何嘉宇，高 銳，陳振宇，譚振宇，覃 銳，郗艷麗*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:a.公共衛(wèi)生學(xué)院；b.臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

熊果酸主要分布于女貞子、夏枯草、車前子、山楂、大棗和苦丁茶等植物中[1-2]。熊果酸能改善動脈粥樣硬化大鼠的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激[3]，緩解香煙引起的大鼠肺氣腫[4]，治療糖尿病小鼠的心肌病變[5]，抑制CCl4所致的小鼠肝組織出現(xiàn)損傷[6]。此外，熊果酸還能通過促進糖原合成酶激酶發(fā)生磷酸化而引起肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡[7]。熊果酸能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘發(fā)胃癌細(xì)胞MGC-803發(fā)生自噬[8]。沙棘中的熊果酸能對H22荷瘤小鼠的移植瘤起到抑制作用[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，熊果酸能顯著抑制人肺癌細(xì)胞PC9的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬[10]。表明熊果酸除了治療作用以外，還具有一定的毒性作用。但關(guān)于熊果酸的體內(nèi)毒性研究較少。本研究以連續(xù)28 d染毒的方法觀察熊果酸對ICR小鼠的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

熊果酸(上海麥克林生化科技有限公司)；尿素氮(urea，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)、膽固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)(南京建成生物工程研究所)；安穩(wěn)血糖試條(三諾生物傳感股份有限公司)。

Epoch多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek)；NIU科研級正置熒光顯微成像系(美國Nikon)；QUINITIX124-1CN電子天平(美國 塞多利斯)；石蠟切片機和組織包埋機(德國Leica)。

ICR小鼠，清潔級，18～22 g，雌雄各半，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，動物合格證號：SCXK(吉)-2018-0007。飼養(yǎng)于吉林醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心。基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，飼料購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(吉)-2015-0005。飼養(yǎng)條件：溫度18～22℃，濕度45～65 ℃，12 h明暗交替。所有實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物護理與使用指南》和《動物毒理學(xué)使用原則》進行，并經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：2018LW011)。

1.2 實驗分組和給藥

ICR小鼠50只，隨機分為5組，即空白對照組,溶劑對照組和熊果酸低、中、高劑量組(5、10和15 mg/kg)，每組10只。除空白對照組和溶劑對照組，各組均給予熊果酸混懸溶液(熊果酸溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配，超聲混勻)灌胃，連續(xù)28 d，1次/d，空白對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃，溶劑對照組給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。

1.3 觀察指標(biāo)

一般情況觀察:實驗期間，每天觀察并記錄動物的一般表現(xiàn)、行為、中毒表現(xiàn)和死亡情況。

臟/體比:末次給藥后禁食不禁水24 h，稱量小鼠體重后眼球取血處死，并對所有動物進行大體肉眼觀察，處死動物后打開腹腔觀察內(nèi)臟形態(tài)，剝離臟器組織并用生理鹽水洗凈，濾紙蘸干后稱重，計算臟/體比值。

血液學(xué)指標(biāo)檢測:給予受試物28 d后，小鼠禁食不禁水24 h，眼球取血處死小鼠，留取血液測定血紅蛋白、紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及分類。

血清中BUN、Cr、TC、TG、ALT和AST和血糖的含量測定:留取血液，血糖儀測定血糖。剩余血液，3000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測各組血清中BUN、Cr、TC、TG、ALT和AST的含量。

病理組織學(xué)觀察:將組織于4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切皮備用，用于HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗，兩組間比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察

各組小鼠的生長發(fā)育、活動均正常，未發(fā)現(xiàn)中毒現(xiàn)象和死亡情況。

2.2 熊果酸對小鼠體重、增重、進食量和飲水量的影響

結(jié)果顯示：與對照組比較，受試樣品各劑量組小鼠初始體重、雌鼠每周進食量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與第1周比較，雄鼠第2周的進食量顯著增高，但第3周升高不顯著。隨著給藥時間的延長，各組雄性小鼠的飲水量逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與第1周比較，第2周和第3周低劑量雌性小鼠飲水量顯著升高，但中和高劑量組雌性小鼠飲水量顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖1。各組小鼠終末體重顯著低于初始體重(P<0.05)，總體重增加量呈現(xiàn)負(fù)數(shù)，總體動物體重呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能與灌胃的給藥方式有關(guān)。通過灌胃造成動物出現(xiàn)飽腹感，食物的攝入量減少，動物體重出現(xiàn)下降。此外，各劑量組的小鼠體重下降也比較明顯，熊果酸的給藥劑量越多，各劑量組小鼠的體重下降越明顯。見表1。

與空白對照組比較，*：P<0.05；與溶劑對照組比較，#：P<0.05；與第1周比較，&：P<0.05

表 1 各組小鼠體重增加量

2.3 熊果酸對小鼠臟/體比值的影響

打開腹腔觀察內(nèi)臟形態(tài)未見明顯改變，各組小鼠肝臟、腎臟、心臟、脾臟和肺臟臟/體比值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中劑量組雌性小鼠心臟絕對重量高于空白對照組、溶劑對照組、低和高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組雄性小鼠心臟絕對重量高于空白對照組、溶劑對照組、低劑量和中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。雌性小鼠中劑量組脾臟絕對重量顯著低于溶劑對照組(P<0.05)。雄性小鼠低劑量組脾臟絕對重量顯著高于空白對照組和溶劑對照組，中和高劑量組脾臟的絕對重量顯著低于低劑量組，低、中和高劑量組肺臟絕對重量顯著低于溶劑對照組(P<0.05)。各劑量組小鼠肝臟和腎臟絕對重量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 熊果酸對各組小鼠血液中血常規(guī)的影響

溶劑對照組各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。熊果酸低、中和高劑量組小鼠血常規(guī)指標(biāo)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 熊果酸對小鼠血清中BUN、Cr、TG、TC、AST和血糖的影響

結(jié)果顯示：各劑量組小鼠血清中的BUN、Cr、TG、TC、AST和血糖水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各劑量組雌性小鼠血清中ALT水平顯著低于對照組(P<0.05)，且隨著給藥劑量的增加，ALT的水平逐漸降低。熊果酸中和高劑量組雄性小鼠血清中ALT水平低于對照組和低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表 2 各組小鼠血清中BUN,Cr,TG,TC,ALT,AST和血糖的含量

2.6 病理檢查

各劑量組與對照組比較，肝臟、腎臟、脾臟、心臟、胃、十二指腸組織未見有意義的病理改變。

3 討 論

熊果酸是苦丁茶、酸棗、女貞子等植物中的化學(xué)物質(zhì)，具有較高的生物活性及潛在藥用價值。但對熊果酸的毒理學(xué)評價資料較少，根據(jù)前期熊果酸急性毒性實驗和預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)計本次毒性實驗。

對小鼠體重、進食量和飲水量的結(jié)果觀察顯示，各組動物生長發(fā)育、活動均正常，未出現(xiàn)中毒和死亡。隨著染毒周期的延長，雌性小鼠的飲水量和攝食量變化均不顯著；雄性小鼠飲水量變化不顯著，但進食量顯著升高。各劑量組小鼠終末體重顯著低于初始體重，雌性小鼠總體重增加量顯著低于空白對照組，雄性小鼠總體重增加量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示小鼠體重下降可能與熊果酸有減肥的作用有關(guān)，該作用對雌鼠的作用比較顯著，且這種減輕體重作用與劑量呈現(xiàn)依賴關(guān)系。

各劑量組小鼠臟/體比值結(jié)果顯示，各組小鼠臟/體比值差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義。各劑量組小鼠心臟的絕對重量與空白對照組比較有顯著差異，脾臟的絕對重量與溶劑對照組比較差異有顯著性，但這種差異變化沒有顯著的劑量-反應(yīng)關(guān)系，故不認(rèn)為是損傷效應(yīng)。熊果酸對受檢臟器組織病理方面無明顯損害。

熊果酸各劑量組小鼠血清中ALT水平隨給藥劑量的增加而逐漸降低，且比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，AST的水平也隨著熊果酸給藥劑量的增加而逐漸降低，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。血清中ALT和AST水平的變化呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，這提示熊果酸對肝臟組織有一定的保護作用。適當(dāng)攝入富含熊果酸的食物有益于改善肝臟功能。血清生化指標(biāo)中BUN、Cr、TG和TC的變化不顯著。各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較差異不顯著，表明熊果酸未誘發(fā)炎性反應(yīng)或凝血障礙。

綜上所述，熊果酸具有較好的減肥作用，且有益于肝臟的健康。熊果酸在(5～15)mg/(kg·bw)劑量范圍內(nèi)以經(jīng)口灌胃的方式攝入，未對ICR小鼠造成明顯的毒性效應(yīng)。此結(jié)果能為熊果酸亞慢性毒性提供毒理學(xué)基礎(chǔ)資料，為熊果酸作為中藥制劑的研發(fā)提供實驗依據(jù)。