黎 宙，陳 輝，周 斌

(1.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510515；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；3.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310022)

黃瓜是我國南方地區(qū)重要的蔬菜作物，生長期內(nèi)容易發(fā)生病蟲害。其在生產(chǎn)過程，常常使用大量農(nóng)藥、殺菌劑和除草劑進(jìn)行防治，不僅給生態(tài)環(huán)境帶來一定的破壞，而且嚴(yán)重威脅人們的健康[1-2]。大多數(shù)農(nóng)藥屬于劇毒類或高毒類農(nóng)藥，經(jīng)過食物鏈富集，在人體內(nèi)可導(dǎo)致急性或慢性中毒[3]。蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留問題，一直受到廣泛關(guān)注，是食品安全領(lǐng)域的重要監(jiān)測項(xiàng)目之一。我國從2020年2月起實(shí)施國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2763－2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，規(guī)定了食品中483 種農(nóng)藥最大殘留限量。

目前蔬菜中農(nóng)藥殘留的測定方法主要有氣相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜法[7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-11]、酶抑制法[12]、免疫分析法[13-14]、光譜分析法[15-17]。目前常用的農(nóng)藥前處理方法有超臨界流體萃取[18]、基質(zhì)分散萃取[19-20]、固相萃取[21-22]、凝膠滲透[23]。這些前處理方法存在操作復(fù)雜、消耗大量溶劑、靈敏度不夠高等缺點(diǎn)[24]。

分散液液微萃取是通過形成穩(wěn)定的萃取劑-分散劑-樣品溶液乳濁液體系，使待測物在樣品溶液及萃取劑之間快速達(dá)到分配平衡而完成萃取。因其具有操作簡便、消耗溶劑量少、富集倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，己成為國內(nèi)外研究農(nóng)藥殘留量的熱點(diǎn)之一[25]。本工作將分散液液微萃取與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合，建立了測定黃瓜中甲胺磷、氧樂果、甲拌磷、樂果、甲基對硫磷、殺螟松、毒死蜱、對硫磷、喹硫磷等9種農(nóng)藥殘留量的分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian 300MS 型三重四極桿質(zhì)譜儀；Varian CP450-GC型氣相色譜儀；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī)；Milli-Q 型純水機(jī)。

9種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100.0 mg·L－1。

9種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.00 mg·L－1，移取適量100.0 mg·L－1的9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液混合，用乙腈稀釋而成。

二氯甲烷、氯苯、四氯化碳、四氯乙烯、丙酮、乙腈、甲醇均為色譜純；氯化鈉為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 VF-5ms 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度230℃；載氣為氦氣，流量1.0 mL·min－1；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL。柱升溫程序:初始溫度40℃，保持1 min；以40 ℃·min－1速率升溫至180 ℃；再以20 ℃·min－1速率升溫至210 ℃；然后以3 ℃·min－1速率升溫至230 ℃，保持1 min；最后以40 ℃·min－1速率升溫至280 ℃，保持5 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃，腔體溫度40℃；溶劑延時(shí)4.0 min；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；碰撞氣為氬氣。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1，其中，“?”為定量離子對。

1.3 試驗(yàn)方法

用食物料理機(jī)將黃瓜樣品搗碎，稱取2.00 g勻漿的黃瓜樣品置于15 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈和1.0 g氯化鈉，渦旋10 min，然后以4 500 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min。取上層清液1.0 mL作為分散劑，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)10 mL 離心管中，再加入5.0 mL水和30μL氯苯，渦旋振蕩混勻3 min，形成均相乳濁液，然后以5 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，用微量注射器吸取底部氯苯溶液，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按儀器工作條件對9種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，其總離子流色譜圖見圖1。

圖1 9種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of mixed standard solution of 9 pesticides

2.2 萃取劑的選擇

萃取劑需滿足以下要求:萃取劑在水中的溶解度較小；萃取劑密度必須大于水，以便萃取劑沉淀至底部；萃取劑對目標(biāo)化合物的溶解性好；能滿足后續(xù)色譜分析。試驗(yàn)以乙腈為分散劑，考察了萃取劑依次為二氯甲烷、氯苯、四氯化碳、四氯乙烯時(shí)的萃取效率。結(jié)果表明:由于二氯甲烷易揮發(fā)，二氯甲烷的萃取液體積減少較大，試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性較差；氯苯的萃取效率(76.7%～94.4%)比四氯化碳的萃取效率(66.2%～87.1%)和四氯乙烯的萃取效率(55.6%～83.7%)都要好。試驗(yàn)選擇萃取劑為氯苯。

2.3 分散劑的選擇

分散劑需滿足以下要求:分散劑與水能完全互溶，在分散時(shí)能形成穩(wěn)定的兩相；分散劑不干擾目標(biāo)化合物的定性和定量分析。試驗(yàn)中，分散劑也是從黃瓜樣品中提取目標(biāo)化合物的提取劑。通過振蕩提取，各農(nóng)藥富集到提取液中，而目標(biāo)化合物中大部分的極性化合物則保留在水相中。分散液液微萃取既起到凈化作用，還可以通過富集作用增加測定靈敏度。試驗(yàn)以氯苯為萃取劑，考察了分散劑依次為丙酮、乙腈時(shí)的提取效果。結(jié)果表明:丙酮會(huì)提取出大量色素和油脂，不宜作為提取劑；乙腈的提取效果較好，乙腈也是最常用的農(nóng)藥提取劑。試驗(yàn)選擇分散劑和提取劑均為乙腈。

2.4 萃取劑用量、分散劑用量、水的用量和萃取時(shí)間的選擇

影響分散液液微萃取的因素有萃取劑用量、分散劑用量、水的用量、萃取時(shí)間等。試驗(yàn)以氯苯為萃取劑，乙腈為分散劑對黃瓜樣品進(jìn)行分散液液微萃取并按儀器工作條件進(jìn)行測定，以毒死蜱含量計(jì)算回收率。

試驗(yàn)考察了萃取劑氯苯的用量為30～90μL時(shí)對目標(biāo)化合物萃取效率的影響。結(jié)果表明:萃取效率變化不大，試驗(yàn)選擇萃取劑氯苯的用量為30μL。

試驗(yàn)考察了分散劑乙腈(提取液)用量依次為0.5，1.0，1.5 mL 時(shí)對目標(biāo)化合物萃取效率的影響。結(jié)果表明:乙腈(提取液)用量為1.0 mL 時(shí)，目標(biāo)化合物的萃取效率最好。這可能是隨著乙腈(提取液)用量增加，目標(biāo)化合物在水中的分散程度增大，溶解度增加，使得氯苯的萃取效率隨之降低。試驗(yàn)選擇分散劑乙腈(提取液)的用量為1.0 mL。

在分散液液微萃取的過程中，水相作為中間相，可以分散萃取劑以富集目標(biāo)化合物。試驗(yàn)考察了水的用量依次為2.5，5.0，7.5 mL 時(shí)對目標(biāo)化合物萃取效率的影響。結(jié)果表明:水的用量為5.0 mL 時(shí)，目標(biāo)化合物的萃取效率最好。試驗(yàn)選擇水的用量為5.0 mL。

試驗(yàn)將渦旋振蕩應(yīng)用于分散液液微萃取中，細(xì)小萃取劑液滴通過渦旋振蕩作用，在分散劑中形成穩(wěn)定的三相混濁體。試驗(yàn)考察了萃取時(shí)間依次為3，6，10 min時(shí)對目標(biāo)化合物萃取效率的影響。結(jié)果表明:萃取時(shí)間為3 min時(shí)，目標(biāo)化合物達(dá)到萃取平衡；隨著萃取時(shí)間的增加，萃取效率變化不大。試驗(yàn)選擇萃取時(shí)間為3 min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

稱取6份空白黃瓜樣品2.00 g，分別加入適量的9種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成5，10，20，40，80，160μg·kg－1的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按儀器工作條件對上述基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定。以9種農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。9種農(nóng)藥的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

在空白黃瓜樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，以3倍信噪比的響應(yīng)值作為方法的檢出限(3S/N)，以10倍信噪比的響應(yīng)值作為方法的測定下限(10S/N)，結(jié)果見表3。

表3 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對空白黃瓜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行測定5次，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)%

由表4可知:回收率為81.7%～108%，RSD 為2.7%～12%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對市售40批次黃瓜樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明:部分黃瓜樣品中檢出甲胺磷、氧樂果、毒死蜱，其中甲胺磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.022～0.044 mg·kg－1，氧樂果的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.031～0.12 mg·kg－1，毒死蜱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12～0.23 mg·kg－1。

本工作采用分散液液微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜中9種農(nóng)藥的殘留量。與傳統(tǒng)的萃取方法相比，本方法結(jié)合了分散液液微萃取的優(yōu)勢，具有操作快速、簡便、低成本、環(huán)境污染少、回收率和靈敏度高等特點(diǎn)，滿足GB 2763－2019 的要求，可用于黃瓜中農(nóng)藥殘留量的測定，可為蔬菜中農(nóng)藥測定研究提供技術(shù)支持。