張彩靈黃贊松13

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；3. 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 百色 533000)

在全球范圍內(nèi)，原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌) 在腫瘤死亡率中排名第3位[1]，而在我國(guó)，肝癌死亡率在主要惡性腫瘤中排名第2位，僅次于肺癌[2]。盡管近幾年來(lái)肝癌的預(yù)防、檢測(cè)和治療方面取得了顯著進(jìn)展，但由于肝癌早期無(wú)明顯癥狀，導(dǎo)致診斷時(shí)已處于晚期，治療效果差，預(yù)后欠佳[3-4]。肝癌作為一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其組織血供豐富，因此抗肝癌血管生成的治療具有重大意義。

苦參素是從豆科植物苦參、苦豆子、山豆根中提取的一種生物活性成分，以氧化苦參堿為主，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移、抑制腫瘤血管生成等抗腫瘤特性，通過(guò)多種不同作用機(jī)制它也可以發(fā)揮一定的抗肝癌作用[5-6]。轉(zhuǎn)錄因子E26轉(zhuǎn)化特異性序列1(E26 transformation-specific sequence 1，Ets-1)是一種54 kDa的核蛋白，是內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控因子，研究表明[7]VEGF可以通過(guò)刺激Ets-1的乙?；瘉?lái)刺激RNA聚合酶Ⅱ暫停釋放以驅(qū)動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)[8]通過(guò)上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的Ets-1轉(zhuǎn)錄來(lái)提高 VEGFR1表達(dá)，可能抑制 VEGFR2介導(dǎo)的促血管生成反應(yīng)，但大量證據(jù)表明[9]Ets-1在腫瘤細(xì)胞及腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增高。腫瘤血管生成歷經(jīng)血管內(nèi)皮基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移等過(guò)程，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，目前對(duì)于苦參素如何抑制腫瘤血管生成的作用及機(jī)制仍不十分明確。本研究通過(guò)肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基將HUVEC誘導(dǎo)形成腫瘤源性內(nèi)皮細(xì)胞(tumor-derived endothelial cells，Td-EC)，觀察苦參素對(duì)Td-EC增殖、遷移及血管形成等腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及Ets-1表達(dá)的影響，探討其作用的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，人肝癌HepG2細(xì)胞由右江民族醫(yī)學(xué)院廖長(zhǎng)秀博士惠贈(zèng)，苦參素注射液購(gòu)自鄭州卓峰制藥有限公司(批號(hào)：國(guó)號(hào)準(zhǔn)字H20033744，規(guī)格：2 ml，0.2 g×10支/盒)，胎牛血清購(gòu)自Gemini公司(批號(hào)：A24G00J)，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(批號(hào)：8119272)，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基ECM(包含500ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基、25 ml胎牛血清、5 ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑、5 ml青霉素/鏈霉素溶液)購(gòu)自Sciencell公司(批號(hào)：No.28094)，CCK-8試劑盒購(gòu)自MCE公司(批號(hào)：No.42830)，Matrigel Basement Membrane Matrix(基質(zhì)膠)購(gòu)自BD公司(貨號(hào)：356234，批號(hào)：9246010)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、二甲基亞砜購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green○RPremix Ex TaqTM試劑盒及引物購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC采用含5%胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑(ECGS)的ECM培養(yǎng)，置于37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)可進(jìn)行傳代，每2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。HepG2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，更換為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液，1000 r/min離心5 min，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，并在-80℃下儲(chǔ)存作為條件培養(yǎng)基。將HUVEC與含有50%HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基一起培養(yǎng)48 h，以變成Td-EC，檢測(cè)腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物1(TEM1)和腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物8(TEM8)來(lái)驗(yàn)證Td-EC的身份，可以有助于與HUVEC區(qū)分[10]。通過(guò)檢測(cè)TEM1、TEM8的表達(dá)升高確認(rèn)HUVEC已向Td-EC轉(zhuǎn)變，表明Td-EC細(xì)胞模型成功，應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)苦參素對(duì)Td-EC的抑制作用 收集Td-EC，胰酶消化重懸成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/毫升，100微升/孔接種于96孔板中。設(shè)實(shí)驗(yàn)組(苦參素組)、陰性對(duì)照組(含等量完全培養(yǎng)基)、空白對(duì)照組(只含完全培養(yǎng)基，不含苦參素、細(xì)胞)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。預(yù)培養(yǎng)24 h后，棄舊培養(yǎng)基，分別向?qū)嶒?yàn)組加入含苦參素濃度為0.375 mg/ml、0.75 mg/ml、1.5 mg/ml、3 mg/ml、6 mg/ml的完全培養(yǎng)基，100微升/孔；向陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每組分別加入10微升/孔CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處各組吸光度值(A值)，計(jì)算苦參素對(duì)細(xì)胞作用24 h后的抑制率。實(shí)驗(yàn)非同日重復(fù)3次。計(jì)算公式：抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)-(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)]×100%。選擇半數(shù)抑制率(50% inhibitory concentration，IC50)的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)苦參素對(duì)Td-EC遷移的影響 在6孔板孔底部背面畫5條平行的直線做標(biāo)記。胰酶消化HUVEC重懸成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×104個(gè)/毫升，2毫升/孔接種到6孔板中，誘導(dǎo)HUVEC變成Td-EC后當(dāng)細(xì)胞密度至80%～90%時(shí)，用無(wú)菌的10 μl槍頭垂直所畫標(biāo)記直線方向在每孔內(nèi)劃2條痕。用無(wú)血清的ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕洗2遍。實(shí)驗(yàn)分為2組，實(shí)驗(yàn)組加入含IC50濃度(經(jīng)計(jì)算為3.5 mg/ml)苦參素的低血清濃度培養(yǎng)基(含0.5%胎牛血清、含50%HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基)，陰性對(duì)照組加入等量低血清濃度培養(yǎng)基，于不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、24 h)在劃痕的同一位置觀察拍照，每孔隨機(jī)4個(gè)拍照點(diǎn)，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)非同日重復(fù)3次。用Image J軟件統(tǒng)計(jì)劃痕面積，計(jì)算各組細(xì)胞劃痕愈合率。計(jì)算公式：劃痕愈合率(%)=(0 h的劃痕面積-24 h的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.2.4 體外血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)苦參素對(duì)Td-EC管形成的影響 取預(yù)冷的融解基質(zhì)膠50微升/孔均勻涂布96孔板，置于37℃培養(yǎng)箱中1 h。實(shí)驗(yàn)組分為2組，實(shí)驗(yàn)組加入含IC50濃度(經(jīng)計(jì)算為3.5 mg/ml)苦參素的ECM，陰性對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，胰酶消化Td-EC后用對(duì)應(yīng)組別的培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 2×105個(gè)/毫升，100微升/孔接種于基質(zhì)膠表面。于不同時(shí)間點(diǎn)(3 h、24 h)用倒置顯微鏡觀察每孔管形成變化，每孔隨機(jī)4個(gè)拍照點(diǎn)，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)非同日重復(fù)3次。用Image J軟件統(tǒng)計(jì)管形成的數(shù)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR，real-time qRT-PCR)檢測(cè)Ets-1 mRNA的表達(dá) 設(shè)HUVEC組、Td-EC組，同時(shí)將Td-EC作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為2組，實(shí)驗(yàn)組加入含IC50濃度(經(jīng)計(jì)算為3.5mg/ml)苦參素的ECM，陰性對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。藥物干預(yù)24 h后，采用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書制備cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。Ets-1引物序列：上游引物5′-GTCATTCCTGCTGCTGCCCTA-3′，下游引物 5′-AGTTTGAATTCCCAGCCATCTCC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度137 bp，TEM1引物序列：上游引物 5′-GTGGACACAGATGAGTGCCAGA-3′，下游引物 5′-CCCTCGCTACAATAACACTCGAAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度89 bp，TEM8引物序列：上游引物 5′-CAAGATGCCGGAGCAGGAATA-3′，下游引物 5′-AGGACCCACAAGGCATCGAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp，GAPDH引物序列：上游引物 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；PCR反應(yīng) 95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值)-(對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦參素對(duì)Td-EC增殖的影響 苦參素作用Td-EC 24 h后，各組A值總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.49，P<0.05)，各濃度苦參素組對(duì)Td-EC增殖均有不同程度抑制作用，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。作用24 h的IC50為(3.58±0.37) mg/ml，故選擇3.5 mg/ml的苦參素濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件。

表1 不同濃度苦參素作用Td-EC 24 h后A值及細(xì)胞抑制率 (n=12)

2.2 苦參素對(duì)Td-EC遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，3.5 mg/ml濃度的苦參素作用Td-EC 24 h后劃痕愈合率明顯下降，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.656，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

2.3 苦參素對(duì)Td-EC管形成的影響 體外血管形成實(shí)驗(yàn)顯示，Td-EC在3 h后逐漸出現(xiàn)管形成，3.5 mg/ml濃度的苦參素作用Td-EC 3 h后管形成數(shù)量與陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.781，P=0.479)，3.5 mg/ml濃度的苦參素作用Td-EC 24 h后的管形成數(shù)量明顯減少，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.276，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 苦參素對(duì)Td-EC遷移能力的影響 (×40)

注：與陰性對(duì)照組比較，b：P<0.05。

2.4 Ets-1、TEM1、TEM8在Td-EC中的表達(dá)水平及苦參素對(duì)Td-EC中Ets-1 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR顯示，Ets-1在Td-EC中的相對(duì)表達(dá)量增高，與HUVEC相比，Ets-1 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.556，P<0.05)，見(jiàn)圖3A。同時(shí)3.5 mg/ml濃度的苦參素對(duì)Td-EC中Ets-1 mRNA的表達(dá)有抑制作用，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.960，P=0.001)，見(jiàn)圖3B。與HUVEC相比，TEM1、TEM8在Td-EC中的相對(duì)表達(dá)量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3C、3D。

圖3 各組細(xì)胞Ets-1、TEM1、TEM8 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

腫瘤可以誘導(dǎo)血管生成，腫瘤血管可以為腫瘤組織輸送氧氣及營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)代謝等，以利于腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，Td-EC是腫瘤血管生成的重要參與者，但Td-EC的分離應(yīng)用研究仍存在困難[11]。大量研究表明，通過(guò)條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)、三維細(xì)胞共培養(yǎng)等體外共培養(yǎng)模式，可以構(gòu)建與肝癌[10]、肺癌[12]、乳腺癌[13]等多種腫瘤相關(guān)的Td-EC。肝癌是一種血管高度異質(zhì)性的實(shí)體腫瘤，血管生成模式多樣，機(jī)制復(fù)雜，使得抗肝癌血管生成治療效果欠佳[14]。目前苦參素作用肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞方面的研究少有報(bào)道，本研究通過(guò)構(gòu)建肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)體系以了解苦參素有無(wú)抗肝癌血管生成作用奠定基礎(chǔ)。Croix BS等[15]采用基因序列分析表達(dá)技術(shù)比較來(lái)源正常和惡性結(jié)直腸組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的基因(TEM1-TEM9)，并命名為腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物(tumor endothelial markers，TEM)。其中腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物1(TEM1，又稱內(nèi)皮唾液酸蛋白)是由757個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物8(TEM8，又稱炭疽毒素受體-1)是由564個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，已有研究表明，它們?cè)谡＝M織及其血管中不表達(dá)或少量表達(dá)，但在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，TEM1、TEM8高表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有腫瘤特異性[10，16-17]。本實(shí)驗(yàn)qRT-PCR結(jié)果顯示，與HUVEC相比，Td-EC中TEM1及TEM8 mRNA表達(dá)量明顯增高，從基因表達(dá)水平上驗(yàn)證了在HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用下HUVEC向Td-EC的轉(zhuǎn)變。

苦參素能影響腫瘤的血管生成，有研究發(fā)現(xiàn)，苦參素可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可能通過(guò)抑制MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)抑制肺腺癌A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVECs增殖與遷移，同時(shí)其聯(lián)合化療藥物對(duì)肝癌、胃癌等移植瘤的血管生成有協(xié)同抗血管生成作用[12，18-20]。本研究結(jié)果顯示，Td-EC增殖的抑制作用隨著苦參素作用濃度增加而增強(qiáng)，同時(shí)，經(jīng)IC50濃度苦參素作用24 h后的Td-EC與對(duì)照組相比，細(xì)胞遷移能力及小管形成能力明顯下降，說(shuō)明苦參素能抑制Td-EC的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及成管能力，這些數(shù)據(jù)表明苦參素可能有抗肝癌血管生成的作用，與前述文獻(xiàn)[12，18-20]中的研究結(jié)果是一致的。Ets轉(zhuǎn)錄因子家族是一類含有高度保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著機(jī)體許多正常發(fā)育及病理過(guò)程，在實(shí)體腫瘤中通過(guò)驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞自我更新、調(diào)節(jié)染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)等方式調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)，Ets-1是最早被發(fā)現(xiàn)的Ets轉(zhuǎn)錄因子，主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)節(jié)生理和病理?xiàng)l件下的血管生成[21]。有研究表明[22]Ets-1在非小細(xì)胞肺癌癌組織中過(guò)表達(dá)并且與腫瘤組織中的微血管密度呈正相關(guān)，它可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化以促進(jìn)腫瘤肝轉(zhuǎn)移。Furlan A等[13]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Ets-1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附而利于腫瘤毛細(xì)血管形成，并且內(nèi)皮細(xì)胞也通過(guò)募集腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)而誘發(fā)血管生成。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得的Td-EC中Ets-1 mRNA表達(dá)高于HUVEC，經(jīng)過(guò)苦參素作用后，Td-EC中Ets-1 mRNA表達(dá)降低，提示苦參素可能通過(guò)抑制Td-EC中Ets-1 mRNA的表達(dá)，從而抑制Td-EC的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及成管能力。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，HepG2細(xì)胞條件培養(yǎng)基能促使HUVEC向Td-EC轉(zhuǎn)變，苦參素能抑制Td-EC增殖、遷移及成管能力，其分子機(jī)制可能與抑制Ets-1 mRNA表達(dá)有關(guān)。