劉煜耿 , 毛穎津 , 章燦川 , 高貝樂

1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

Epsilon-變形菌廣泛分布于自然界中, 包括深海熱液噴口富集的Caminibacter、Nautilia、Nitratifractor、Sulfurimonas 和Hydrogenimonas 等屬, 水環(huán)境或沉積物中分離的 Sulfurospirillum、Sulfuricurvum、Thiovulum 等屬和部分Arcobacter 屬, 以及人和動(dòng)物的胃腸道致病菌Campylobacter 和Helicobacter 屬 (Campbell et al, 2006)。Epsilon-變形菌是深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群, 可以占據(jù)高達(dá)85%的微生物量, 是深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者 (Waite et al, 2017; McNichol et al, 2018)。由于環(huán)境分離獲得純培養(yǎng)的Epsilon-變形菌特別是深海極端環(huán)境富集的Epsilon-變形菌的數(shù)量較少, 目前關(guān)于這類菌的研究報(bào)道主要集中在兩大病原菌——空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni) 和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)(Campbell et al, 2006)。因此, 空腸彎曲菌和幽門螺桿菌成為研究Epsilon-變形菌的模式菌。

趨化作用是細(xì)菌重要的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制。細(xì)菌通過趨化信號(hào)系統(tǒng)感知周圍物質(zhì)濃度變化, 并將胞外的化學(xué)刺激轉(zhuǎn)變成鞭毛馬達(dá)轉(zhuǎn)動(dòng)方向改變的信號(hào), 促使細(xì)菌改變運(yùn)動(dòng)軌跡趨利避害(Lertsethtakarn et al, 2011)。經(jīng)典的模式菌株大腸桿菌(Escherichia coli)的趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分包括5 個(gè)趨化受體蛋白MCP (Methyl-accepting Chemotaxis Proteins)、一個(gè)偶聯(lián)蛋白CheW、一個(gè)激酶CheA、一個(gè)應(yīng)答蛋白CheY、一個(gè)磷酸酶CheZ 和一個(gè)由甲基酯酶CheB 和甲基轉(zhuǎn)移酶CheR 兩個(gè)蛋白組成的趨化適應(yīng)系統(tǒng)(Chemotaxis adaptation system)(圖1a)(張?jiān)柒?等, 2011)。E. coli的趨化受體蛋白可以與CheW、CheA 互作在細(xì)胞極點(diǎn)形成一個(gè)穩(wěn)定且高效合作的跨膜趨化受體蛋白復(fù)合體(Parkinson et al, 2015; Pi?as et al, 2016)。細(xì)菌通過這種趨化受體復(fù)合體感知外界信號(hào)并通過蛋白磷酸化反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)傳遞, 最終磷酸化的CheY 作用于鞭毛并使細(xì)菌改變運(yùn)動(dòng)方向(Delalez et al, 2010; Porter et al, 2011)。但是, 相較于經(jīng)典的E. coli 趨化信號(hào)系統(tǒng), 其他細(xì)菌的趨化系統(tǒng)呈現(xiàn)復(fù)雜性和多樣性(Wadhams et al, 2004; Stocker et al, 2012)。比如, Bacillus subtilis 多出一個(gè)偶聯(lián)蛋白CheV 和另一套由磷酸酶CheC 和脫酰胺酶CheD 組成的適應(yīng)系統(tǒng)(Rao et al, 2008; Alexander et al, 2010); Helicobacter pylori 雖沒有經(jīng)典的CheB 和CheR 適應(yīng)系統(tǒng), 卻含有3 個(gè)CheV (Pittman et al, 2001); C. jejuni 除了具有E. coli 的趨化組分, 還多出一個(gè)CheV 和另一種磷酸酶CheX (圖1b)(Zautner et al, 2012)。雖然不同細(xì)菌的CheV 數(shù)量存在差異, 但CheV 是一種保守的雙結(jié)構(gòu)域融合蛋白, N 端是CheW 結(jié)構(gòu)域, C 端是REC 結(jié)構(gòu)域。

圖 1 大腸桿菌(Escherichia coli, a)和空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni, b)的趨化系統(tǒng)示意圖 圖中字母表示不同的趨化蛋白; FliM 表示鞭毛馬達(dá)蛋白; Pi 表示磷酸基團(tuán) Fig. 1 Schematic diagram of chemotaxis system. The letters represent different chemotaxis proteins; FliM is flagellum motor protein; Pi stands for phosphate group

趨化基因在基因組上趨向于成簇出現(xiàn), 基因簇內(nèi)部具有規(guī)律的基因排布順序, 根據(jù)基因分布規(guī)律將趨化組分劃分為不同的類別, 即F 系統(tǒng), 包括F1～ F17 (Wuichet et al, 2010)。例如, F3 類型趨化系統(tǒng)的基因順序?yàn)閏heV-cheA-cheW, 該系統(tǒng)的CheA 因有一個(gè)額外的REC 結(jié)構(gòu)域而被稱為CheAY, 該類型趨化系統(tǒng)目前僅在Epsilon-變形菌中發(fā)現(xiàn)。不同細(xì)菌存在不同數(shù)量的CheV, 生物信息學(xué)研究表明在腸道菌株中CheV 的數(shù)量跟趨化受體蛋白的數(shù)量存在正相關(guān)性(Ortega et al, 2016)。C. jejuni 有且僅有一個(gè)F3 類型的CheV (后面用F3-CheV 表示F3 類型的CheV); H. pylori 有3 個(gè)拷貝的F3-CheV, 有2 個(gè)F3- CheV 不是在cheV-cheA-cheW 基因組結(jié)構(gòu)中。已有研究也表明H. pylori 的3 個(gè)CheV 功能具有差異性, CheV1 突變對(duì)趨化有很大的影響, 而 CheV2 和CheV3 突變對(duì)趨化僅是輕微的影響(Pittman et al, 2001; Alexander et al, 2010)。此外, 不同F(xiàn) 類型CheV的功能存在差異。Salmonella typhimurium 的F7 類型CheV 缺失對(duì)趨化的表型影響很小(Alexander et al, 2010)。B. subtilis 的F1 類型CheV 具有跟CheW 類似的偶聯(lián)功能(Rosario et al, 1994), 其CheV 被磷酸化后能抑制CheA 的激酶活性(Karatan et al, 2001)。因此CheV 是一個(gè)分布廣泛且發(fā)揮重要功能的趨化蛋白, 但是其具體的作用機(jī)制還不清楚, 比如CheV跟趨化受體蛋白是否有選擇性互作從而參與特定趨化受體復(fù)合體的形成？是否所有的 CheV 都能被CheA 磷酸化且磷酸化后的CheV 又有什么樣的功能變化？本文將探討F3-CheV 跟趨化受體蛋白是否有選擇性互作。

典型的趨化受體蛋白由多種結(jié)構(gòu)域組成, 包括化學(xué)感受器LBD (Ligand Binding domain)、HAMP (Histidine kinases, Adenylyl Cyclases, Methyl- accepting chemotaxis proteins, Phosphatases)和MA (Methyl-Accepting domain)等結(jié)構(gòu)域。而H. pylori的趨化受體TlpD (Transducer-like proteins D)除包含有保守的MA 結(jié)構(gòu)域外, C-末端還存在一個(gè)能結(jié)合Zn 離子的 CZB 結(jié)構(gòu)域(C- terminal Zinc-Binding domain), 研究表明該結(jié)構(gòu)域有助于H. pylori 應(yīng)對(duì)氧化壓力(Collins et al, 2016)。目前發(fā)現(xiàn)很多具有CZB結(jié)構(gòu)域的趨化受體都是胞內(nèi)蛋白, 且部分趨化受體沒有經(jīng)典的LBD 結(jié)構(gòu)域, 因此推測其可能是一個(gè)新型的信號(hào)感知結(jié)構(gòu)域, 或者CZB 結(jié)構(gòu)域可以通過結(jié)合解離 Zn 離子的方式對(duì)趨化信號(hào)傳遞進(jìn)行調(diào)節(jié)(Collins et al, 2016)。我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)深海熱液口的Epsilon-變形菌均有CZB 結(jié)構(gòu)域的存在, 但有些趨化受體蛋白的CZB 結(jié)構(gòu)域的重要氨基酸位點(diǎn) H-C-H-H 發(fā)生突變, 我們將其命名為CZB-like 結(jié)構(gòu)域。本文對(duì)CZB-like 結(jié)構(gòu)域的Zn 離子結(jié)合能力和功能進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株的基因組信息下載于GeneBank, 空腸彎曲桿菌C. jejuni 81-176、蛋白表達(dá)菌株E. coli BL21、細(xì)菌雙雜交菌株E. coli BTH101 以及質(zhì)粒均源于實(shí)驗(yàn)室保藏。深海熱液口雖具有豐富的微生物量, 但大部分是厭氧菌且難以培養(yǎng)(王風(fēng)平 等, 2013)。我們選取為數(shù)不多已經(jīng)完全測序的深海Epsilon-變形菌菌株進(jìn)行分析, 并通過文獻(xiàn)調(diào)研分析這些物種的呼吸類型和是否是純化培養(yǎng)。菌株信息見表1, 質(zhì)粒信息見表2, C. jejuni 81-176 相關(guān)基因見表3。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析方法

以C. jejuni 81-176 的CheV 和Tlp1 的MA 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為模板進(jìn)行BlastP 同源蛋白分析 (Altschul et al, 1997; Sch?ffer et al, 2001); 用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和HHpred (https:// toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred)生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(Letunic et al, 2018; Zimmermann et al, 2018); 用 MIST 網(wǎng)站(https:// mistdb.com/genomes) 分析趨化組分的 F 類型(Gumerov et al, 2020); 用ClustalX 2.1 進(jìn)行多序列比對(duì)并生成序列對(duì)齊圖案(Crooks et al, 2004; Larkin et al, 2007); 用UBCG 程序包獲取Epsilon-變形菌保守蛋白的比對(duì)串聯(lián)序列(Na et al, 2018)。所有分析均采用默認(rèn)參數(shù)。

表1 菌株信息 Tab. 1 Strain information

表2 質(zhì)粒相關(guān)信息 Tab. 2 Plasmid information

表3 Campylobacter jejuni 81-176 相關(guān)基因信息 Tab. 3 Campylobacter jejuni 81-176 related genetic information

CheV 進(jìn)化距離的分析。將Epsilon-變形菌菌株的所有 F3-CheV 和 Sulfurimonas autotrophica 的F8-CheV 進(jìn)行多序列比對(duì); 用Epsilon-變形菌的保守蛋白串聯(lián)序列代表菌株物種進(jìn)化; 用MEGA7.0的泊松分布模型分別計(jì)算CheV 間和物種間的進(jìn)化距離(Kumar et al, 2016)。

CZB 結(jié)構(gòu)域的分析。因?yàn)镃ZB 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)已解析, 存在于DgcZ 蛋白中[蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)編號(hào): 3T9O], 因此通過BlastP、SMART 和HHpred數(shù)據(jù)庫分析趨化受體蛋白是否存在類似DgcZ-CZB的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)CZB 結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸位點(diǎn)[H] x..x [C] xxx [G] x [W] x..x [H] xxx [H] (H-C-H-H 是結(jié)合Zn 離子的重要氨基酸)用多序列比對(duì)方法加以鑒定(Zahringer et al, 2013)。

1.2.2 生化試驗(yàn)方法

質(zhì)粒構(gòu)建: 采用天根公司的試劑盒提取質(zhì)粒和C. jejuni 81-176 的基因組, 并設(shè)計(jì)引物(表4)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的片段, 然后進(jìn)行Gibson 連接(Gibson et al, 2009)。

細(xì)菌雙雜交方法: 克隆跨膜趨化受體(Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp10)的胞內(nèi)MA 結(jié)構(gòu)域及其C 末端的核酸序列和胞質(zhì)趨化受體(Tlp6、Tlp8 和Aer1、Aer2)的全長核酸序列至pUT18C 或者pCH363 質(zhì)粒中, 克隆cheA 或cheW 至pKNT25 質(zhì)粒中, 然后共轉(zhuǎn)化至雙雜交細(xì)菌E. coli BTH101 中(圖2a、2b)。因Tlp2、Tlp3、Tlp4 的MA 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列100%相似, 因此只用了Tlp4 進(jìn)行試驗(yàn); 因?yàn)閠lp5 基因發(fā)生了點(diǎn)突變不能正常翻譯, 因此沒有用Tlp5 進(jìn)行試驗(yàn)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BTH101 中, 在 含 有 氨 芐 青 霉 素(1 0 0 μ g·m L–1)+卡 那 霉 素(50μg·mL–1)+IPTG (0.5mmol·L–1)+X-gal (40μg·mL–1) 的固體LB 培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)觀察48h, 若菌斑變藍(lán)則證明有相互作用, 如果菌落顯白色則表明無相互作用, 通過菌斑的藍(lán)色深淺粗略判斷蛋白互作的強(qiáng)弱(Battesti et al, 2012)。

表4 引物序列 Tab.4 Primer sequence

蛋白表達(dá)純化及 Zn 離子的測定: 分別構(gòu)建Tlp6 全長蛋白、Tlp9 胞內(nèi)全長蛋白及其不含CZB- like 結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)蛋白表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化至 E. coli BL21 中。蛋白純化過程中, 先用含60mmol·L–1咪唑的蛋白緩沖液進(jìn)行洗雜, 最后用不含 NaCl 的300mmol·L–1咪唑蛋白緩沖液洗脫目的蛋白。加入濃硝酸消解蛋白溶液, 后用雙氧水(ddH2O)稀釋濃硝酸至 1%以下, 使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP- Mass)測定Zn 離子含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 深海Epsilon-變形菌的F 趨化類型及CheV 蛋白的分析

我們使用MIST 數(shù)據(jù)庫調(diào)查深海Epsilon-變形菌的F 趨化系統(tǒng)類型, 發(fā)現(xiàn)在所分析的Epsilon-變形菌菌株中, 除Nitratiruptor sp. SB155-2 外, 都具有 F3 類型趨化系統(tǒng), 而且大部分深海Epsilon-變形菌與C. jejuni 類似, 都是有且僅有一個(gè)F3 類型趨化系統(tǒng)(表5)。

圖2 細(xì)菌雙雜交研究Campylobacter jejuni 81-176 的CheV 與趨化受體蛋白的相互作用 a. 細(xì)菌雙雜交操作示意圖; b. 基因克隆示意圖, 左圖表示跨膜的Tlp 只截取胞內(nèi)的MA 結(jié)構(gòu)域及MA 結(jié)構(gòu)域后的序列進(jìn)克隆, 右圖表示胞內(nèi)趨化受體選取蛋白的全長序列進(jìn)行克隆; c. CheV 與趨化受體蛋白的細(xì)菌雙雜交結(jié)果; d. CheW 與趨化受體蛋白的細(xì)菌雙雜交結(jié)果。圖c 和圖d 中顏色深淺代表蛋白相互作用的強(qiáng)弱程度。BTH101 為細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)菌株 Fig. 2 Using bacterial two-hybrid system to study the interaction between CheV and chemotactic receptors in Campylobacter jejuni 81-176. (a) Schematic diagram of bacterial two-hybrid experiment; (b) Schematic diagram of gene cloning. The left panel shows that for transmembrane Tlps, only MA domains and sequences after the MA domain were cloned into vectors. The right panel shows the full-length sequence of the cytolasmic chemotactic receptor was selected for cloning; (c) Interaction of CheV with Tlps by bacterial two-hybrid experiments; (d) Interaction of CheW with Tlps by bacterial two-hybrid experiments. The shade of color in Figure C and D represents the strength of protein interaction. BTH101 is a strain for bacterial double hybrid system

表5 深海Epsilon-變形菌的F 類型和CheV 的分析統(tǒng)計(jì) Tab. 5 Analysis and statistics of F-Class and CheV in deep sea Epsilon-proteobacteria

已知不同細(xì)菌的CheV 的數(shù)量和功能存在差異。C.jejuni 和大部分深海Epsilon-變形菌只有一個(gè)CheV 且都屬于F3 類型(表5), 因此C.jejuni 的F3-CheV 很有可能是由深海 Epsilon-變形菌的F3-CheV 垂直遺傳的, 而非基因水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想, 我們將深海Epsilon-變形菌和C.jejuni 的F3-CheV 以及作為對(duì)照的Sulfurimonas autotrophica 的F8-CheV (表5, 8 個(gè)F3-CheV, 1 個(gè)F8-CheV)進(jìn)行兩兩比較, 計(jì)算不同菌株的CheV 之間的進(jìn)化距離; 用UBCG 程序包產(chǎn)生各Epsilon-變形菌的保守蛋白串聯(lián)序列并以此計(jì)算物種間的進(jìn)化 距離。圖3 顯示這些菌株兩兩之間的F3-CheV 進(jìn)化距離跟物種進(jìn)化距離一致(斜率接近 1), 而Sulfurimonas autotrophica 的 F8-CheV 與 其 他Epsilon-變形菌的 F3-CheV 間的距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sulfurimonas autotrophica 與這些Epsilon-變形菌間的物種距離, 但是同是源自Sulfurimonas autotrophica的F3-CheV 卻與物種有相近的進(jìn)化距離。這表明F3-CheV 可以穩(wěn)定地在這些菌株中進(jìn)行基因垂直傳遞, 而非F3 類型的CheV 如F8-CheV 應(yīng)該來自水平基因轉(zhuǎn)移(圖3)。因此深海Epsilon-變形菌與C. jejuni的F3-CheV 功能應(yīng)該是同樣的。

圖 3 深海 Epsilon-變形菌和 Campylobacter jejuni 的CheV 分子間進(jìn)化距離分析 藍(lán)色表示深海 Epsilon-變形菌的兩兩比較; 橙色表示深海Epsilon-變形菌與C. jejuni 81-176 的兩兩比較; 圓圈表示不同菌株的F3-CheV 間的距離; 三角形表示Sulfurimonas autotrophica的F8-CheV 與其他Epsilon-變形菌菌株的F3-CheV 之間的距離 Fig. 3 Pairwise Distances matrix to calculate the evolutionary distance for CheV homologs between deep-sea Epsilon-proteobacteria and Campylobacter jejuni. Blue indicates the evolutionary distance between deep-sea Epsilon- proteobacteria. Orange indicates the evolutionary distance between deep-sea Epsilon-proteobacteria and C. jejuni 81-176. Dot shows the distance between F3-CheV in different Epsilon-proteobacteria, and triangle shows the distance between F8-CheV in sulfurimonas autotrophica and F3-CheV in other Epsilon-proteobacteria

2.2 CheV 與趨化受體蛋白的相互作用

由于深海Epsilon-變形菌難以純化培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳操作試驗(yàn)(臧揚(yáng) 等, 2017), 從前面CheV 的進(jìn)化距離分析推測垂直傳遞的F3-CheV 功能上應(yīng)該具有相似性, 因此我們選用Epsilon-變形菌的模式菌株C. jejuni 81-176 進(jìn)行CheV 與趨化受體蛋白的互作研究, 進(jìn)而推測深海Epsilon-變形菌F3-CheV 的功能。C. jejuni 81-176 具有MA 結(jié)構(gòu)域的完整趨化受體Tlp 和沒有MA 結(jié)構(gòu)域但有PAS 結(jié)構(gòu)域的趨化受體Aer (An energy taxis receptor)。我們采用細(xì)菌雙雜交方法檢測CheV 或CheW 是否與趨化受體蛋白之間發(fā)生互作, 將 cheV 和 cheW 基因克隆至載體pKNT25 中, 將tlp 或aer 基因克隆至pUT18C 中。已有研究發(fā)現(xiàn)趨化受體內(nèi)只有 MA 結(jié)構(gòu)域參與CheV 和CheW 的互作, 所以對(duì)于跨膜趨化受體, 我們只克隆了編碼胞內(nèi)含MA 結(jié)構(gòu)域的C 末端核酸序列; 對(duì)于胞內(nèi)趨化受體, 則克隆編碼全長蛋白的核酸序列(圖2a、2b)。

從結(jié)果可知CheV 與Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp10 有強(qiáng)烈的互作, 而與Tlp6 和Tlp8 的互作性較弱, 與Aer1 和Aer2 沒有互作(圖2c)。Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp 10 都是跨膜蛋白, CheV 與這類蛋白互作很強(qiáng), 而跟胞內(nèi) Tlp6、Tlp8 的互作較弱; Aer1 和Aer2 由于沒有MA 結(jié)構(gòu)域, 無法跟CheV互作。CheW 似乎跟所有的Tlp 都有很弱的相互作用, 但是出乎意料的是Aer1 和Aer2 也與CheW 顯示有微弱的互作(圖2d)。我們猜測由于CheW 蛋白高度保守, 異源表達(dá)的CheW 可能會(huì)參與E. coli BTH101 自身的趨化受體復(fù)合體組裝, 從而導(dǎo)致CheW 的細(xì)菌雙雜交試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生異常。此外, Aer1 和Aer2 的PAS 結(jié)構(gòu)域可能結(jié)合到E. coli BTH101 自身趨化受體的HAMP 結(jié)構(gòu)域上間接與CheW-T25 互作, 從而使CheW 與Aer1 和Aer2 產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

2.3 CZB-like 結(jié)構(gòu)域的Zn 結(jié)合能力及在蛋白互作中的作用

H. pylori 的TlpD 的CZB 結(jié)構(gòu)域可以幫助其適應(yīng)氧化壓力。因此我們想了解深海Epsilon-變形菌的趨化受體蛋白是否也含有CZB 結(jié)構(gòu)域來幫助其適應(yīng)深海的極端環(huán)境。首先用 BlastP 分析以及SMART 和HHpred 數(shù)據(jù)庫分析獲得含CZB 結(jié)構(gòu)域的趨化受體蛋白, 進(jìn)一步通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)Caminibacter mediatlanticus 和Cetia pacifica 兩株深海菌株以及C. jejuni 81-176 存在含類似DgcZ-CZB結(jié)構(gòu)域的趨化受體蛋白, 但是缺乏保守位點(diǎn)[H] x..x [C] xxx [G] x [W] x..x [H] xxx [H], 因此我們稱這種結(jié)構(gòu)域?yàn)镃ZB-like 結(jié)構(gòu)域; 而其他具有保守氨基酸位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域則確認(rèn)為CZB 結(jié)構(gòu)域(圖4, 表6)。為了進(jìn)一步確定CZB 結(jié)構(gòu)域的分布, 我們通過BlastP 分析發(fā)現(xiàn)Epsilon-變形菌的很多菌株都存在含CZB 結(jié)構(gòu)域的趨化受體蛋白, 但是比例沒有深海熱液口的Epsilon-變形菌高, 比如C. jejuni和H. pylori 都只有一個(gè)含CZB 結(jié)構(gòu)域的趨化受體蛋白。這說明CZB 結(jié)構(gòu)域可能在Epsilon-變形菌適應(yīng)深海極端環(huán)境的過程中發(fā)揮重要功能。此外, 我們發(fā)現(xiàn)普通水生境的 Arcobacter marinus 和Arcobacter anaerophilus 以 及 致 病 菌Campylobacter hepaticus 也存在含CZB-like 結(jié)構(gòu)域的趨化受體蛋白。

圖4 CZB 結(jié)構(gòu)域和CZB-like 結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)分析 通過多序列比對(duì)尋找保守氨基酸并以此區(qū)分CZB 結(jié)構(gòu)域和CZB-like 結(jié)構(gòu)域。藍(lán)色字體代表的是深海菌株, 標(biāo)紅的字母代表CZB 結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸位點(diǎn) Fig. 4 Sequence alignment of CZB domain and CZB-like domain. Blue font indicates deep-sea strain, Red letter indicates conserved amino acids of CZB domain

CZB-like 結(jié)構(gòu)域中對(duì)應(yīng)的H-C-H-H 發(fā)生突變后, 是否還能結(jié)合Zn 離子, 是否在趨化過程中發(fā)揮其他功能？我們通過序列分析發(fā)現(xiàn), C. jejuni 81-176 的Tlp6 的C-末端是一個(gè)經(jīng)典的CZB 結(jié)構(gòu)域, 而Tlp9的C-末端是一個(gè)CZB-like 結(jié)構(gòu)域(表3)。為檢測CZB-like 結(jié)構(gòu)域的功能, 我們將Tlp6、Tlp9 和敲除CZB-like 結(jié)構(gòu)域的Tlp9 (no CZB-like)克隆至pGEX-6P 質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化進(jìn) E. coli BL21 表達(dá)系統(tǒng) 中進(jìn)行異源表達(dá)。通過蛋白純化、消解及ICP-Mass分析, 我們發(fā)現(xiàn)Tlp6 檢測到的Zn 離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.00×10-7左右, 而Tlp9 檢測到的Zn 離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.25×10-7以下(圖5a)。但將Zn 離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算結(jié)合比, 發(fā)現(xiàn)Tlp6 蛋白與Zn 的結(jié)合比值約為1.5, 證實(shí)了一個(gè)CZB 結(jié)構(gòu)域大約能結(jié)合一個(gè)Zn 離子, 說明Tlp6 蛋白具有一個(gè)真正的 CZB 結(jié)構(gòu)域(圖 5b)。然而 Tlp9 的CZB-like 結(jié)構(gòu)域并沒有結(jié)合 Zn 離子, 這說明CZB-like 結(jié)構(gòu)域雖然在二級(jí)結(jié)構(gòu)上類似于DgcZ-CZB 結(jié)構(gòu)域, 但由于關(guān)鍵氨基酸突變, 已經(jīng)不能結(jié)合Zn 離子(圖5b)。

表6 深海Epsilon-變形菌CZB 結(jié)構(gòu)域的分析統(tǒng)計(jì) Tab. 6 Analysis and statistics of CZB domain in deep sea Epsilon-proteobacteria

圖5 CZB-like 結(jié)構(gòu)域的Zn 結(jié)合能力及潛在功能的研究 a. ICP-Mass 檢測CZB-like 結(jié)構(gòu)域的Zn 離子結(jié)合能力; b. 根據(jù)3 次質(zhì)譜測定的平均離子濃度和平均蛋白濃度計(jì)算蛋白和Zn 離子的結(jié)合比例; c 和d. 細(xì)菌雙雜交研究Tlp9 的CZB-like 結(jié)構(gòu)域能否影響Tlp9 與CheV 和CheW 的相互作用。圖c 和圖d 中不同顏色分別代表蛋白相互作用的強(qiáng)弱程度 Fig. 5 Study on Zn-binding capacity and potential function of CZB-like domain. (a) Zn concentration measure by ICP-mass; (b) Using the average Zn concentration and average protein concentration, the binding ratio of protein and Zn is calculated; (c and d) To investigate whether the CZB-like domain of Tlp9 can affect the interaction with CheV or CheW by bacterial two-hybrid experiments. The shade of color in Figure C and D represents the strength of protein interaction

趨化受體蛋白跟CheW 或CheA 的互作界面主要是在趨化受體蛋白的MA 結(jié)構(gòu)域, 而CZB-like 結(jié)構(gòu)域就在MA 結(jié)構(gòu)域的后邊, 這種蛋白結(jié)構(gòu)有可能介導(dǎo)蛋白互作。為進(jìn)一步探究CZB-like 結(jié)構(gòu)域的功能, 我們構(gòu)建了CheV 或CheW 跟Tlp9 及其蛋白截短體的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)菌株, 研究CZB-like 結(jié)構(gòu)域?qū)lp9 和CheV 或CheW 的互作影響。試驗(yàn)結(jié)果表明, 由于Tlp9 的CZB-like 結(jié)構(gòu)域存在, Tlp9 跟CheV的互作能力明顯很強(qiáng), 而將Tlp9 的CZB-like 結(jié)構(gòu)域截掉, Tlp9 則喪失與CheV 互作的功能(圖5c)。而且, T18 標(biāo)簽如果加在Tlp9 的C 端(即Tlp9 的CZB-like結(jié)構(gòu)域的C 端), 會(huì)嚴(yán)重影響Tlp9 與CheV 的互作(圖5c)。CheW 與Tlp9 及其截除CZB-like 結(jié)構(gòu)域的蛋白雜交結(jié)果并沒有顯示出差別(圖5d), 從圖2d 可以看出CheW 在E. coli BTH101 系統(tǒng)中存在問題, 從而影響CheW 與Tlp9 的互作結(jié)果, 因此無法下結(jié)論。但是從Tlp9 與CheV 的互作結(jié)果中可知CZB-like結(jié)構(gòu)域能影響Tlp9 與CheV 的互作。

3 討論與結(jié)論

我們研究發(fā)現(xiàn)大部分深海 Epsilon-變形菌的CheV 屬于F3 類型, 但CheV 的數(shù)量在深海Epsilon-變形菌中是變化的, 大部分只有一個(gè)CheV, 少數(shù)菌株具有多個(gè)CheV, 如Sulfurimonas autotrophica 各有一個(gè)F3-CheV 和一個(gè)F8-CheV。計(jì)算深海Epsilon-變形菌和C. jejuni 兩兩之間的物種進(jìn)化距離和CheV 分子進(jìn)化距離發(fā)現(xiàn)F3-CheV 與物種間的進(jìn)化距離相近。據(jù)此可以推測深海 Epsilon-變形菌與 C. jejuni 的F3-CheV 具有垂直傳遞關(guān)系和功能的相似性。

細(xì)菌雙雜交的結(jié)果表明CheV 可以和所有的Tlp互作, 但存在親和力的差別。CheV 和跨膜的Tlp1、Tlp4、Tlp7、Tlp9、Tlp10 互作親和力更大, 和胞內(nèi)Tlp6、Tlp8 親和力較弱。雖然結(jié)果顯示CheW 與所有的Tlp 都有弱相互作用, 但由于異源表達(dá)的CheW可能會(huì)參與E. coli BTH101 的趨化系統(tǒng)復(fù)合體組裝, 從而導(dǎo)致CheW 與Tlp 的互作結(jié)果不可信。有研究表明PAS 結(jié)構(gòu)域可以和HAMP 結(jié)構(gòu)域互作(Elliott et al, 2009), 而Aer1 和Aer2 都有PAS 結(jié)構(gòu)域, 因此可能是Aer1 和Aer2 結(jié)合到E. coli BTH101 自身趨化受體的HAMP 結(jié)構(gòu)域上, 且CheW-T25 參與E. coli BTH101 趨化受體復(fù)合體的組裝, 因此導(dǎo)致Aer1 或Aer2 與CheW 產(chǎn)生間接性互作, 從而使CheW 與Aer1、Aer2 產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外, 細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的基因是超表達(dá)狀態(tài), 而超表達(dá)的蛋白容易產(chǎn)生非特異性互作, 這可能是導(dǎo)致CheW 與Aer1、Aer2產(chǎn)生假陽性的另一種原因。所以該蛋白互作系統(tǒng)不適用于研究CheW 蛋白的互作, 從而無法對(duì)CheW與趨化受體蛋白的互作下結(jié)論。

E. coli 的趨化受體復(fù)合體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到了解析, 是一個(gè)趨化陣列結(jié)構(gòu), 整個(gè)趨化陣列展現(xiàn)出一個(gè)非常完美的六元環(huán)結(jié)構(gòu), 兩個(gè)三聚體形式的趨化受體蛋白與一個(gè)二聚體的CheA 和兩個(gè)CheW 組成一個(gè)核心單元, 3 個(gè)核心單元又組裝成一個(gè)晶格單元, 晶格單元彼此相連形成一個(gè)很大的趨化陣列(Liu et al, 2012; Cassidy et al, 2015)。由于E. coli 沒有CheV, 目前還沒有任何CheV 蛋白的結(jié)構(gòu)解析。CheV 如何參與六元環(huán)的組裝, CheV 的REC 結(jié)構(gòu)域在趨化陣列中處于什么位置, REC 結(jié)構(gòu)域能否被磷酸化以及被磷酸化后在趨化陣列的信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮什么樣的功能, 這些都是相當(dāng)有意義但又極具挑戰(zhàn)的問題。隨著冷凍電鏡的發(fā)展, 可以通過體外重構(gòu)趨化陣列, 然后用電鏡直接觀察CheV 是否參與陣列組裝, 以及如何影響趨化陣列的信號(hào)傳遞。而很多的Epsilon-變形菌具有單拷貝的CheV 和CheW, 是研究CheV 參與趨化陣列組裝的理想對(duì)象。

此外, 我們發(fā)現(xiàn)所有的深海Epsilon-變形菌中都存在含CZB 結(jié)構(gòu)域的趨化受體蛋白, 且數(shù)量要比致病菌 C. jejuni 和 H. pylori 多, 這可能跟深海Epsilon-變形菌適應(yīng)極端環(huán)境相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)了一種新的結(jié)構(gòu)域CZB-like 結(jié)構(gòu)域。通過ICP-Mass, 確定了Tlp6 的CZB 結(jié)構(gòu)域能結(jié)合Zn 離子, 是一個(gè)真正的CZB 結(jié)構(gòu)域; 而Tlp9 的CZB-like 結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合Zn 離子, 說明H-C-H-H 關(guān)鍵氨基酸的突變, 使CZB 結(jié)構(gòu)域結(jié)合Zn 離子的能力喪失, 但是細(xì)菌雙雜交試驗(yàn)結(jié)果表明C. jejuni 81-176 的CZB-like 結(jié)構(gòu)域可以極大促進(jìn)Tlp9 與CheV 的互作。關(guān)于CZB 結(jié)構(gòu)域和CZB-like 結(jié)構(gòu)域如何影響趨化受體的構(gòu)象進(jìn)而影響其與其他趨化蛋白的相互作用有待進(jìn)一步研究。