馬鴻程，熊顯榮，，王 晗，海 卓，閔星宇，李 鍵，

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041；3.動物科學國家民委重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)主要活動于我國海拔3 000 m以上的高原地區(qū)，其對低氧惡劣生存環(huán)境具有極強的適應性，是當?shù)啬撩裆a(chǎn)生活資料的重要來源之一。然而牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對緩慢，嚴重限制當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展速率，其主要原因在于牦牛性成熟時間晚、繁殖周期長，繁殖性能較普通黃牛低下[1]。因此，開展牦牛繁殖方面的研究對豐富我國遺傳資源多樣性以及提高當?shù)啬撩竦纳钏骄哂兄匾膬r值。

卵巢是雌性哺乳動物重要的生殖器官，其主要作用是支持卵泡發(fā)育以及卵母細胞的生長和成熟[2]。原始卵泡激活、發(fā)育以及排出優(yōu)質卵母細胞是維持雌性牦牛生育力的必要條件[3]。研究發(fā)現(xiàn)，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路在內(nèi)的多種細胞內(nèi)信號通路對卵巢相關活動具有重要調(diào)控作用[4]。PI3K是一種特異性催化磷脂酰肌醇脂物質的激酶，作為PI3K-AKT信號通路上游關鍵分子，其主要有ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ 3型同工酶，ClassⅠ又分為ⅠA和ⅠB 2個亞類[5-6]。目前，人們研究最廣泛的是由調(diào)節(jié)亞單位p85與催化亞單位p110組成的ⅠA型異二聚體蛋白，其催化亞單位包括p110α、β、δ 3種，其中p110β由PIK3CB基因編碼[7-8]。當相應的配體將酪氨酸激酶受體(RPTK)激活后，招募脂酶PI3K到細胞內(nèi)膜下并將其激活，激活的PI3K通過磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，與細胞內(nèi)AKT及3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)等含有PH結構域的蛋白結合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的第308位蘇氨酸(Ter)導致AKT的活化，此外mTORC2也能在473位絲氨酸(Ser)磷酸化AKT進而使其到達完全活化的狀態(tài)，活化的AKT通過激活下游靶蛋白或者抑制下游靶蛋白活性，包括TSC2、FOXOs、P27及BAD等，進而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、存活及遷移等活動[9-10](圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除PI3K-AKT通路反向因子磷酸酶-張力蛋白同源物(PTEN)后，PI3K持續(xù)激活，使原始卵泡池中的卵泡過度激活，導致敲除小鼠卵巢早衰，證明該通路參與卵泡發(fā)育調(diào)控[11]。在關于PI3K催化亞基的研究中，李倩[12]發(fā)現(xiàn)，PI3K信號p110δ催化亞基在介導FSH及E2等外源性激素引起的小鼠卵泡發(fā)育中起重要作用，p110δ缺失后影響有腔卵泡中顆粒細胞的增殖分化；另有研究表明，PI3K催化亞單位p110β通過與細胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42，Cdc42)結合，調(diào)節(jié)卵母細胞中PTEN的表達，從而調(diào)控小鼠原始卵泡的激活過程[13]。

目前，關于PIK3CB基因的研究主要集中在癌癥方面[14-15]，在卵巢組織及其功能中的研究較少。而其作為PI3K的催化亞單位之一，是否參與牦牛生長期卵泡發(fā)育調(diào)控仍未知。因此，本研究以牦牛為對象進行PIK3CB基因CDS區(qū)序列擴增，分析其在各組織中的相對表達量，同時對處于不同發(fā)育階段牦牛卵泡壁層顆粒細胞及卵母細胞中的表達規(guī)律進行檢測及分析，為深入研究PIK3CB基因在PI3K-AKT信號通路介導的卵泡發(fā)育等方面的作用機制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

TRIzol Reagent 從美國Invitrogen公司購入；核酸助沉劑購自百泰克公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反轉錄試劑盒、pMD19-T載體的生產(chǎn)公司為TaKaRa；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)由南京諾唯贊提供；膠回收試劑盒購自康寧生命科學有限公司；感受態(tài)細胞DH5α從天根生化科技有限公司購入；0.5%透明質酸酶(0.5 g透明質酸酶粉末、100 mL Medium199)及卵母細胞成熟液(OM培養(yǎng)液)從賽默飛購入。

1.2 樣本采集及處理

牦牛各組織樣本均從四川省廣漢市屠宰場采集。3～5歲健康牦牛(雌性，n=6，隨機分為3組，每一組2頭牦牛組織樣本混合為一個生物學重復)，屠宰后立即無菌采集卵巢、子宮、胃、小腸、肌肉、心臟、肝臟、脾、肺臟、腎臟10個組織，剪成約1 cm3的組織塊，迅速裝入提前編號的凍存管中，并投入液氮罐中帶回實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

用加有雙抗(80 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的生理鹽水將采集到的部分卵巢沖洗干凈投入保溫瓶(含25 ℃生理鹽水、雙抗)中于3 h內(nèi)帶回實驗室。用37 ℃生理鹽水(含雙抗)將卵巢沖洗數(shù)遍，根據(jù)卵泡直徑大小將卵泡分為大(≥7 mm)、中(3.0～6.9 mm)、小(≤2.9 mm)3組，用12號針頭注射器抽取卵泡液置于90 mm平皿，在體視顯微鏡下按組收集卵丘-卵母細胞復合物(Cumulus-oocyte complex，COCs)，使用卵母細胞成熟液洗數(shù)遍后0.2%透明質酸酶脫顆粒分離出卵母細胞，每組15枚。各組卵泡液離心后得到卵泡壁顆粒細胞，用PBS洗滌數(shù)次后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取及反轉錄

收集的各組卵母細胞嚴格按照Single Cell-to-CTTMKit試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照TRIzol法說明書步驟提取牦牛各組織以及卵泡壁顆粒細胞總RNA，使用核酸濃度儀檢測所提取RNA OD值和濃度后，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒說明書將范圍在OD=1.8～2.0的RNA模板合成cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計及合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫所公布黃牛(Bostaurus)PIK3CB基因的mRNA序列(NM-001206047.1)及GAPDH基因mRNA序列(AC-000162.1)，利用NCBI在線工具包設計PCR擴增引物和熒光定量引物，并交由金斯瑞生物科技公司(南京)合成，序列見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.5 牦牛PIK3CB基因擴增克隆

牦牛卵巢cDNA作為模板，PIK3CB基因擴增體系25 μL：12.5 μL Premix TaqTMDNA聚合酶，分別1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA模板，ddH2O補足到25 μL。反應條件為95 ℃預變性(4 min)；95 ℃變性(45 s)，60 ℃退火(45 s)，72 ℃延伸(1 min)，30個循環(huán)；72 ℃延伸(7 min)，4 ℃保存。PCR擴增結果通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將符合條件的目的條帶使用膠回收試劑盒純化回收，對目的產(chǎn)物經(jīng)過連接轉化后，篩選出至少3個陽性克隆。樣品送上海生工生物工程有限公司(成都)測序。

1.6 牦牛PIK3CB基因生物信息學分析

使用NCBI中Blast以及OFR Finder工具包對測序得到的牦牛PIK3CB基因序列進行同源性以及開放閱讀框分析，通過MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹。ExPASY在線軟件Protparam、TMHMM、SignalP、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL工具包分別對牦牛PIK3CB蛋白的理化性質、跨膜區(qū)、信號肽、疏水性、二級結構及三級結構進行預測分析；NCBI中在線程序CDD進行PIK3CB蛋白結構域預測。

1.7 牦牛PIK3CB基因組織表達譜分析

以GAPDH為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR方法檢測PIK3CB基因在牦牛卵巢、子宮、胃、小腸、肌肉、肝臟、心臟、脾、腎臟、肺臟中的表達情況。檢測前將所有組織cDNA模板濃度調(diào)整一致(40 ng/μL)，以保證數(shù)據(jù)準確。反應體系為15 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)，0.5 μL下游引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA模板，5.5 μL ddH2O。反應條件為95 ℃預變性(4 min)；95 ℃變性(45 s)，60 ℃退火(1 min)，72 ℃延伸(1 min)，38個循環(huán)；72 ℃(7 min)。引物見表1，重復3次。

1.8 牦牛PIK3CB基因在卵泡發(fā)育過程中的表達

GAPDH作為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR方法檢測不同大小牦牛卵泡壁顆粒細胞及卵母細胞中PIK3CB基因mRNA的表達。反應體系及反應條件同1.7。

1.9 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復3次，熒光定量結果用2-ΔΔCt均一化處理，通過SPSS 18.0軟件進行方差分析，ANOVA進行顯著性差異分析。其中P>0.05、P<0.05、P<0.01分別為差異不顯著、差異顯著、差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛PIK3CB基因序列

牦牛PIK3CB基因經(jīng)過RT-PCR法擴增，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增結果進行檢測。結果得到如圖2所示條帶，與預期大小基本一致。篩出的陽性菌液測序后得到牦牛PIK3CB基因核苷酸序列3 326 bp，其中包括可編碼1 070個氨基酸的CDS區(qū)3 213 bp。

2.2 PIK3CB基因核苷酸氨基酸比對

通過NCBI在線工具包對測定序列編碼區(qū)與黃牛(NM-001206047.1)的PIK3CB基因編碼區(qū)序列進行比對，結果二者同源性為99.8%，且測得序列編碼區(qū)與黃牛編碼區(qū)序列相比，有4處堿基發(fā)生突變，引起密碼子發(fā)生變化(AAG→CAG、TCC→TCA、AGG→GGA、ACT→ACC)，其中第1,3個密碼子改變導致第147,526位氨基酸變化由K→Q、R→G。與野牦牛(XM_005908937.1)編碼區(qū)對應序列相比，同源性為99.9%，氨基酸序列無變化。

2.3 牦牛PIK3CB基因與其他物種同源性比對

使用NCBI在線工具包對所測核苷酸序列與黃牛(Bostaurus，NM-001206047.1)、野牦牛(BosmutusXM_005908937.1)、山羊(Caprahircus，XM_018049899.1)、人(Homosapiens，KJ891808.1)、大猩猩(Pantroglodytes，XM_003950204.3)、歐洲野豬(Susscrofa，XM_021069524.1)、小鼠(Musmusculus，XM_011242829.3)、駱駝(Camelus，XM_031443314.1)、原雞(Gallusgallus，XM_015276908.2)、澳洲野犬(Canislupusdingo，XM_025449126.1)的PIK3CB對應核苷酸序列同源性進行比對。結果表明，測序所得牦牛PIK3CB基因序列與野牦牛和黃牛的同源性最高，分別為99.9%，99.8%；與山羊、歐洲野豬、駱駝的同源性也較高(圖3)。表明PIK3CB基因在哺乳動物長期進化過程中具有較高的保守性。

利用MEGA 7.0對包括牦牛在內(nèi)的12個物種PIK3CB基因CDS區(qū)進行遺傳進化樹構建分析。結果顯示，牦牛與野牦牛、黃牛的親緣關系最近，其次是山羊；同時與大猩猩、歐洲野豬、小鼠、人、駱駝和澳洲野犬形成一個分支；與原雞的親緣關系較遠(圖4)。

2.4 牦牛PIK3CB蛋白結構和功能預測

利用ExPASY在線工具包預測PIK3CB蛋白理化性質，結果表明，該蛋白原子總數(shù)為17 340，分子量為122.8 ku，分子式為C5537H8708N1458O1580S57。預計半衰期為30 h，脂肪族指數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、理論等電點及親水性平均值分別為94.83，45.42，6.51和-0.205，因此推測牦牛PIK3CB蛋白為親水酸性蛋白。PIK3CB蛋白共包含有20種氨基酸，出現(xiàn)頻率較高的有Glu(8.4%)、Pro(8.2%)、Ser(8.0%)、Ale(7.5%)、Gly(7.0%)、Leu(7.0%)。所有氨基酸中帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為128個，帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為134個，由此知PIK3CB蛋白整體上帶負電。

通過ProtScale在線進行親疏水性預測，表明PIK3CB蛋白親水性在第1 003，1 004位最大為2.722，第500位氨基酸最小為-2.678，且多數(shù)氨基酸的親水性分值小于零，即具有親水性，與理化性質分析結果一致。SignalP、TMHMM工具包信號肽、跨膜區(qū)分析預測，結果表明，該蛋白無信號肽、無跨膜結構。NCBI在線軟件CDD工具包分析該蛋白結構域，預測得該蛋白共包含5個結構域，其中第42-117位氨基酸為P85結合域(ABD)，第180-288位氨基酸為Ras結合域(RBD)，第324-501位氨基酸為C2結構域，第532-702位氨基酸為Ⅰ型PI3K輔助結構域，第706-1 067位氨基酸為p110β催化結構域(圖5)。牦牛PIK3CB蛋白二級結構預測顯示，該蛋白含492個α-螺旋占45.98%，52個β-折疊占4.86%，365個無規(guī)卷曲占34.11%，161個延伸鏈占15.05%，可推測出，α-螺旋和無規(guī)卷曲為該蛋白二級結構主要組成原件，與該蛋白三級結構預測結果一致(圖6)。

2.5 牦牛PIK3CB基因mRNA組織表達譜

利用RT-qPCR方法檢測牦牛不同組織中PIK3CB基因mRNA的表達。結果顯示，PIK3CBmRNA在所檢測牦牛相關組織中均有表達，但各組織間表達量存在差異(圖7)。其中，脾臟、子宮以及卵巢組織中表達量較高，顯著高于小腸、肌肉、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、胃組織(P<0.05)。

2.6 不同發(fā)育階段牦牛卵泡中PIK3CB mRNA表達分析

以內(nèi)參基因GAPDH作為參照，利用RT-qPCR方法檢測不同發(fā)育階段牦牛卵泡中壁顆粒細胞及卵母細胞PIK3CB基因的表達情況(圖8)。結果顯示，隨著卵泡發(fā)育，壁顆粒細胞中PIK3CB基因mRNA表達量呈上升趨勢，且大、中級別卵泡中的表達量極顯著高于小卵泡中的表達量(P<0.01)(圖8-A)；卵母細胞中PIK3CB基因 mRNA相對表達量整體隨卵泡發(fā)育程度呈下降趨勢，但各級別卵泡中的相對表達量差異不顯著(P>0.05)(圖8-B)。

3 討論與結論

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)作為一種特異性催化磷脂酰肌醇脂物質的激酶，同蛋白激酶B(AKT)形成PI3K-AKT信號通路，直接或間接參與細胞增殖、遷移、黏附等生物學過程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號通路參與雌性動物一系列生殖調(diào)控，包括卵子發(fā)生、原始卵泡激活、卵泡發(fā)育、卵母細胞減數(shù)分裂及早期胚胎發(fā)育過程[17-20]。PIK3CB是組成PI3K的催化亞基之一，由受體蛋白酪氨酸激酶(RPTK)激活[21]，在該通路相關調(diào)控中起著重要的作用。目前，牦牛PIK3CB基因結構功能及其在雌性生殖中的作用依舊未知。本試驗首次克隆了牦牛PIK3CB基因，并對其結構功能進行了預測。與黃牛PIK3CB基因編碼區(qū)相比，牦牛對應序列出現(xiàn)5處堿基突變，致使2處氨基酸位點發(fā)生改變，但這種突變的具體影響有待進一步研究。預測得到牦牛PIK3CB蛋白具有典型的ⅠA型PI3K結構域。其中ABD結構域與調(diào)節(jié)亞單位p85的iSH2結構域通過非常緊密的相互作用，結合形成異源二聚體蛋白PI3K，RBD結構域與Ras超家族GTP酶相互作用，發(fā)揮其相關功能，而C2結構域是Ca2+依賴性的膜靶向結構域，可結合包括磷脂、肌醇多磷酸酯及細胞內(nèi)蛋白質在內(nèi)的多種物質[22]；同時通過與NCBI上公布的多個物種進行CDS區(qū)同源性比對，發(fā)現(xiàn)牦牛與野牦牛(99.9%)和黃牛(99.8%)同源性較高，與進化樹親緣關系吻合，進一步表明PIK3CB催化亞單位在哺乳動物中具有較高的保守性。

組織表達譜的結果顯示，PIK3CBmRNA廣泛表達在牦牛各組織器官中。研究發(fā)現(xiàn)ClassⅠ型PI3K催化亞基中除了p110γ只在白細胞中特異性表達外，其余包括p110β在內(nèi)的幾種亞基均在全身各組織中廣泛表達，并在細胞內(nèi)信號通路中發(fā)揮作用[23]，這與本研究結果相近。PIK3CB在牦牛各組織中的相對表達量呈現(xiàn)不同程度的差異，尤其在脾臟、子宮及卵巢中高表達。研究表明p110β在免疫復合物激活中性粒細胞中起關鍵作用[24]，而免疫器官脾臟中存在大量的中性粒細胞，因此PIK3CB基因在脾臟中高表達可能與其參與免疫調(diào)節(jié)活動有關，此問題有待進一步驗證。同時大量研究證明，PI3K信號通路在生殖活動中起重要作用，PIK3CB在子宮及卵巢中高表達提示其在PI3K信號通路介導的卵巢相關功能中扮演重要角色。

哺乳動物卵泡發(fā)育起始于胎兒時期，這是一個連續(xù)的、選擇性的過程，直到初情期后部分卵泡開始逐漸成熟并排卵[25-26]。包括卵泡壁顆粒細胞在內(nèi)的多種體細胞通過間隙連接，在各種激素、蛋白質、細胞因子及卵泡內(nèi)外環(huán)境的共同調(diào)控下直接或間接的參與卵泡發(fā)育[27]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K信號通路參與嚙齒動物卵泡顆粒細胞增殖分化過程調(diào)控，小鼠顆粒細胞在FSH刺激后AKT被磷酸化激活，并在顆粒細胞分化為排卵前表型時達到高峰[28]。當PTEN從顆粒細胞中敲除時，PI3K-AKT通路被過度激活導致結構性黃體溶解受到抑制，顆粒細胞增殖加強，卵泡生長并增加排卵率[29]。為了進一步探索PIK3CB參與的PI3K-AKT通路在牦牛生殖過程中的作用，本試驗運用RT-qPCR方法對牦牛不同發(fā)育階段卵泡中PIK3CB表達量進行了檢測，結果表明，PIK3CBmRNA在牦牛大、中、小各級卵泡壁顆粒細胞及卵母細胞中均有表達。在顆粒細胞中，PIK3CB基因 mRNA表達量隨卵泡發(fā)育呈上升趨勢，且大、中級別卵泡中的表達量極顯著高于小卵泡中的表達量(P< 0.01)。卵泡中顆粒細胞增殖分化是卵泡生長發(fā)育的必要前提[27]。Guillermet-Guibert等[30]研究表明，p110β通過被G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)異源三聚體(Gβγ)激活來發(fā)揮其在PI3K-AKT信號轉導中的作用。同時Law等[31]研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)激動劑促卵泡激素(FSH)促進蛋白激酶A(PKA)依賴性的胰島素受體底物1(IRS1)在酪氨酸殘基上的磷酸化，從而激活PI3K，使PI3K-AKT信號通路活化進而促進顆粒細胞分化。因此，推測在大、中級別卵泡中PIK3CBmRNA高表達是由于其誘導壁顆粒細胞增殖分化的能力增強，加快卵泡發(fā)育進程。在各級別卵泡卵母細胞中PIK3CB基因 mRNA同樣均有表達，且整體隨卵泡發(fā)育程度呈下降趨勢，但其相對表達量差異不顯著(P>0.05)。研究證實卵母細胞內(nèi)的PI3K信號對原始卵泡的存活和激活是必不可少的[11-13]，但在生長期卵泡中并不是必需的，當PTEN[18]及PDK1[32]從生長期卵泡的卵母細胞中敲除時，卵泡發(fā)育、排卵、卵母細胞成熟和生育力均沒有發(fā)生改變。因此，推測卵母細胞中PIK3CB表達是由于在原始卵泡激活過程中mRNA的儲存，而對激活后生長期卵泡的發(fā)育，顆粒細胞中的PIK3CB比卵母細胞內(nèi)的PIK3CB更重要。綜上所述，PIK3CB基因參與誘導顆粒細胞增殖，其對卵泡發(fā)育過程至關重要。

本試驗克隆獲得了牦牛PIK3CB基因序列，其在哺乳動物進化過程中高度保守。PIK3CB基因mRNA在牦牛不同大小級別卵泡壁顆粒細胞及卵母細胞中均有表達，其中顆粒細胞在中、大卵泡中高表達，卵母細胞在各級別卵泡中的表達差異不顯著。表明PIK3CB基因參與PI3K-AKT介導的卵泡發(fā)育調(diào)控，是PI3K信號通路在調(diào)節(jié)顆粒細胞的功能中不可或缺的催化亞基之一，具體調(diào)控機制有待進一步研究。本研究為深入探討PI3K-AKT信號通路在卵巢發(fā)育中的調(diào)控機理提供基礎資料。