洪佳琦，孫宗玖, ，楊志民

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

海雀稗(Paspalum vaginatum)，隸屬于禾本科(Gramineae)雀稗屬，廣泛分布于南北半球的沿海地區(qū)，在美國(guó)南部、非洲、澳大利亞及太平洋沿岸國(guó)家最為豐富[1]，在中國(guó)主要分布于臺(tái)灣、云南、廣東和海南島等地[2-3]。海雀稗是一種極具開發(fā)價(jià)值的鹽生種質(zhì)資源，其耐鹽性優(yōu)于其他暖季型草種；并且可在大部分植物生長(zhǎng)受到抑制的惡劣環(huán)境中正常生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，對(duì)土壤有較強(qiáng)的固著力，可防止水土流失[4-5]，適宜于土壤改良、灘涂綠化等環(huán)境修復(fù)[6-8]，故海雀稗是濱海灘涂發(fā)展草牧業(yè)和改良鹽堿地的優(yōu)良草種。國(guó)外對(duì)海雀稗的育種非常重視，美國(guó)的喬治亞州立大學(xué)是全球培育海雀稗新品種最多的單位[9]。我國(guó)雖有海雀稗分布，但野生種質(zhì)資源收集不足40 份[10-11]，迫切需要開發(fā)或引進(jìn)種質(zhì)，滿足育種需求。

目前，我國(guó)對(duì)于海雀稗的研究主要集中在國(guó)外種質(zhì)的引種栽培、抗性評(píng)價(jià)及育種方面[12-13]。在遺傳多樣性方面，解新明等[4]對(duì)廣東3 個(gè)居群的海雀稗進(jìn)行RAPD 分析，發(fā)現(xiàn)居群間基因組多態(tài)性比率高達(dá)64.77%，認(rèn)為我國(guó)的海雀稗存在豐富的遺傳變異；劉燕等[14]對(duì)國(guó)內(nèi)野生與國(guó)外引進(jìn)的42 份海雀稗種質(zhì)進(jìn)行SRAP 分析，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)與國(guó)外種質(zhì)間遺傳相似性很低。雖然國(guó)內(nèi)針對(duì)海雀稗種質(zhì)引種及開發(fā)已經(jīng)開展了部分工作，但總體還較少，特別是對(duì)育種而言，缺乏親本選擇可用的遺傳信息基礎(chǔ)。因此本研究以國(guó)內(nèi)外較廣范圍內(nèi)收集到的49 份海雀稗種質(zhì)為對(duì)象，利用SRAP 標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確不同種質(zhì)間的遺傳差異程度，為海雀稗育種提供基礎(chǔ)遺傳信息，也為海雀稗種質(zhì)核心種質(zhì)庫(kù)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用49 份海雀稗材料由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供，其中43 份為2016 年從美國(guó)引進(jìn)(源自12 個(gè)國(guó)家)，5 份為國(guó)內(nèi)收集的海雀稗育成品種，1 份為自主選育新材料。所有供試材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)基地育草圃，株距1.5 m，行距2.0 m，并保持完全自然生長(zhǎng)的狀態(tài)，只定期進(jìn)行人工除草，不施肥，不修剪，不灌溉，不防治病蟲害，具體材料信息如表1 所列。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集

2017 年5 月，于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)基地育草圃分別剪取49 份海雀稗的幼嫩葉片1 g，置于2.0 mL EP 管中，用液氮速凍后置于便攜式車載冰箱帶回實(shí)驗(yàn)室，置于–80 ℃冰箱保存，每份材料4 個(gè)樣，均為單株取樣。

1.2.2 DNA 提取、SRAP 反應(yīng)體系及PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

(1) DNA 提?。翰捎酶牧嫉腃TAB 法[15]對(duì)供試材料進(jìn)行基因組DNA 提取。2017 年5 月采集每份材料4 個(gè)重復(fù)幼嫩葉片，將幼嫩葉均勻混合提取DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量，酶標(biāo)儀檢測(cè)DNA 原液濃度和純度，工作液濃度稀釋到20 ng·μL?1，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) SRAP-PCR 反應(yīng)體系：采用20 μL 體系，包括2 ×PCR mix 10 μL，引物(10 μmol·L?1) 1 μL，DNA(20 ng·μL?1)2 μL，ddH2O 6 μL。

(3) SRAP-PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，37 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s (運(yùn)行5 個(gè)循環(huán))；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min(運(yùn)行30 個(gè)循環(huán)) 72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。

(4) PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為2.5 μL，電泳上槽緩沖液為1 ×TBE，100 V 電壓下電泳2 h，使用10%硝酸銀快速銀染顯色。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

運(yùn)用Gel-pro 軟件結(jié)合人工方法讀帶，進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，建立原始“1、0”原始矩陣，“1”表示存在條帶，“0”表示同一位置無(wú)條帶或不易分辨的弱帶。根據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的“1、0”原始矩陣，運(yùn)用PopGenVer l.3.2 計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)的百分率(PP)、有效等位基因數(shù)(ne*)、Nei 遺 傳 距 離(h*)、Shannon 信 息 指 數(shù)(I*)。運(yùn) 用NTSYS-pc 軟件計(jì)算供試材料的Jaccard 遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA 進(jìn)行聚類分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖、PCA 散點(diǎn)分布圖。使用Structure 2.3.4 軟件對(duì)49 份海雀稗材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，選取群體遺傳結(jié)構(gòu)的最優(yōu)群體數(shù)目。

表1 材料編號(hào)及來(lái)源Table 1 Materials and sources

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP 引物多態(tài)分析

運(yùn)用100 對(duì)SRAP 引物(表2)對(duì)49 份海雀稗種質(zhì)資源的基因組DNA 擴(kuò)增，20 對(duì)引物可擴(kuò)增出條帶清晰且重復(fù)性好的條帶，80 對(duì)SRAP 不能擴(kuò)出條帶或擴(kuò)增出不一致的條帶。利用篩選出的20 對(duì)引物組合對(duì)49 份海雀稗種質(zhì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(圖1、表3)，共獲得169 個(gè)條帶，產(chǎn)物大小介于100～500 bp，各引物擴(kuò)增條帶為3～12 條，每條引物的平均擴(kuò)增條帶為8.5 條。在169 條DNA 擴(kuò)增片段中，有118 條多態(tài)性條帶，每條引物平均擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為5.9，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為69.80%。

表2 SRAP 引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analysis

圖1 SRAP 引物篩選聚丙烯酰胺凝膠電泳Figure 1 SRAP primer screening using polyacrylamide gel electrophoresis

供試種質(zhì)有效等位基因數(shù)為1.59～1.97，平均1.83；Nei 遺傳距離為0.36～0.49，平均0.45；Shannon信息指數(shù)的范圍在0.55～0.69，平均0.64 (表3)，說(shuō)明供試海雀稗種質(zhì)資源間存在較豐富的遺傳變異。

2.2 聚類分析

利用NTSYS-pc 計(jì)算的Jaccard 遺傳相似系數(shù)，49份海雀稗種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)介于0.52～0.88，平均值為0.67，說(shuō)明海雀稗種質(zhì)間存在一定的遺傳差異。其中來(lái)自巴西的647913 和來(lái)自美國(guó)夏威夷的647897 相似系數(shù)最大(0.88)，而來(lái)自美國(guó)喬治亞州的647908 和美國(guó)夏威夷647896 兩份材料遺傳相似系數(shù)最小(0.53)，表明它們存在較大遺傳差異。

UPGMA 聚類分析可知(圖2)，在遺傳相似系數(shù)為0.69 時(shí)，可將供試海雀稗材料分為2 大類(Ⅰ、Ⅱ)，在遺傳相似系數(shù)為0.71 時(shí)將材料分為四類(A、B、C、D)，其中A 類包含4 份材料，B 類包含12 份材料，C 類包含20 份材料，D 類包含13 份材料。

2.3 主成分分析

材料間的親緣關(guān)系可以通過(guò)主成分分析(PCA)直觀呈現(xiàn)，種質(zhì)間位置越近表明它們的相似性越高，越遠(yuǎn)則表明種質(zhì)間的遺傳差異越大。根據(jù)統(tǒng)計(jì)“1、0”矩陣，用NTsys 軟件進(jìn)行主成分分析，第1、第2 和第3主成分的貢獻(xiàn)率分別為16.63%、9.06%和5.70%，累計(jì)貢獻(xiàn)率31.39%。從圖3 可知，A 類與B 類、C 類海雀稗材料間有交疊，表明他們親緣關(guān)系比較近；B 類和D 類有交疊，說(shuō)明它們存在一定遺傳相似性。

表3 20 對(duì)引物組合的多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 3 The results of polymorphic amplification of 20 pairs of primer combinations

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

對(duì)49 份海雀稗種質(zhì)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，當(dāng)樣本的等位變異頻率特征類型數(shù)K = 2 時(shí)，其模型的后驗(yàn)概率最大。根據(jù)K 值將49 份海雀稗種質(zhì)劃分為PopⅠ、PopⅡ兩個(gè)類群，分別以紅色、綠色表示(圖4)，且每個(gè)亞類群中主要顏色所占的比例情況(Q 值)可以反映種質(zhì)的來(lái)源情況。劉麗華等[16]認(rèn)為，Q ＞ 0.6 視為血緣單一，Q ＜ 0.6 視為具有混合來(lái)源。49 份海雀稗材料的Q 值劃分結(jié)果表明，PopⅠ亞群中各份材料只有1 份材料Q = 0.6，說(shuō)明PopⅠ亞群的種質(zhì)遺傳背景較單一，與其他亞群間的基因交流不多；PopⅡ亞群部分種質(zhì)的Q 值 ＜ 0.6，說(shuō)明種質(zhì)資源的基因滲透較高，表明其具有混合來(lái)源，遺傳背景較復(fù)雜。2 個(gè)類群中PopⅠ類群包含的海雀稗材料較多(34 份)，占供試種質(zhì)總數(shù)71.42%，其典型代表材料是647895 和647892，而其余15 份材料劃分為另一類，典型代表材料是647908 和647899。

3 討論

圖2 海雀稗種質(zhì)UPGMA 聚類Figure 2 UPGMA cluster map of seashore Paspalum

種質(zhì)資源是開展育種工作的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源利用的前提是要對(duì)其進(jìn)行多樣性分析和遺傳背景研究[17]。本研究發(fā)現(xiàn)供試海雀稗引物的多態(tài)比率為69.80%，與解新明等[4]多態(tài)比率64.77%的結(jié)果相比，本研究海雀稗種質(zhì)資源遺傳背景相對(duì)較豐富。聚類分析與群體結(jié)構(gòu)分析是進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的有效手段[18]，49 份海雀稗種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)平均值為0.67，表明49 份海雀稗種質(zhì)資源親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。對(duì)供試材料按UPGMA 進(jìn)行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)，在遺傳相似系數(shù)為0.69 時(shí)將材料分為2 大類。第Ⅰ類包含16 份材料，第Ⅱ類包含33 份材料，按UPGMA 進(jìn)行聚類分析時(shí)，其中A 類材料和B 類材料則是按UPGMA 進(jìn)行聚類分為2 大類中第Ⅰ類材料，C 類材料和D 類材料則是按UPGMA 進(jìn)行聚類分為2 大類中第Ⅱ類材料，其擬合共相關(guān)系數(shù) r = 0.669 表明聚類結(jié)果很好的體現(xiàn)了種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系。

圖3 海雀稗主成分分析Figure 3 Principal coordinate analysis of seashore Paspalum

用Structure2.3.4 軟件對(duì)49 份海雀稗材料進(jìn)行分析，K = 2 時(shí)，各群體內(nèi)海雀稗的相似值最大，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果將49 份海雀稗份材料劃分為2 個(gè)類群。PopⅠ類群包含34 份材料；PopⅡ類群包括15 份材料。當(dāng)K = 3、4、5 時(shí)，海雀稗的邊緣群體出現(xiàn)分化(圖4)。按UPGMA 進(jìn)行聚類中第Ⅰ類包含的16 份材料都包含在Structure 分析時(shí)劃分的PopⅠ類群里。

在Structure 分析時(shí)劃分的PopⅡ類群里的15 份材料全部包含于按UPGMA 進(jìn)行聚類中的第Ⅱ類中。但另有18 份材料的分類在按UPGMA 進(jìn)行聚類和Structure 分析時(shí)出現(xiàn)不一致現(xiàn)象，這18 份材料在按UPGMA 進(jìn)行聚類全部劃分在第Ⅱ類中，而Structure 分析時(shí)則全部都劃分在PopⅠ類群中。這個(gè)現(xiàn)象與主成分分析時(shí)A 類與B 類材料、C 類材料有交疊的部分，B 類和D 類中的海雀稗材料有交疊部分相呼應(yīng)。只有部分主成分聚類結(jié)果與采用UPGMA進(jìn)行聚類得出的結(jié)果一致，可能是因?yàn)橹鞒煞址治龊拖到y(tǒng)聚類分析都能對(duì)材料進(jìn)行聚類分析，但它們反映的信息卻不同[19]。

圖4 海雀稗的群體遺傳結(jié)構(gòu)Figure 4 Population genetic structure of seashore Paspalum

綜合分析49 份種質(zhì)資源在3 種劃分方法中的結(jié)果，其中4 份材料(647916、647922、647918、647917)、10 份材料(509022、647903、647906、647921、647899、647897、647913、509021、sp005、sp004)、12 份 材 料(647904、 647895、 647893、 647891、 647902、 647892、647900、 647911、 614678、 647896、 647898、 647909)、18 份材料(647907、647919、647912、647910、647920、647914、 647901、 614679、 364368、 576134、 647923、509023、509020、576138、sp001、sp002、sp006、sp007)在3 種劃分方法時(shí)都能各自聚為一類，以上4 種類型的典型代表材料分別是647918、647899、647895、647910，這與前面群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果較為一致。另有5 份材料(647908、647894、647905、647916、377709)在3 種劃分方法聚類時(shí)，在大體分類形同的情況下各自分類略有差異，這可能跟劃分的方法與關(guān)。比較聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析，群體結(jié)構(gòu)分析能夠反映出育種材料間的基因滲入和交流情況, 能夠更好地揭示材料內(nèi)在的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)于育種工作者更準(zhǔn)確掌握種質(zhì)間的遺傳關(guān)系有很大的幫助。

來(lái)自巴西的647913 和來(lái)自美國(guó)夏威夷的647897相似系數(shù)最大(0.88)，而來(lái)自美國(guó)喬治亞州的647908和美國(guó)夏威夷647896 兩份材料遺傳相似系數(shù)最小(0.53)，來(lái)自不同國(guó)家的兩個(gè)材料遺傳相似性最高，而來(lái)自同一國(guó)家的兩個(gè)材料遺傳相似性最小，目前尚缺乏明確的解釋。

4 結(jié)論

本研究利用100 對(duì)SRAP 標(biāo)記對(duì)49 份種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選獲得20 對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性好的SRAP 引物；對(duì)49 份海雀稗種質(zhì)資源進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共獲得169 個(gè)條帶，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為69.80%；平均每條引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為5.9，有效等位基因數(shù)平均值為1.83，Shannon 信息指數(shù)平均值為0.64，Nei 遺傳距離平均值為0.45。

49 份海雀稗種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)介于0.52～0.88，平均值為0.67，進(jìn)一步采用UPGMA 聚類分析、主成分分析、群體結(jié)構(gòu)分析對(duì)其進(jìn)行分類，44 份材料在3 種方法下均表現(xiàn)為較一致的分類，5 份材料表現(xiàn)出一定程度的變異，表明此研究結(jié)果反映的種質(zhì)親緣關(guān)系基本穩(wěn)定，可用于未來(lái)育種工作的親本選擇。