栽培種花生含油量QTL定位與上位性互作分析

張勝忠，胡曉輝，苗華榮，楊偉強(qiáng)，崔鳳高，邱俊蘭，陳四龍，張建成，陳靜

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.威海種子管理站，山東 威海 264200；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050035)

花生(ArachishypogaeaL. 2n=4X=40)是世界重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，是人類食用植物油的重要來源之一。當(dāng)前栽培種花生的平均含油量為51.4%，依然存在很大的提升潛力[1]。據(jù)測算，花生榨油原料中含油量每提高1%，相當(dāng)于產(chǎn)量提高2%，加工企業(yè)的效益則可提高7%以上[2]。因此，提高花生含油量，是花生遺傳改良的重要目標(biāo)。為了縮短育種進(jìn)程，分子標(biāo)記輔助育種(MAS，Marker assisted selection)已在多種作物、多種性狀的改良方面得到應(yīng)用[3-6]?；ㄉ土繉贁?shù)量性狀，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，且受環(huán)境影響較大[1，7-8]，導(dǎo)致相關(guān)基因/QTL定位難度較大，MAS在改良花生含油量方面難以有效開展。因此，開展花生含油量相關(guān)位點(diǎn)的挖掘、開發(fā)連鎖分子標(biāo)記以及克隆相關(guān)基因顯得尤為必要和迫切。

前人利用不同群體構(gòu)建遺傳圖譜，對花生含油量基因位點(diǎn)進(jìn)行了研究。Sarvamangala等[9]以TG26×GPBD4為材料構(gòu)建的圖譜包含45個SSR標(biāo)記，檢測出1個與含油量相關(guān)的主效QTL。Pandey等[10]通過構(gòu)建的2個遺傳圖譜(分別包含206，378個標(biāo)記位點(diǎn))，分別定位到6，9個含油量QTL，最大表型變異貢獻(xiàn)率(PVE，Phenotypic variance explained)分別為10.23%,14.07%。Shasidhar等[11]基于ICGV 07368×ICGV 06420的F2群體，構(gòu)建了包含854個位點(diǎn)的圖譜，共定位到8個含油量QTL，包括2個主效位點(diǎn)qOc-A10(PVE=22.11%)和qOc-A02(PVE=10.37%)。Wilson等[12]利用91個SSR標(biāo)記，對一個BC3F6群體進(jìn)行含油量基因檢測，共定位到3個QTL位點(diǎn)。Liu等[13]基于ddRAD-seq技術(shù)構(gòu)建了包含2 595個位點(diǎn)的高密度遺傳圖譜，定位到7個含油量QTL，并且將其中的穩(wěn)定主效位點(diǎn)qOCA08.1進(jìn)一步縮小至0.8 Mb區(qū)間。另外，Selvaraj等[14]利用集群分離分析法(BSA，Bulk segregant analysis)對栽培種花生性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和QTL檢測，發(fā)現(xiàn)了1個與種子含油量相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率為11.03%。黃莉等[15]通過對一個RIL群體和自然群體的含油量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定到一個與花生含油量相關(guān)SSR標(biāo)記。

隨著花生栽培種獅頭企、Tifrunner和伏花生的基因組序列陸續(xù)公布[16-18]，以栽培種花生基因組為參考，進(jìn)行相關(guān)基因/QTL定位、功能預(yù)測與分子標(biāo)記開發(fā)，將更加準(zhǔn)確和有效。目前定位到控制含油量的穩(wěn)定主效QTL依然較少，可用于育種改良的位點(diǎn)不足，仍需要對含油量新位點(diǎn)進(jìn)行挖掘。本研究以花育36號和高油品系6-13的181個F2∶7-F2∶8重組自交系為試驗(yàn)材料，開展多年份多地點(diǎn)進(jìn)行QTL定位與互作分析，提高主效QTL的真實(shí)性，為花生高油分子輔助育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以花育36號×6-13構(gòu)建的重組自交系群體(F2∶7-F2∶8)為試驗(yàn)材料，該群體包含181個家系。母本花育36號為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆大花生品種；父本6-13為高油品系。

1.2 田間種植

2017年，將材料種植于海南省三亞市南濱農(nóng)場(E1：N 18.65°，E 109.80°)。2018年，將材料種植于山東省東營市黃河三角洲現(xiàn)代農(nóng)業(yè)試驗(yàn)示范基地(E2：N 37.46°，E 118.49°)和山東省萊西市試驗(yàn)農(nóng)場(E3：N 36.86°，E 120.53°)。種植方式為起壟單行單粒覆膜播種，每個家系種植1行，每行種植10株，行距85 cm，株距15 cm，每隔20行種植一次親本，每個家系均設(shè)置3次重復(fù)。田間水肥管理等同于常規(guī)大田，及時進(jìn)行病蟲害防治。成熟后及時收獲晾曬，選擇每行中間8株用于含油量檢測。

1.3 含油量測定和數(shù)據(jù)處理

利用脂肪核磁共振分析儀(minispec mq one，Bruker Corporation)對群體各家系和親本的干種子進(jìn)行脂肪含量測定，每個家系至少測定3次重復(fù)，取平均值。利用SPSS軟件(IBM?SPSS?statistics 19)獲得群體含油量平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最小值、最大值、偏度、峰度，并進(jìn)行正態(tài)分布檢測和親本顯著性分析，利用QTL IciMapping V4.1[19]進(jìn)行方差估算，用于廣義遺傳率計算。

廣義遺傳率計算公式：h2= σg2/(σg2+σge2/n+σε2/nr)，其中h2代表廣義遺傳率，σg2代表基因型方差，σε2代表誤差方差，σge2代表基因型與環(huán)境互作方差，n代表環(huán)境數(shù)，r代表單一環(huán)境下重復(fù)數(shù)。

1.4 QTL定位

利用該RIL群體構(gòu)建的高密度SLAF-seq遺傳圖譜和表型數(shù)據(jù)，對含油量性狀進(jìn)行QTL定位分析。遺傳圖譜基于栽培種花生基因組序列構(gòu)建，共包含3 866個SNP和SSR標(biāo)記，覆蓋20個連鎖群，總圖距1 266.87 cM[20]。利用R/qtl軟件包[21]，采用復(fù)合區(qū)間CIM方法檢測不同環(huán)境下的QTL，通過CIM區(qū)間作圖法定位性狀，用PT檢驗(yàn)1 000次進(jìn)行設(shè)定閾值，首先考慮0.95置信度對應(yīng)的LOD閾值，若沒有結(jié)果則手動降低閾值到2.5。加性效應(yīng)的正和負(fù)，代表增效等位基因分別來自6-13和花育36號。利用QTL IciMapping V4.1檢測多環(huán)境下的上位性QTL，LOD大于5.0作為存在閾值，相關(guān)定位參數(shù)Step=1 cM，PIN=0.000 1。QTL的命名規(guī)則為QTL+性狀(OC，Oil content；e，Epistatic)+染色體數(shù)+同一染色體上QTL次序。

1.5 基因功能注釋

參考花生栽培種Tifrunner序列(https：//peanutbase.org)，確定主效QTL的側(cè)翼標(biāo)記物理位置?；贐lastX算法，將定位區(qū)間序列與UniProt數(shù)據(jù)庫中的Nr(Nr，Nonredundent)蛋白序列進(jìn)行比對，將比對得到的基因進(jìn)行GO(GO，Gene ontology)分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和群體含油量表型分析

對不同環(huán)境下花生親本和RIL群體含油量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)母本花育36號平均含油量為(51.50±1.53)%，父本6-13平均含油量為(59.10±1.30)%，親本間的含油量存在顯著差異(圖1、表1)。3個環(huán)境下(E1、E2、E3)RIL群體含油量變幅分別為43.18%～61.33%，46.70%～61.39%，45.83%～59.62%，存在超親遺傳。次數(shù)分布圖均呈現(xiàn)連續(xù)單峰分布(圖1)，同時K-S測驗(yàn)表明符合正態(tài)分布，含油量的廣義遺傳率為0.55 (表1)。以上結(jié)果表明，含油量滿足數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，符合QTL定位的基本要求。

表1 親本和RIL群體含油量表型統(tǒng)計分析Tab.1 Statistics of oil content in parents and the RIL population

2.2 基于RIL群體定位含油量相關(guān)QTL

利用該RIL群體構(gòu)建的高密度SLAF-seq遺傳圖譜[19]和表型數(shù)據(jù)，對含油量性狀進(jìn)行QTL定位分析。由圖2和表2所示，在E1、E2、E3環(huán)境下共定位到5個QTL，分布于第6，8，15，17染色體上，LOD值為2.85～4.67，表型貢獻(xiàn)率變幅為7.39%～17.67%。在環(huán)境E1(2017SY)，分別在第6，8染色體檢測到2個QTL，qOC6和qOC8.1，表型貢獻(xiàn)率為17.67%和9.17%。在環(huán)境E2(2018DY)，共檢測到3個位點(diǎn)，qOC8.2、qOC15和qOC17，表型貢獻(xiàn)率分別為8.83%，16.53%和7.39%。在環(huán)境E3(2018LX)，共檢測到1個位點(diǎn)qOC15，表型貢獻(xiàn)率為17.39%。其中qOC15在E2和E3環(huán)境下均可表達(dá)，覆蓋約2.8 Mb基因組區(qū)間，該位點(diǎn)對含油量影響較大且穩(wěn)定，可作為含油量育種和分子克隆的研究重點(diǎn)。qOC8.1和qOC8.2均位于第8染色體，表型貢獻(xiàn)率為9.17%,8.83%，相距約30 Mb。加性效應(yīng)絕對值變幅0.50～1.17，其中qOC6和qOC17的增效等位基因來自于母本花育36號，qOC8.1、qOC8.2、qOC15的增效等位基因來自于父本6-13。

表2 多環(huán)境下含油量性狀相關(guān)QTL定位Tab.2 QTL identification for oil content in different environments

由圖2和表3所示，基于3個環(huán)境表型數(shù)據(jù)共檢測到21對存在上位性互作的QTL，分布于第1，3，5，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20染色體，LOD值為5.01～8.22，上位性效應(yīng)對表型貢獻(xiàn)率變幅為1.24%～3.54%，其中，qOCe3.1與qOCe5.3之間的互作效應(yīng)對表型變異貢獻(xiàn)率最小，為1.24%；qOCe10與qOCe20之間的互作對表型變異貢獻(xiàn)率最大，為3.54%；qOCe5.4與qOCe9.2之間的上位性效應(yīng)最小，為-0.45；qOCe10與qOCe20之間的上位性效應(yīng)最大，為-0.94。上位性QTL與環(huán)境互作效應(yīng)在不同環(huán)境下各不相同，對表型變異的貢獻(xiàn)率變幅為0～1.67%。這21對上位性QTL共涉及16條染色體上30個位點(diǎn)，其中qOCe5.3、qOCe14、qOCe17.2、qOCe18.1、qOCe20分別與2，2，2，6，5個位點(diǎn)存在上位性互作，其他位點(diǎn)僅檢測到1個相應(yīng)互作位點(diǎn)。另外，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)qOCe8.3(Marker4924～Marker4928)與加性位點(diǎn)qOC8.2(Marker4912～Marker4928)存在重疊，表明該標(biāo)記區(qū)間內(nèi)基因可能不僅直接影響種子含油量，也可能與基因組其他位點(diǎn)互作來調(diào)控種子含油量。

表3 基于RIL群體的含油量性狀上位性QTL分析Tab.3 Identification of epistatic QTL related to oil content with the RIL population

2.3 含油量主效位點(diǎn)qOC15的基因注釋

參考栽培種基因組確定qOC15側(cè)翼標(biāo)記的物理位置(表2)。通過將該區(qū)段序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，預(yù)測候選基因的功能，共發(fā)現(xiàn)97個潛在候選基因。通過GO分析，發(fā)現(xiàn)這些基因的細(xì)胞組分分類主要為細(xì)胞組分(Cell part)和細(xì)胞(Cell)；分子功能分類主要為催化活性(Catalytic activity)和結(jié)合活性(Binding)；生物途徑分類主要為代謝過程(Metabolic process)和細(xì)胞過程(Cellular process)，可見這些基因主要參與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)催化反應(yīng)和代謝途徑(圖3)。根據(jù)GO分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)候選基因Arahy.W2PYYJ和Arahy.0GQ7VV分別編碼類絮凝蛋白(Flocculation protein)和假定蛋白(Hypothetical protein)，可能分別參與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；候選基因Arahy.8MB6Y9和Arahy.E792FE分別編碼長鏈酰基輔酶A合成酶6(Long chain acyl-CoA synthetase 6)和過氧化物酶體脂肪酸β-氧化多功能蛋白(Peroxisomal fatty acid beta-oxidation multifunctional protein)，可能分別參與脂肪酸的合成途徑和β-氧化過程(表4)。

表4 候選基因功能預(yù)測和分析Tab.4 Functional analysis of the candidate genes

3 討論

重組自交系群體是一種重要的遺傳定位群體，以其穩(wěn)定和相對豐富的遺傳基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于花生等作物重要性狀基因/QTL的定位[23-26]。已有研究表明，含油量遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，利用不同組合、不同世代的材料分析含油量遺傳規(guī)律，結(jié)論可能不同。陳四龍等[8]利用不同親本組合的F2群體對含油量進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)有的組合符合主基因+多基因遺傳特征，有的組合符合多基因遺傳特征。禹山林等和廖伯壽等[1，7]分別利用不同雜交組合，發(fā)現(xiàn)含油量受主基因+多基因控制，但是基因的效應(yīng)類型、大小不同。利用花育36號與6-13構(gòu)建了一個重組自交系群體，共包含181個家系。父本6-13含油量為59.10%，母本花育36號為51.50%，兩親本含油量存在較大差異。對該RIL群體(F2∶6)的含油量性狀進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)群體含油量符合2對主基因+多基因遺傳模型[27]。本研究發(fā)現(xiàn)RIL群體各家系含油量在不同環(huán)境(E1、E2、E3)、不同世代(F2∶7、F2∶8)下變化趨勢一致，呈近似正態(tài)分布，且存在超親遺傳，有利于對穩(wěn)定含油量QTL的檢測。

本研究在3個環(huán)境下共檢測到5個含油量相關(guān)位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率為7.39%～17.67%，其中有2個主效位點(diǎn)(qOC6和qOC15)，與遺傳分析預(yù)測結(jié)果一致[27]。本研究中含油量廣義遺傳率為0.55，表明含油量受環(huán)境影響較大，導(dǎo)致不同環(huán)境QTL定位結(jié)果存在較大差異，其中E1環(huán)境下檢測到2個位點(diǎn)，環(huán)境E2定位到3個位點(diǎn)，而E3環(huán)境下僅檢測到1個位點(diǎn)。這些QTL中，僅主效位點(diǎn)qOC15可在2個環(huán)境(E2、E3)下穩(wěn)定表達(dá)，而其他位點(diǎn)的表達(dá)均受特定環(huán)境的影響。在E1和E2環(huán)境下，在第8染色體上共檢測到2個位點(diǎn)，qOC8.1和qOC8.2，兩者相距約30 Mb。Liu等[13，17]前期利用徐花13號×中花6號的RIL群體在第8染色體定位到一個穩(wěn)定主效位點(diǎn)qOCA08.1，其物理位置(參考Tifrunner基因組)為42.21～44.53 Mb，與qOC8.2的相距較近。由于qOC8.2僅在一個環(huán)境下被檢測到，兩者是否為同一位點(diǎn)，有待進(jìn)一步確認(rèn)。Pandey等和Shasidhar等[10-11]分別在A6、A8、B7和A8連鎖群也檢測到含油量相關(guān)位點(diǎn)，由于缺乏共有標(biāo)記或是無法確定這些位點(diǎn)側(cè)翼標(biāo)記的物理位置，因而難以與本研究結(jié)果進(jìn)行比較分析。此外，Liu等[13]第15染色體上定位到2個相鄰QTL，qOCB5.1和qOCB5.2，其物理位置分別為7.89～8.82，9.73～10.58 Mb[17]，與本研究中的qOC15(18.52～21.36 Mb)相隔約8 Mb。因此，qOC15可能是控制含油量的新位點(diǎn)，可通過開發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記輔助花生含油量性狀改良。

對qOC15區(qū)間內(nèi)基因進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因參與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)催化反應(yīng)和代謝途徑。前人研究表明，植物體內(nèi)油脂含量受多種途徑調(diào)控，包括油脂合成途徑、降解途徑和運(yùn)輸途徑，而這些過程受到具有不同催化性質(zhì)的酶類的調(diào)節(jié)，包括合成酶、連接酶、脫氫酶、酰基轉(zhuǎn)移酶等[28-32]。本研究在qOC15區(qū)間發(fā)現(xiàn)了4個潛在的候選基因，Arahy.W2PYYJ、Arahy.0GQ7VV、Arahy.8MB6Y9和Arahy.E792FE，GO分析推測這些基因分別參與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝與脂肪酸的合成和降解。這些候選基因分子生物學(xué)功能以及對含油量的影響，有待后續(xù)研究驗(yàn)證。

上位性互作是數(shù)量性狀遺傳的重要方面，對解析復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)具有十分重要的意義[33-34]。前人研究發(fā)現(xiàn)，QTL上位性互作包括3種類型：主效應(yīng)QTL之間互作(類型Ⅰ)；主效應(yīng)QTL與背景位點(diǎn)間互作(類型Ⅱ)；互補(bǔ)位點(diǎn)間互作(類型Ⅲ)，3種類型的上位性互作，可能與基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[35-36]。例如大豆中I位點(diǎn)和K1位點(diǎn)存在上位性互作，主要是K1位點(diǎn)的功能基因，可通過影響小RNA來調(diào)控I位點(diǎn)功能基因的表達(dá)，進(jìn)而影響大豆種皮顏色[37]。本研究共檢測到21對上位性互作，其中5個標(biāo)記區(qū)間與其他至少2個位點(diǎn)存在上位性互作，表明花生含油量遺傳存在復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中多數(shù)上位性QTL互作屬于類型Ⅲ，即無單獨(dú)個體效應(yīng)的QTL間的互作。而由于qOCe8.3(Marker4924～Marker4928)與主效應(yīng)位點(diǎn)qOC8.2(Marker4924～Marker4928)區(qū)間存在重疊，qOCe8.3參與的互作應(yīng)屬于類型Ⅱ，表明該區(qū)間功能基因不僅可能直接影響種子含油量，也可能與其他位點(diǎn)互作來調(diào)控含油量。因此，在花生含油量育種中，既要考慮聚合主效QTL的作用，也要考慮上位性QTL互作對含油量的影響。

本研究基于RIL群體多環(huán)境下含油量數(shù)據(jù)，鑒定了5個花生含油量相關(guān)的主效應(yīng)QTL和21對上位性位點(diǎn)，明確了不同遺傳效應(yīng)對含油量的影響，并對一個穩(wěn)定主效位點(diǎn)qOC15進(jìn)行了候選基因功能注釋，鑒定了4個可能參與油脂合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的候選基因，為花生后續(xù)含油量分子育種和功能研究提供了重要基礎(chǔ)。