超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖工藝研究

譚蘭芳，許文珍，楊躍歌，孟繁欽(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)為茜草科耳草屬的一年生披散草本植物，化學(xué)成分主要含有黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等。其中的多糖成分具有抗突變的作用，能夠預(yù)防腫瘤的出現(xiàn)和抑制其生長(zhǎng)繁殖，而且還能夠增強(qiáng)免疫力和抵抗衰老延長(zhǎng)壽命。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)法，考察超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖工藝中的萃取壓力、萃取溫度、攜帶劑(乙醇)濃度和料液比對(duì)粗多糖萃取率的影響，優(yōu)選出最佳萃取工藝，并利用苯酚—硫酸比色法測(cè)定最佳工藝條件下萃取所得白花蛇舌草粗多糖的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

白花蛇舌草，安徽漢楓中藥飲片有限公司；CO2氣體，牡丹江市金瑞氣體有限公司；無(wú)水乙醇(分析純)，哈爾濱試劑化工廠；葡萄糖(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；苯酚(分析純)，沈陽(yáng)試劑一廠；硫酸(分析純)，淄博庫(kù)侖分析儀器有限公司；HA220-50-60型超臨界萃取裝置，江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝生物技術(shù)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖

稱(chēng)量50 g過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)藥篩的白花蛇舌草粉末，裝入料筒后，將其置于1 L萃取釜中借助壓環(huán)和上堵頭進(jìn)行密封，通入攜帶劑乙醇，待萃取溫度及萃取壓力至設(shè)定值后，進(jìn)行循環(huán)萃取并開(kāi)始計(jì)時(shí)，達(dá)到萃取時(shí)間后，依次收集分離釜Ⅰ、Ⅱ內(nèi)的萃取物，備用。

取出旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的收集瓶，裝入收集得到的萃取物。當(dāng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，啟動(dòng)真空泵，開(kāi)始減壓蒸餾，待萃取物呈現(xiàn)糊狀后停止并取出。將糊狀物置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h，得到粗多糖，精確稱(chēng)量其質(zhì)量并計(jì)算萃取率。白花蛇舌草粗多糖萃取率計(jì)算公式為：

1.2.2 白花蛇舌草粗多糖萃取工藝單因素實(shí)驗(yàn)

為給正交實(shí)驗(yàn)水平選取提供依據(jù)，在固定分離壓力及分離溫度的前提下，借助單因素實(shí)驗(yàn)法，分別考察不同萃取壓力(10、20、30、40、50 MPa)、萃取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、乙醇濃度(10%、30%、50%、70%、90%)及料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)對(duì)粗多糖萃取率的變化影響。

1.2.3 正交優(yōu)化超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以白花蛇舌草粗多糖萃取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，各因素與水平情況，見(jiàn)表1。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，正交實(shí)驗(yàn)的萃取時(shí)間設(shè)置為1 h。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.2.4 白花蛇舌草粗多糖的含量測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。將無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒重，精確稱(chēng)取0.02 g置于容量瓶中，加適量蒸餾水溶解后定容至100 mL，制得0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 mL容量瓶5個(gè)，分別精密吸取2、2.5、3、3.5、4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液加入其中，蒸餾水定容至刻度。精確吸取各種溶液1 mL置于5個(gè)試管中，再向各試管精確添加1 mL的5%苯酚溶液后，迅速滴加98%的濃硫酸，混勻，沸水浴10 min后，冷卻20 min，用紫外分光光度計(jì)在490 nm最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，縱坐標(biāo)為吸光度值，橫坐標(biāo)為樣品濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為：

式中：A為吸光度值；C為樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)。

(2)白花蛇舌草粗多糖的含量測(cè)定。精確稱(chēng)取一定量的干燥粗多糖，適量蒸餾水溶解后，定容至150 mL容量瓶中，作為供試品溶液。按照苯酚-硫酸法測(cè)定其吸光度，代入回歸方程計(jì)算多糖的含量，計(jì)算公式如下：

式中：C為白花蛇舌草多糖濃度；D為分取的倍數(shù)；W為白花蛇舌草稱(chēng)取量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對(duì)白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取溫度40 ℃，攜帶劑濃度40%，料液比1∶3的條件下，白花蛇舌草粗多糖萃取率在萃取壓力30 MPa時(shí)出現(xiàn)最大值。萃取壓力在20～30 MPa之間萃取率值變化趨勢(shì)平緩，所以選定萃取壓力在20～30 MPa間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 萃取溫度對(duì)白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取壓力20 MPa，攜帶劑濃度40%，料液比1∶3的條件下，當(dāng)萃取溫度控制在40～50 ℃之間，粗多糖萃取率值變化平緩，且萃取溫度高于50 ℃后，萃取率值不斷降低，故選定萃取溫度在50 ℃左右進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。

2.1.3 攜帶劑濃度對(duì)白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取壓力20 MPa，萃取溫度40 ℃，料液比1∶3的條件下，攜帶劑濃度為30%時(shí)粗多糖萃取率最大，故選定攜帶劑濃度在30～50%之間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 料液比對(duì)白花蛇舌草粗多糖萃取率的影響

萃取壓力20 MPa，萃取溫度40 ℃，攜帶劑濃度40%的條件下，料液比在1∶6時(shí)萃取率值最高，故選定料液比為1∶6左右進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行9組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，極差最大的為因素C，其次為因素B，再次為因素A，最小的為因素D，即超臨界CO2萃取工藝中對(duì)白花蛇舌草粗多糖萃取率的因素影響主次順序?yàn)镃(乙醇濃度)＞B(萃取溫度)＞A(萃取壓力)＞D(料液比)。按照平均值大小選取最優(yōu)水平為A2B1C3D3，即在料液比是1∶8和使用40%的乙醇，并設(shè)定萃取壓力為25 MPa和萃取溫度為40 ℃。

3 最優(yōu)萃取工藝的驗(yàn)證

上述優(yōu)化結(jié)果為理論分析得到，需進(jìn)一步驗(yàn)證。按優(yōu)化方案A2B1C3D3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行重復(fù)3次，計(jì)算平均值。結(jié)果得出白花蛇舌草粗多糖的平均萃取率為0.364%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中各次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明此次的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)合理可行。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

4 多糖純度的測(cè)定

利用苯酚—硫酸比色法測(cè)定最佳工藝條件下萃取所得白花蛇舌草粗多糖的純度為66%，含量較高。

5 結(jié)語(yǔ)

本研究對(duì)超臨界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖萃取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，即在萃取時(shí)長(zhǎng)為1 h，使用40%乙醇為攜帶劑，料液比控制為1∶8，萃取壓力25 MPa，萃取溫度30 ℃的條件下，粗多糖的得率最高。為今后超臨界CO2萃取技術(shù)應(yīng)用于多糖萃取提供了有益的參考，同時(shí)為白花蛇舌草資源利用提供部分依據(jù)，具有一定實(shí)用和推廣價(jià)值。