郭文浩，房士琨，張玥，梁照鋒

(江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

胃癌是導致人類死亡的主要惡性腫瘤之一。我國胃癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第二位，已成為國民健康的重大威脅。香煙煙霧中含約70種致癌物及大量的自由基和過氧化物，可引起炎癥和致癌反應。長期香煙煙霧暴露是許多疾病的主要危險因素，且吸煙的數(shù)量和時間與發(fā)病率呈正比[1]。研究發(fā)現(xiàn)吸煙與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在很強的關(guān)聯(lián)性，但其機制并不清楚[2]。腫瘤干細胞具有干細胞特性，是腫瘤的起源細胞和驅(qū)動細胞，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)及耐藥等密切相關(guān)，在胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有決定性作用[3-4]。然而目前尚無吸煙與胃癌干細胞相關(guān)的研究報道。

近年來植物化學物在腫瘤的防治中頗受關(guān)注，其具有抗癌、防癌作用，且安全性高，在腫瘤等慢性病中的防治效應研究已成為重點研究領域之一。然而食源性的植物化學物在腫瘤干細胞的干預方面的研究鮮有報道。大蒜活性成分二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide, DATS)在胃癌、甲狀腺癌、肝癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有干預效應[5-6]，但其分子機制并不清楚。本研究觀察DATS對香煙煙霧懸液(cigarette smoke extract, CSE)增強的SGC-7901源胃癌干細胞干性的干預效應，并探討其作用機制，為DATS在胃癌防治中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、重組人表皮細胞生長因子 (recombinant human epidermal growth factor, rh-EGF)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombinant human fibroblast growth factor, rh-FGF)、B27(美國Gibco公司)；PMSF、RIPA(美國Invitrogen公司)，BCA試劑盒(碧云天公司)，PVDF 膜(德國Millipore 公司)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、OCT-4一抗(美國CST公司)，NANOG、LIN28、SOX2、GSK3β一抗(美國SAB公司)，GAPDH(美國Bioworld公司)。電泳儀(美國Bio-Rad 公司)，Ima-geQuant LAS4000mini 化學發(fā)光成像儀(日本GE 公司)，倒置式生物顯微鏡(日本 Nikon公司)，UltraSYBR混合物(康為世紀生物科技有限公司)，實時PCR檢測系統(tǒng)(CFX96，美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞系及細胞培養(yǎng)

人胃癌SGC-7901細胞株購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱。用含20 ng/mL rh-EGF、10 ng/mL rh-FGF、2% B27無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞7 d。根據(jù)細胞球的形成情況及干性基因的表達情況判斷干細胞是否培養(yǎng)成功。

1.3 香煙煙霧懸液的制備

本實驗所用香煙為國內(nèi)較為常見的香煙，其煙堿量為1.0 mg，焦油量為10.0 mg。將點燃的香煙用負壓驅(qū)動裝置連續(xù)抽吸，香煙煙霧溶于10 mL的RPMI-1640無血清培養(yǎng)基中，搖勻，5 min燃燒完，調(diào)節(jié)pH值至7.40，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，以此懸液為100%，按實驗所需稀釋使用，每日新鮮制備。

1.4 篩選適宜的DATS濃度

取對數(shù)生長期的SGC-7901源胃癌干細胞制成單細胞懸液，接種于24孔板中，4 000個/孔，用0%、0.25%、0.50%的CSE和5、10、20 μmol/L的DATS單獨或聯(lián)合連續(xù)處理7 d，每組設3個平行。溶劑對照用DMSO處理。每天更換含特定生長因子(20 ng/mL rh-EGF、20 ng/mL rh-FGF 和 2% B27)及處理因素的新鮮培養(yǎng)基。7 d后采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測其細胞活力，篩選適宜的DATS濃度。

1.5 顯微鏡觀察DATS對胃癌干細胞的干細胞球形成的影響

分別用0% CSE、0.25% CSE、0.25% CSE+10 μmol/L DATS、0.50% CSE和0.50% CSE+10 μmol/L DATS連續(xù)處理SGC-7901源胃癌干細胞7 d，每組設3個平行。每天更換含新鮮的CSE、10 μmol/L DATS和含特定生長因子(20 ng/mL rh-EGF、10 ng/mL rh-FGF和2% B27)的無血清培養(yǎng)基。7 d后顯微鏡下觀察胃癌干細胞球大小，并拍照和計數(shù)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡檢測胃癌干細胞基因和Wnt通路相關(guān)蛋白

用0%、0.25%和0.50% CSE，10 μmol/L DATS和20 μmol/L 氯化鋰(LiCl)單獨或聯(lián)合連續(xù)處理SGC-7901細胞來源的胃癌干細胞7 d，按照蛋白提取試劑盒的說明書提取總蛋白，測定蛋白濃度。12%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)。 將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上，在5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后與一抗β-catenin、OCT-4、NANOG、LIN28、SOX2、GSK3β (均1 ∶1 000)，GAPDH (1 ∶500)孵育過夜，1×TBST洗3次，羊抗兔二抗孵育1 h，1×TBST洗5次，化學發(fā)光分析儀進行檢測。

1.7 實時定量PCR檢測胃癌干細胞干性基因

收取各個處理組的胃癌干細胞，預冷的PBS洗2次，按照RNA提取試劑盒的說明書提取胃癌干細胞總RNA，并測定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用UltraSYBR混合物在實時PCR檢測系統(tǒng)上檢測NANOG、OCT-4、SOX2、LIN28、GAPDH的表達水平。PCR反應體系為：Mixture (UltraSYBR) 10 μL，無RNA酶水8 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。 PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，共進行36個循環(huán)。引物序列如下，NANOG：上游5′-GGAACGCCTCATCAATGC -3′，下游5′- TGTCAGCCTCAGGACTTGAGA -3′；OCT-4：上游 5′- AC-ACCAATCCCATCCACACT-3′，下游 5′- GCAAACTTCCTGCAAAGCTC-3′；SOX2：上游5′-TTGAGGCTCTGCAGCTTAG-3′，下游 5′-GCCGGTTACAGAACCACAC-3′；LIN28：上游5′-TCGGCTTCCTGTCTATGACC-3′，下游5′-GGAATCCATCCGTGTCACTG-3′；GAPDH：上游 5′-GCTGCCCAACGCACCGAATA-3′，下游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DATS能抑制CSE促進的胃癌干細胞自我更新能力

MTT實驗結(jié)果顯示，10 μmol/L DATS能顯著抑制CSE誘導的細胞增殖，為最適作用濃度(圖1)。0.25% CSE和0.50% CSE處理組的懸浮細胞球明顯大于0.25% CSE和0.50% CSE與DATS聯(lián)合處理組，表明DATS能抑制CSE促進的胃癌干細胞球的形成(圖2)。

①：0% CSE，②：DMSO，③：0.25% CSE，④：0.25% CSE+5 μmol/L DATS，⑤：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，⑥：0.25% CSE+20 μmol/L DATS，⑦：0.50% CSE，⑧：0.50% CSE+5 μmol/L DATS，⑨：0.50% CSE+10 μmol/L DATS，⑩：0.50% CSE+20 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.01，與0.25% CSE相比；c：P<0.01，與0.50% CSE相比

①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.05，與0.25% CSE相比；c：P<0.05，與0.50% CSE組相比

2.2 DATS能抑制CSE促進的胃癌干細胞干性基因的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，DATS能明顯抑制CSE促進的胃癌干細胞的干性基因NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28的mRNA水平(圖3A)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，DATS聯(lián)合處理能抑制CSE誘導的胃癌干細胞NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28蛋白表達水平的上調(diào)(圖3B)。

2.3 DATS抑制CSE促進的胃癌干細胞Wnt通路活性

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，DATS能抑制CSE導致的β-catenin、GSK3β蛋白表達異常，提示DATS能抑制CSE促進的SGC-7901源胃癌干細胞Wnt通路活性。見圖4。

A：qRT-PCR檢測胃癌干細胞干性基因的mRNA表達；B：蛋白質(zhì)印跡檢測胃癌干細胞干性基因的蛋白表達。①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.05，與0.25% CSE相比；c：P<0.05，d：P<0.01，與0.50% CSE相比

①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，與0% CSE相比；b：P<0.05，與0.25% CSE組相比，c：P<0.01，與0.50% CSE組相比

2.4 DATS調(diào)控Wnt通路抑制CSE增強的胃癌干細胞干性

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，DATS能顯著抑制CSE激活的Wnt通路和胃癌干細胞干性基因NANOG和OCT-4的mRNA和蛋白表達水平。氯化鋰和CSE聯(lián)合能進一步激活Wnt通路，而氯化鋰與DATS的聯(lián)合作用，使GSK3β蛋白表達水平上調(diào)，而β-catenin蛋白表達水平下調(diào)(圖5A)。同時氯化鋰能明顯上調(diào)胃癌干細胞干性基因NANOG和OCT-4的mRNA和蛋白表達水平，氯化鋰與DATS的聯(lián)合作用能部分減弱氯化鋰引起的NANOG和OCT-4的表達水平上調(diào)(圖5B，5C)。初步說明DATS能通過調(diào)控Wnt通路抑制CSE增強的胃癌干細胞干性。

A：蛋白質(zhì)印跡檢測Wnt通路活性改變；B：qRT-PCR檢測胃癌干細胞干性基因mRNA表達水平；C：蛋白質(zhì)印跡檢測胃癌干細胞干性基因蛋白表達水平。①：0% CSE，②：0.50% CSE，③：0.50% CSE+DATS，④：0.50% CSE+LiCl，⑤：0.50% CSE+DATS+LiCl。a：P<0.01，與0% CSE相比；b: P<0.01，與0.5%CSE相比；c: P<0.05，d： P<0.01，與0.5%CSE+LiCl組相比

3 討論

腫瘤干細胞是具有干細胞特性的細胞，最初已獲得致癌突變，具有自我更新和分化的可能性，從而負責整個腫瘤細胞群的產(chǎn)生及異質(zhì)性、耐藥性和侵襲性，在胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有決定性作用。研究表明，香煙煙霧能夠促進腫瘤干細胞的自我更新能力和干性基因的表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Qian等[7]發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧暴露能增強腎癌干細胞干性基因的表達，進而在腎癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Wang等[8]研究表明長期的香煙暴露會促進人支氣管上皮細胞干細胞樣特性的獲得，促進增殖與侵襲，抑制凋亡。Nimmakayala等[9]在細胞與動物實驗中證明，香煙煙霧會誘導胰腺癌細胞中的干細胞功能，從而進一步促進胰腺癌的發(fā)展。本研究的結(jié)果同樣證明了香煙煙霧能促進胃癌干細胞的自我更新能力，并且能增強胃癌干細胞干性基因NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28的表達水平，能夠增強胃癌干細胞的干性。

DATS是從大蒜、洋蔥等植物中提取的一種有機硫化合物，能通過提供硫自由基和巰基而發(fā)揮生物學作用，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種功能。研究發(fā)現(xiàn)，DATS在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有干預效應。 Tao等[10]研究結(jié)果顯示DATS對胃癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可以誘導其凋亡。Liu等[11]研究結(jié)果顯示DATS能下調(diào)乳腺癌多種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。Wnt信號通路在多種生理病理過程發(fā)揮作用，近年來發(fā)現(xiàn)其在維持腫瘤干細胞干性中具有非常重要作用。本研究結(jié)果顯示，DATS能夠干預香煙煙霧促進的胃癌干細胞的自我更新能力，抑制香煙煙霧促進的胃癌干細胞干性基因OCT-4、SOX2、NANOG和LIN28的表達水平，Wnt信號通路在其中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果初步顯示了DATS對香煙煙霧促進的胃癌干細胞干性的干預效應，進一步研究發(fā)現(xiàn)DATS可通過調(diào)控Wnt信號通路抑制胃癌干細胞的干性。然而，本研究并未在體內(nèi)實驗中探討DATS干預效應的分子機制，我們將在后續(xù)研究中加以探討，進一步提升DATS在胃癌等腫瘤防治中的價值。