OD值、存活率無明顯變化(P>0.05)；且山茱萸總甙高劑量組OD值、存活率高于山茱萸總甙低劑量組(q/P=10.654/0.000、8.324/0.000)，見表1。

表1 各組OA軟骨細胞OD值、存活率比較

2.2 各組OA軟骨細胞群落數(shù)比較 與OA軟骨細胞組群落數(shù)[(250.74±36.35)個]比較，羅非昔布組[(583.63±25.84)個]、山茱萸總甙低劑量組[(384.36±36.72)個]、高劑量組[(593.61±35.69)個]群落數(shù)明顯升高(F/P=156.632/0.000)；與羅非昔布組比較，山茱萸總甙低劑量組群落數(shù)明顯降低(q/P=149.651/0.000)，山茱萸總甙高劑量組群落數(shù)無明顯變化(P>0.05)；且山茱萸總甙高劑量組群落數(shù)高于山茱萸總甙低劑量組(q/P=89.695/0.000)。

2.3 各組OA軟骨細胞凋亡率比較 與OA軟骨細胞組[(9.29±0.42)%]比較，羅非昔布組[(3.00±0.39)%]、山茱萸總甙低劑量組[(7.89±0.42)%]、高劑量組[(3.00±0.29)%]凋亡率均降低(F/P=54.236/0.000)；與羅非昔布組比較，山茱萸總甙低劑量組凋亡率明顯升高(q/P=23.458/0.000)，山茱萸總甙高劑量組凋亡率無明顯變化(P>0.05)；且山茱萸總甙高劑量組凋亡率低于山茱萸總甙低劑量組(q/P=38.419/0.000)。

2.4 各組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA表達水平比較 與OA軟骨細胞組比較，羅非昔布組及山茱萸總甙低、高劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA表達水平明顯降低(F/P=36.214/0.000、39.365/0.000)；與羅非昔布組比較，山茱萸總甙低劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA表達水平明顯升高(q/P=8.654/0.000、14.548/0.000)，山茱萸總甙高劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA表達水平無明顯變化(P>0.05)；且山茱萸總甙高劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA表達水平低于山茱萸總甙低劑量組(q/P=16.874/0.000、25.654/0.000)，見表2、圖1。

表2 各組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA表達水平比較

2.5 各組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達水平比較 與OA軟骨細胞組比較，羅非昔布組及山茱萸總甙低、高劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達水平均降低(F/P=19.541/0.000、23.547/0.000)；與羅非昔布組比較，山茱萸總甙低劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達水平明顯升高(q/P=15.458/0.000、22.154/0.000)，山茱萸總甙高劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達水平無明顯變化>(P>0.05)；且山茱萸總甙高劑量組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達水平低于山茱萸總甙低劑量組(q/P=19.545/0.000、26.524/0.000)，見圖2、表3。

注：A.OA軟骨細胞組；B.羅非昔布組；C.山茱萸總甙低劑量組；D.山茱萸總甙高劑量組

表3 各組OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF蛋白表達水平比較

圖2 各組OA軟骨細胞凋亡率比較

3 討 論

山茱萸總甙為山茱萸科植物山茱萸的果實提取物。山茱萸總甙可抑制致炎劑引起的大鼠足墊腫脹[12]，此外，山茱萸總甙可抑制心肌梗死大鼠心肌炎性因子，進而改善其心臟功能[13]。本研究中，羅非昔布組及山茱萸總甙低、高劑量組OD值、存活率、群落數(shù)明顯高于OA軟骨細胞組；山茱萸總甙高劑量組OD值、存活率、群落數(shù)高于山茱萸總甙低劑量組，說明山茱萸總甙對人骨關節(jié)炎軟骨細胞具有抗炎促增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸總甙可抑制軟骨細胞凋亡，軟骨細胞的凋亡主要是由線粒體和外部途徑引起的，山茱萸總甙可阻斷這兩種途徑，從而抑制軟骨細胞凋亡和軟骨基質降解[14]。山茱萸總甙可抑制內質網(wǎng)應激進而抑制大鼠軟骨細胞凋亡，并降低關節(jié)軟骨中軟骨聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原等細胞外基質蛋白的mRNA表達[15]。而本研究中，羅非昔布組及山茱萸總甙低、高劑量組凋亡率明顯低于OA軟骨細胞組；山茱萸總甙高劑量組凋亡率低于山茱萸總甙低劑量組。這與上述討論一致，同時說明山茱萸總甙能明顯抑制人骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡。

TGF-β1在生長發(fā)育過程中對關節(jié)軟骨的形成起著關鍵作用，它可以刺激軟骨細胞合成和分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的過表達與蛋白聚糖的降解密切相關，從而導致OA的發(fā)生。據(jù)報道[18]，TGF-β1受體抑制劑sB-505124可以顯著降低前交叉韌帶(ACL)誘導的OA小鼠中與軟骨退化相關的標志物，包括MMP-9和MMP-13，提示骨增生中TGF-β1水平的升高可加重OA的發(fā)展，而軟骨下TGF-β1表達的下調可改善軟骨降解。此外研究表明，抑制關節(jié)軟骨細胞中TGF-β1信號傳導可降低OA大鼠的軟骨降解[19-20]。已證明TGF-β1可通過阻斷細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的活性來誘導多種癌細胞的凋亡，而抑制TGF-β1則可逆轉軟骨細胞生長的抑制作用和凋亡誘導作用[21]。研究報道，CTGF是重要的下游調節(jié)劑，并且在各種組織中還充當TGF-β1的下游效應分子[22]。同時，TGF-β1發(fā)揮某些依賴CTGF的生物學功能，包括促進細胞增殖和ECM合成，CTGF在響應軟骨損傷的TGF-β1激活中起著重要作用。據(jù)報道，CTGF已被證明可以通過增強p38的活化作用，來增強滑膜炎的強度和持續(xù)性抑制OA中分解代謝因子的表達[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸總甙明顯抑制人OA軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白的表達，且山茱萸總甙高劑量組的效果與臨床經(jīng)典藥物羅非昔布相似。表明山茱萸總甙可能通過抑制TGF-β1和CTGF的表達，進而影響軟骨細胞增殖過程所需的TGF-β1激活及CTGF響應作用；同時CTGF表達受抑制，其通過增強p38的活化作用來增強炎性反應的強度，進而可影響人骨關節(jié)炎軟骨細胞的生物學功能。

綜上所述，山茱萸總甙能明顯促進人骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖，抑制其凋亡；其機制與山茱萸總甙抑制人骨關節(jié)炎軟骨細胞TGF-β1、CTGF mRNA和蛋白的表達，進而抑制TGF-β1/CTGF信號通路的激活有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王冠賢：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；李寶林：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；唐愛民：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；黃永湘：進行統(tǒng)計學分析