豬流行性腹瀉病毒與豬鏈球菌混合感染的診斷

巢萬鵬

(汨羅市畜牧水產(chǎn)服務(wù)中心，湖南 汨羅 414400)

0 引言

生豬養(yǎng)殖過程中仔豬腹瀉是十分常見的臨床疾病，但可導(dǎo)致仔豬腹瀉的病因較多，包括病原感染、營養(yǎng)不足甚至是毒素中毒等，其中病原包括有細菌、病毒和寄生蟲等[1-2]。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是導(dǎo)致仔豬腹瀉的常見腸道病毒，該病原感染仔豬可導(dǎo)致較高的發(fā)病率與死亡率，其中病畜臨床癥狀主要包括急性水樣腹瀉、嘔吐等，最終因嚴重脫水而死亡[1]。PEDV屬于冠狀病毒，該病原在1971年首次于英國被發(fā)現(xiàn)，其后在全世界各地豬群均有報道，如歐洲、亞洲和北美洲等地區(qū)。2010年以來我國多地區(qū)爆發(fā)PEDV變異株，且PEDV變異株的出現(xiàn)與流行給我國養(yǎng)豬業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟損失[3]。

豬鏈球菌在我國豬場廣泛存在，其中部分血清型豬鏈菌(如血清2型)可感染人，因此該病原為重要的人畜共患性傳染病。豬鏈球菌感染豬群后可導(dǎo)致病畜出現(xiàn)嚴重的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等，若該病原通過病畜感染給養(yǎng)殖人員或消費者，則導(dǎo)致人的急性腦膜炎或感染性中毒等，嚴重時可導(dǎo)致休克或死亡。因此，豬鏈球菌的流行嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，同時對公共健康也造成巨大的威脅[4]。

2020年4月，湖南省汨羅市某規(guī)?；i場部分欄舍出現(xiàn)疫情，主要表現(xiàn)為仔豬嚴重腹瀉、嘔吐等，且部分仔豬關(guān)節(jié)腫大，并出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率。筆者通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷及實驗室診斷等，最終判定為PEDV和豬鏈球菌混合感染，其詳細報告如下。

1 豬場發(fā)病情況

湖南省汨羅市某規(guī)?；i場飼養(yǎng)繁殖母豬200余頭，2020年4月中旬，該場3號產(chǎn)房部分欄舍有仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀，其后飼養(yǎng)員對腹瀉仔豬口服抗生素，但腹瀉情況沒有得到好轉(zhuǎn)，且臨近欄舍豬群也開始腹瀉和嘔吐等，至4月20號左右，該產(chǎn)房已有128頭仔豬腹瀉，死亡52頭。

2 臨床及病理癥狀

筆者進入該場觀察發(fā)病豬群整體狀況，發(fā)現(xiàn)該場腹瀉仔豬糞便為黃色水狀，且肛門括約肌因高頻率腹瀉處于張開狀態(tài)，少部分仔豬也出現(xiàn)嘔吐癥狀。此外，也發(fā)現(xiàn)有極個別仔豬關(guān)節(jié)腫大，手觸摸腫脹處有波動感，但此類病豬沒有出現(xiàn)呼吸困難或神經(jīng)癥狀等。

對發(fā)病嚴重、具有臨床表現(xiàn)特征的2頭病豬進行剖檢，可發(fā)現(xiàn)該病豬腹股溝和頜下淋巴結(jié)腫大并充血，關(guān)節(jié)處劃開可見較為黏稠的濃汁，病豬的肺臟、肝臟和脾臟等未出現(xiàn)明顯的病理變化，可見腸壁變薄、腸系膜充血等，且小腸內(nèi)有黃色黏稠的液體等。

3 實驗室診斷

3.1 細菌分離鑒定及藥敏試驗

無菌采集關(guān)節(jié)腔內(nèi)黏稠液體、腹股溝和頜下淋巴結(jié)，用高溫灼燒的接種環(huán)(冷卻后)蘸取少量組織液后在TSA鮮血瓊脂培養(yǎng)基上進行平板劃線，將培養(yǎng)基放置在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，每隔12 h觀察培養(yǎng)基表面是否有菌株及其生長情況。若平板表明有菌株生長，則對單一的菌株進行涂片并染色鏡檢，觀察菌株的形態(tài)學(xué)特征，此外，采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會推薦的藥敏紙片法對分離菌株進行藥敏試驗[5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在仔豬的關(guān)節(jié)腔和淋巴結(jié)中均分離到菌株，其在TSA培養(yǎng)基表面可形成灰白色、濕潤透明的菌落，且菌落周圍有溶血環(huán)，將單一菌落進行革蘭氏染色，并油鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陽性，且橢圓形的菌體呈短鏈狀的排列，可初步鑒定為豬鏈球菌。進一步藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株對氧氟沙星、頭孢噻呋鈉和環(huán)丙沙星等抗生素敏感，但對其他抗生素(如卡那霉素、頭孢拉定、頭孢唑林和羧芐西林等)存在不同程度的耐藥。

3.2 組織樣品核酸提取及病毒檢測

將組織樣品(主要為淋巴結(jié)和小腸)混合后剪碎，取約2.0 g樣品與10 mL滅菌PBS溶液混合、研磨，將混合樣品高速離心后取上清，用DNA與RNA核酸共提試劑盒提取上清核酸，同時用商業(yè)化試劑盒將部分核酸樣品中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計并合成可導(dǎo)致仔豬腹瀉的常見病原保守性引物，以樣品核酸為模板，通過RT-PCR法檢測樣品中是否存在PEDV、豬傳染性胃腸炎(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)和德塔冠狀病毒(PDcoV)，以及豬偽狂犬病毒(PRV)、豬藍耳病毒(PRRSV)和豬圓環(huán)二型病毒(PCV2)核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2頭發(fā)病仔豬組織樣品中均檢測出PEDV核酸，但其他檢測病原均為陰性。

由于目前我國流行的PEDV毒株包括疫苗株和變異株，為進一步分析該場爆發(fā)的PEDV毒株基因型，擴增了該毒株的S基因部分序列，并將該序列進行測序與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株S基因部分序列與Genbnak收錄的國內(nèi)流行的PEDV變異株核苷酸序列高度同源，但與CV777等疫苗株同源性相對較低。

4 診斷結(jié)果

結(jié)合臨床診斷與實驗室診斷結(jié)果，最終可判定該場出現(xiàn)PEDV與豬鏈球菌混合感染，且PEDV毒株為變異株。

5 結(jié)語

目前，PEDV是導(dǎo)致我國豬場仔豬腹瀉的主要腸道病原，導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原較多，且臨床及病理變化較為類似，這需要實驗室診斷技術(shù)(如PCR法和ELISA法等)對病原進行準確診斷。同時我國流行的PEDV毒株可分為疫苗株和變異株，已有研究表明，現(xiàn)在市場上基于疫苗株研發(fā)的疫苗尚不能完全抵抗變異株對仔豬的感染，因此需要通過分子生物學(xué)技術(shù)確定豬場爆發(fā)PEDV毒株的基因型特征，從而具有針對性地選擇更加有效的疫苗進行防控。

此外，由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致豬場出現(xiàn)耐藥性嚴重的細菌性病原較為常見，本案例中發(fā)生的豬鏈球菌株也對部分抗生素具有較強的耐藥性。對于此類細菌性病原的防控，可采用常規(guī)實驗室技術(shù)對菌株分離后，采用藥敏試驗分析菌株對哪些抗生素敏感，從而選擇有效的藥物進行防治。