姚鵬強(qiáng) 袁軼 程世平
摘要:為解決張良姜繁殖系數(shù)低、容易感染病菌的問(wèn)題,進(jìn)一步加快張良姜育種進(jìn)程,以河南省魯山縣張良鎮(zhèn)種姜為材料,首先建立張良姜莖尖離體培養(yǎng)再生體系,進(jìn)一步利用秋水仙堿對(duì)其體細(xì)胞染色體進(jìn)行誘導(dǎo)加倍。結(jié)果表明,張良姜莖尖不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 01 mg/L,不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.33%。不定芽生根的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L,生根率可達(dá)86.67%。張良姜同源四倍體誘導(dǎo)最佳處理組合為100 mg/L秋水仙堿浸泡莖尖72 h再接種培養(yǎng),四倍體最高誘導(dǎo)率為8.89%。對(duì)照組張良姜為二倍體(2n=2x=22),誘導(dǎo)獲得的四倍體張良姜染色體為2n=4x=44。共獲得7個(gè)四倍體植株,繼代培養(yǎng)3次后倍性保持穩(wěn)定,可為張良姜良種選育提供良好的原始材料。
關(guān)鍵詞:張良姜;離體培養(yǎng);染色體加倍;同源四倍體
中圖分類號(hào):S632.503 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2021)02-0104-04
收稿日期:2020-05-19
基金項(xiàng)目:平頂山學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(編號(hào):BXY-BSQD-2018031、PXY-BSQD2016009);河南省科技攻關(guān)計(jì)劃(編號(hào):182102110132、172102110111、)。
作者簡(jiǎn)介:姚鵬強(qiáng)(1986—),男,云南曲靖人,博士,講師,主要研究方向?yàn)橹参锒啾扼w遺傳育種。E-mail:yaopengqiang1988@163.com。
張良姜為姜科姜屬多年生草本植物[1-4],原產(chǎn)于河南省魯山縣張良鎮(zhèn),距今已有2 200多年的種植歷史。2010年5月,張良姜被授予國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù),是全國(guó)首個(gè)獲得農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù)的生姜產(chǎn)品,享有姜中之王的美譽(yù)[5],其色澤金黃、久煮不爛、辛辣芳香[6],是集調(diào)味品、食品加工原料、藥用于一體的多用途經(jīng)濟(jì)作物[7-9]。
長(zhǎng)期以來(lái),張良姜主要利用地下塊根進(jìn)行無(wú)性繁殖,伴隨一些病毒病菌經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降,并且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖會(huì)造成種性退化[10-11]。植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)是提高姜產(chǎn)量和品質(zhì)最為有效的方法之一[12-14]。因此,有必要通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有優(yōu)良張良姜進(jìn)行脫毒和復(fù)壯,提高品種自身抗逆性和增產(chǎn)潛力。
目前,張良姜育種還處于起步階段,其雌雄花敗育,常規(guī)雜交育種難以發(fā)揮作用。然而,在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,利用體細(xì)胞染色體加倍技術(shù)來(lái)獲取多倍體具有巨大的育種價(jià)值。許多研究表明,多倍體植物在育種方面具有生活能力強(qiáng)以及抗病蟲害等特點(diǎn)[15-18]。本研究以張良姜幼嫩芽為外植體,首先建立其離體培養(yǎng)再生體系,之后通過(guò)秋水仙堿誘導(dǎo)其體細(xì)胞染色體加倍,獲得張良姜同源四倍體。此研究旨在推動(dòng)張良姜產(chǎn)業(yè)發(fā)展,以期培育張良姜新品種。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
選擇健壯、無(wú)病的張良種姜為材料。試驗(yàn)在河南省平頂山學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院低山丘陵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,于2017年4月至2019年5月份進(jìn)行。
1.2初代培養(yǎng)基配制
初代培養(yǎng)基配制以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加不同濃度的NAA(萘乙酸)、6-BA(6-芐氨基嘌呤),具體激素組合見(jiàn)表1,處理編號(hào)依次記為M1~M4。所配制的4個(gè)培養(yǎng)基配方處理中蔗糖濃度為3%,瓊脂濃度為0.75%,pH值范圍為5.6~5.8。每個(gè)培養(yǎng)基配制30瓶。
1.3外植體消毒與接種
對(duì)張良姜種姜進(jìn)行催芽處理,將未發(fā)芽的姜塊放入鐵托盤,噴灑適量水,蓋上塑料膜,25 ℃下培養(yǎng)催芽。待芽長(zhǎng)出1 cm左右,用手術(shù)刀切取幼芽,首先用70%乙醇處理1 min,無(wú)菌水沖洗2~3次,再用0.1%氯化汞消毒12~15 min,無(wú)菌水沖洗3次,去除幼芽外層2~3層幼葉,將莖尖接種于培養(yǎng)基,每瓶接種1個(gè)外植體。放入培養(yǎng)室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,光照度為2 000~3 000 lx,培養(yǎng) 30 d 后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織及不定芽數(shù)量。
1.4生根培養(yǎng)
選取2~3 cm生長(zhǎng)狀態(tài)相同的單個(gè)叢生芽,分別接種于添加不同濃度6-BA(0.5、1.0 mg/L)或NAA(0.5、1.0 mg/L)以及不添加激素的9種生根培養(yǎng)基(K0~K8)中進(jìn)行生根培養(yǎng),20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。每個(gè)培養(yǎng)基接種1個(gè)芽,每種培養(yǎng)基接種15個(gè)叢生芽,重復(fù)3次。
1.5秋水仙堿誘導(dǎo)張良姜體細(xì)胞染色體加倍
分別配制濃度為50、100、150、200 mg/L的秋水仙堿溶液,用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。選取健壯的組培苗,將其頂芽及帶有側(cè)芽的莖段切下,分別放入不同濃度的秋水仙堿溶液中。黑暗環(huán)境下,在振蕩培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。之后用無(wú)菌水沖洗材料4~5次,用無(wú)菌濾紙將材料表面水分吸干,將材料接種到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每個(gè)處理組合重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)分5瓶,每瓶接種3個(gè)材料。20 d 后統(tǒng)計(jì)外植體存活率。
1.6倍性鑒定
取第3次繼代培養(yǎng)的幼苗嫩葉,利用流式細(xì)胞儀(sysmex partec GmbH)進(jìn)行檢測(cè),取幼嫩葉片約 1 cm2 大小放入一次性塑料皿中,加入200 μL細(xì)胞裂解液[希森美康生物科技(無(wú)錫)有限公司],然后用鋒利的刀片迅速將其切碎,30 μm孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾,加入800 μL DAPI染色液[希森美康生物科技(無(wú)錫)有限公司],以二倍體材料為內(nèi)參進(jìn)行倍性檢測(cè)。
之后,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的植株進(jìn)行染色體壓片計(jì)數(shù)進(jìn)一步確定倍性水平。以張良姜組培苗幼嫩根尖為材料。飽和對(duì)二氯苯中預(yù)處理3 h,經(jīng)蒸餾水沖洗后,置于卡諾固定液(V無(wú)水乙醇 ∶V冰醋酸= 3 ∶1),4 ℃固定24 h。之后,將材料轉(zhuǎn)移到1 mol/L鹽酸溶液中酸解10~15 min,蒸餾水沖洗并浸泡 10 min。取少量材料置于載玻片上,滴加卡寶品紅染色液染色5 min,蓋上蓋玻片,壓片,置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。
2結(jié)果與分析
2.1初代培養(yǎng)基的篩選
不同初代培養(yǎng)基誘導(dǎo)張良姜不定芽效果如表2所示,在NAA濃度相同的情況下,添加不同濃度的6-BA進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo),其中,以M3組合最好,不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.3%,即張良姜莖尖再生較適合培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。
2.2不同培養(yǎng)基對(duì)張良姜生根的影響
由表3可以看出,在生根培養(yǎng)基中,生根效果最差的培養(yǎng)基為K0,即不添加植物激素的MS/2培養(yǎng)基,在添加NAA或IBA之后,各個(gè)處理的生根率都有不同程度的提高??傮w來(lái)看,NAA和IBA 2種激素在誘導(dǎo)生根效果方面存在一定差異。在相同濃度下,添加NAA比 IBA的生根效果更佳。其中,NAA的濃度為0.5 mg/L最適合叢生芽生根,生根率可達(dá)86.67%。因此,MS/2+NAA 0.5 mg/L為誘導(dǎo)張良姜叢生芽生根的最適培養(yǎng)基。
2.3張良姜同源四倍體誘導(dǎo)
對(duì)誘導(dǎo)獲得的張良姜植株進(jìn)行倍性鑒定。四倍體張良姜的峰值在橫坐標(biāo)上是內(nèi)參二倍體的2倍(圖1-a)。染色體壓片計(jì)數(shù)結(jié)果表明,未經(jīng)處理的二倍體張良姜染色體數(shù)為2n=2=22(圖1-b),誘導(dǎo)獲得的四倍體染色體數(shù)為2n=4x=44(圖1-c)。
不同濃度的秋水仙堿以及不同的處理時(shí)間對(duì)張良姜外植體存活率、不定芽的誘導(dǎo)率以及四倍體誘導(dǎo)率的影響結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明,外植體的存活數(shù)隨著秋水仙堿濃度的增加以及處理時(shí)間的增加而降低,秋水仙堿濃度在50~200 mg/L范圍,持續(xù)處理時(shí)間在96 h內(nèi),均有不定芽的產(chǎn)生。當(dāng)秋水仙堿濃度為100 mg/L、處理72 h時(shí),誘導(dǎo)獲得張良姜同源四倍體4個(gè),是本試驗(yàn)篩選的最優(yōu)處理組合。
3討論與結(jié)論
利用組培技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)張良姜脫毒種苗的快速繁殖。一些研究表明,NAA和6-BA的組合能夠更好地促進(jìn)生姜幼芽的分化和增殖[19-20]??偟膩?lái)說(shuō),培養(yǎng)基中植物激素的成分和濃度對(duì)張良姜快繁有顯著的影響。通過(guò)試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),在NAA濃度相同的情況下,當(dāng)添加的6-BA濃度由0.5 mg/L逐漸增加到2.0 mg/L時(shí),不定芽的分化率增高,但當(dāng)6-BA濃度增加到3.0 mg/L時(shí),不定芽的分化率開始下降,出現(xiàn)了一定的畸形芽。齊蘭等在研究海南小黃姜脫毒快繁技術(shù)時(shí)也發(fā)現(xiàn),當(dāng)6-BA的濃度高于3 mg/L時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致畸形苗及弱苗的增多[21]。由此認(rèn)為,當(dāng)6-BA的濃度為2.0 mg/L時(shí),張良姜不定芽的誘導(dǎo)效果較好。
張良姜不定芽生根誘導(dǎo),其最適宜培養(yǎng)基為 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L,本試驗(yàn)中添加外源激素NAA和IBA均可誘導(dǎo)張良姜不定芽生根,其中添加NAA的效果好于添加IBA,與黃姜的根誘導(dǎo)情況[19]類似。在生姜的研究中,同時(shí)添加6-BA和NAA可以實(shí)現(xiàn)生姜增殖與生根誘導(dǎo)同步進(jìn)行,其中NAA對(duì)生根數(shù)和平均根長(zhǎng)有較大影響,6-BA對(duì)生姜生根數(shù)和長(zhǎng)度無(wú)顯著影響[11]。小黃姜的脫毒組培技術(shù)研究也表明,同時(shí)添加6-BA和NAA可使生根壯苗和繼代增殖同步完成[21-22]。而在本研究中,在所使用的初代培養(yǎng)基培養(yǎng)下,有部分不定芽有根的分化,生根率遠(yuǎn)低于加入NAA的生根培養(yǎng)基。因此,對(duì)于張良姜而言,將不定芽的誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)分別進(jìn)行效果更佳。
秋水仙堿是人工誘導(dǎo)植物多倍體最為常用的化學(xué)試劑之一,成功的關(guān)鍵在于秋水仙堿的處理濃度及處理時(shí)間[23-25]。在本研究中,以秋水仙堿濃度100 mg/L處理72 h效果最好,其次是150 mg/L處理72 h,較低的秋水仙堿濃度如50 mg/L并未獲得多倍體。而郭啟高等對(duì)生姜進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中加入30 mg/L秋水仙堿處理5 d可使生姜的誘變率達(dá)到65.0%[26]。說(shuō)明使用較低濃度秋水仙堿處理時(shí)須延長(zhǎng)處理時(shí)間方能發(fā)揮作用。另外,有效的藥劑濃度與誘導(dǎo)處理方式也有很大關(guān)系。利用秋水仙堿對(duì)姜芽進(jìn)行浸泡后再接種所使用的濃度通常比直接在培養(yǎng)基中加入進(jìn)行接種的濃度要高許多[26-27],如曾楊等對(duì)脫毒生姜進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)研究表明,0.2%秋水仙堿浸泡生姜芽12 h的誘導(dǎo)率最高[28]。通過(guò)對(duì)張良姜頂芽及帶有側(cè)芽的莖段進(jìn)行秋水仙堿處理誘導(dǎo)獲得同源四倍體植株,可為張良姜良種的選育提供原始材料,為后續(xù)篩選優(yōu)良品系奠定基礎(chǔ)。
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