陳一新，陳欠林，鄒莞杰，何余湧*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學江西省動物營養(yǎng)重點實驗室/營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，江西南昌330045；2.宜春市農(nóng)業(yè)科學院)

肺是呼吸系統(tǒng)重要組成部分，是主要的氣體交換場所。肺的發(fā)育通常被劃分為胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期、肺泡期5個時期，受多種信號調(diào)控。肺發(fā)育異常會導致呼吸系統(tǒng)疾病，使用后天手段很難修復。維生素A是脂溶性必須營養(yǎng)素，其活性產(chǎn)物維甲酸(retinoic acid,RA)在肺發(fā)育中起重要作用。因此，本文就維生素A及其維甲酸信號通路在哺乳動物肺發(fā)育研究進展進行綜述，以期為進一步深入研究其在肺發(fā)育中的機理及提高動物健康生產(chǎn)提供參考。

1 肺的形成與發(fā)育

呼吸系統(tǒng)由前腸腹側(cè)內(nèi)胚層的一小群細胞發(fā)育而來，肺的上皮來自內(nèi)胚層，間質(zhì)來源中胚層。前腸腹側(cè)轉(zhuǎn)錄因子NKX同源框-1(NK2 homeobox 1,Nkx2-1)的表達可作為呼吸系統(tǒng)發(fā)生的標志。Nkx2-1+內(nèi)胚層細胞向外翻出形成原始氣管和兩個肺芽。肺芽形成后在中胚層信號的調(diào)控下向周圍間質(zhì)延伸，肺芽分支產(chǎn)生了廣泛的樹枝狀氣道，這對于產(chǎn)生大的呼吸表面積是至關(guān)重要的。這些分支的遠端發(fā)育形成許多肺泡前體小囊，并與共同發(fā)育的血管緊密相連。在肺發(fā)育的最后肺泡化階段隔膜從囊壁生長，將遠端的球囊細分為肺泡，從而增加氣體交換的表面積，并伴隨微血管的成熟[1]。

2 維生素A代謝及維甲酸信號

細胞質(zhì)內(nèi)的維生素A（視黃醇）在視黃醇脫氫酶10(retinol dehydrogenase-10,RDH10)作用下產(chǎn)生視黃醛，視黃醛又在視黃醛脫氫酶(RALDH-1,RALDH-2,RALDH-3)作用下產(chǎn)生維甲酸，而肺上皮細胞內(nèi)過量的維甲酸則通過細胞色素P450 26(cytochromeP450 26,CYP26)酶系來分解，因為CYP酶能將過量的維甲酸迅速降解而使維甲酸不會過量累積[2]，從而使肺上皮細胞內(nèi)的維甲酸含量保持在正常生理功能范圍內(nèi)。細胞內(nèi)的維甲酸被細胞維甲酸結(jié)合蛋白(cellular retinoic acid binding protein,CRABP)運輸?shù)郊毎藘?nèi)與維甲酸受體(retinoic acid receptors,RARs)結(jié)合后再與維甲酸X受體(retinoid X receptor,RXR)形成異源二聚體，然后與目的基因的維甲酸反應元件(RA response elements,RAREs)結(jié)合，在核受體輔助激活因子 (nuclear receptor co-activator,NCOA)或核受體輔助抑制因子(nuclear receptor co-repressor,NCOR)與RAR作用下激活或抑制轉(zhuǎn)錄[3]。

3 維生素A與肺發(fā)育

維生素A缺乏會引起呼吸道上皮細胞角質(zhì)化，使纖毛細胞和杯狀細胞脫落，引發(fā)下呼吸道感染肺內(nèi)I型和IV型膠原增加，同時肺泡基底膜厚度增加一倍，內(nèi)部似乎有I型膠原纖維的異位沉積。維生素A參與肺表面活性物質(zhì)的合成，如果妊娠期缺乏維生素A，那么胎肺的表面活性物質(zhì)合成就會降低并導致胎肺畸形[4]。維甲酸能促進胎肺的分支形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)重構(gòu)、參與肺的模式形成及氣道發(fā)育中平滑肌細胞的分化和肺泡化以及平衡肺液的分泌和吸收[5]。在缺乏維甲酸的情況下，由于維甲酸下游分子網(wǎng)絡中FGF(fibroblast growth factor)基因、Sonic Hedgehog(SHH)基因、WNT(Wingless/Integrated)基因和HOX(Homeobox)基因的干擾，內(nèi)胚層就不能正常分化出肺芽原基而阻礙胎肺的正常形成與發(fā)育。缺乏維甲酸還會導致囊泡和肺泡中的表面活性物質(zhì)及彈性蛋白含量下降。

4 維甲酸調(diào)節(jié)肺發(fā)育的機制

4.1 維甲酸對肺發(fā)生的影響

RA在肺發(fā)生過程中具有多種作用，最初促進側(cè)板中胚層形成，RDH10和RALDH2敲除胚胎后部中胚層表達的心臟神經(jīng)嵴衍生物表達蛋白1(heart and neural crest derivatives expressed 1,hand1)在前腸異常表達和前腸中胚層表達的間充質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白F1(forkhead box F1,Foxf1)缺失，外源RA可修復這種異常。RA已被證明是Hh上游信號[6]，RA能促進內(nèi)胚層Hh配體表達，RA缺陷胚胎內(nèi)胚層Hh配體形成大量降低位于側(cè)板中胚層的下游轉(zhuǎn)錄因子GLI家族鋅指蛋白1(GLIfamily zinc finger 1,gli1)表達下降。內(nèi)胚層Hh信號作用于側(cè)板中胚層促進Wnt2/2b和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,Bmp4)表達，Wnt2/2b和Bmp4抑制轉(zhuǎn)錄因子sox2 (SRY-box transcription factor 2,sox2)在前腸內(nèi)胚層表達，這對食管和氣管的分離是至關(guān)重要的。此外，內(nèi)胚層細胞受RA調(diào)節(jié)產(chǎn)生Nkx2-1+肺祖細胞，中胚層Wnt和Bmp與肺祖細胞反應啟動肺發(fā)生[7].RA調(diào)節(jié)內(nèi)胚層細胞Nkx2-1表達的機制有待進一步研究。

中胚層FGF10信號是誘導肺芽形成的重要因子，前腸體外培養(yǎng)實驗中在RAR拮抗劑(BMS493)作用下因來源于中胚層的FGF10缺失而無法誘導形成肺芽[8],Raldh2-/-動物RA合成受抑制，前腸腹側(cè)肺發(fā)生區(qū)域標志蛋白Nkx2-1幾乎無法產(chǎn)生，同時FGF10信號缺失導致肺發(fā)生受阻，這些缺陷能被外源RA修復。外源維甲酸能誘導FGF10產(chǎn)生，Raldh2-/-肺內(nèi)皮前體細胞在外源性FGF10刺激下發(fā)生分化[9]。阻斷RA信號，前腸內(nèi)胚層轉(zhuǎn)化生長因子(transfor-ming growth factor-β,TGF-β)通路被激活[10]內(nèi)源性Wnt信號拮抗物Dickkopf相關(guān)蛋白1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1,Dkk1)表達升高，通過產(chǎn)生外源Wnt3a或使用TGF-β抑制劑只能修復一側(cè)肺芽，共同作用下能誘導形成兩側(cè)肺芽。而RA處理能通過抑制Dkk1促進WNT表達，并同時抑制TGF-β信號，最終促進FGF10表達，產(chǎn)生肺芽[11]。

HOXA1在肺發(fā)育早期表達，RARE存在于HOXA1啟動子，HOXA1受RA直接調(diào)控[12]，HOXA1和配對盒基因1/2 (Pbx homeobox protein,Pbx)對Raldh2表達和維甲酸活性起作用，Pbx1/2 null胚胎因器官發(fā)育缺陷死亡[13]，與RA缺陷表型類似。HOXA1缺陷導致的表型異?？杀粊喼禄康耐庠碦A部分修復[14]。Antonio Vitobello等通過免疫共沉淀鑒定了一個特異的Raldh2增強子[15]，該增強子含有一個HOX-PBX二段元件，與HoxA1-Pbx1/2-Meis2復合物結(jié)合，并需要在內(nèi)源性Raldh2啟動子的背景下維持正常表達水平。Guangsong Su等使用CRISPR/Cas9敲除胚胎干細胞HOXA1的一個增強子抑制了RA誘導的HOXA1表達[16]，CRABP1和控制內(nèi)胚層發(fā)育基因表達降低。HOXA1突變豬胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，HOXA1突變導致CRABP1表達下調(diào)和CYP26A1表達上升[17]，另外，HOXA1突變導致早期胚胎內(nèi)胚層分化相關(guān)基因表達異常，使得內(nèi)胚層分化出現(xiàn)異常，初生動物呼吸急促并在圍產(chǎn)期死亡[18～19]。HOXA1是維甲酸的目標基因,Bony De Kumar等對胚胎干細胞使用全基因組分析發(fā)現(xiàn)SOX2是HOXA1的直接作用基因[20]，SOX2在肺上皮細胞表達,對食管氣管分離起重要作用,維甲酸是否通過影響HOXA1調(diào)節(jié)SOX2表達有待進一步研究。

4.2 維甲酸對肺氣道生長的影響

肺芽形成后，通過域分支，平面分叉和正交分叉三種分支模式向周圍生長[21]，肺芽遠端中胚層產(chǎn)生的FGF10信號是誘導肺分支的重要因子,側(cè)芽出現(xiàn)后遠端氣道間質(zhì)RALDH-2表達降低，維甲酸信號拮抗物COUPTF-II表達升高,RA水平降低,RAR活性受抑制以允許肺分支相關(guān)基因表達,如Fgf10和Bmp4[22]。使用RAR拮抗物降低了肺分支抑制基因TGF-β3、叉頭框架蛋白A2(forkhead box A2,Foxa2)在氣道近端表達[23]。雞肺體外培養(yǎng)實驗補充RA后，SOX2的表達水平幾乎保持不變，氣道遠端SOX9的表達水平以一種劑量依賴的方式下降，F(xiàn)GF10和FGFR2輕度下降，導致遠端上皮多功能祖細胞的減少，并誘導近端分化[24]。

氣道發(fā)育伴隨著來源于間充質(zhì)的平滑肌發(fā)育，域分支中平滑肌較固定地在分支底部分化，平滑肌減少會導致異常分支，平滑肌增加會抑制分支起始和延伸[25]。內(nèi)源性RA能抑制氣道分支遠端平滑肌分化，RA缺乏狀態(tài)下發(fā)育中的肺氣道平滑肌分化相關(guān)基因平滑肌肌動蛋白α2(actin alpha2,smooth muscle,Acta2)和肌球蛋白重鏈11 (myosin heavy chain 11,Myh11)等表達增加,氣道平滑肌過度分化并在氣道最遠端芽的莖部區(qū)域表達，這種異常改變在出生后持續(xù)存在[26]。氣道平滑肌中RA信號的中斷導致TGF-β配體產(chǎn)生增加，繼而TGF-β通路過度激活，阻斷TGF-β通路可以阻止RA缺乏引起的平滑肌表型改變[27]。

RA處理培養(yǎng)的E17大鼠肺組織塊后，Hox A5、B5和B6mRNA水平顯著增加，且呈劑量和時間依賴性,RA還能通過上調(diào)肺HOXB5蛋白表達影響肺分支[28～29]。

4.3 維甲酸對肺泡發(fā)育的影響

在整個小管期和囊泡期，末端管轉(zhuǎn)變成由初級隔膜分隔的小球囊。在肺泡發(fā)生過程中，囊被次生脊分割。肌成纖維細胞前體細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和脂成纖維細胞覆蓋次級隔膜，基質(zhì)蛋白(如彈性蛋白)沉積在頂端[30]。隨著肺泡的成熟，周圍的毛細血管重塑，內(nèi)皮細胞位于肺泡Ⅰ型上皮細胞細胞的附近，提高氣體交換效率。這個過程被稱為微血管成熟，與肺泡化同時發(fā)生。

維甲酸可增加初生動物肺泡數(shù)目[31]，促進肺泡Ⅱ型細胞活力抑制其凋亡并向肺泡Ⅰ型上皮細胞轉(zhuǎn)換[32]，促進肺成纖維細胞彈性蛋白表達沉積[33]，這對肺泡成熟是重要的。RAR-α缺失不會改變早期肺泡數(shù)目和表面積，但會降低發(fā)育后期肺泡數(shù)目和表面積，表明RAR-α對肺泡間隔不是至關(guān)重要的，但可能在肺泡發(fā)育的后期起作用[34]。RAR-γ缺失導致彈性組織和肺泡數(shù)減少,RXR等位基因的額外缺失導致肺泡表面積減少，表明RAR/RXR異源二聚體參與肺泡形態(tài)發(fā)生[35]。RAR-β基因敲除導致肺泡間隔更早形成，肺泡形成更快[36]。新生動物內(nèi)皮細胞RA合成減少抑制肺成纖維細胞FGF-18和彈性蛋白的表達，損害肺泡化。維甲酸和維生素A可部分逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制所導致的肺泡發(fā)育受損[37]。Cyp26b1-/-動物肺組織表現(xiàn)為氣道上皮細胞分化異常，肺泡Ⅰ型上皮細胞減少，肺泡充盈失敗初生動物死亡[38]。全反式維甲酸可以提高胎肺表面活性蛋白B的mRNA和蛋白表達[39]，可能通過促進血小板衍生生長因子 (platelet derived growth factor,B polypeptide,PDGF)表達促進成纖維細胞增殖[40]，進而肺泡細胞間隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx43)促進肺泡化[41]。維生素A缺乏會導致肺組織基底膜增厚，并含有散狀I(lǐng)型膠原纖維，TGF-β1表達上升，飼喂全反式維甲酸可以降低TGF-β1表達和基底膜厚度[42]。維生素A缺乏會導致Ⅳ型膠原、層粘蛋白沉積和肺對蛋白的水解能力的改變，維甲酸可修復這種缺陷[43]。維甲酸能促進體外培養(yǎng)肺血管內(nèi)皮細胞生成血管[44]。妊娠早期短暫抑制維甲酸信號,血管生成減少,Ⅳ型膠原沉積減少,周細胞與內(nèi)皮細胞基底膜完整性受損,平滑肌肌動蛋白高表達升高。肺發(fā)育不全為先天性膈疝(diaphragmatic hernia,CDH)表現(xiàn)之一，維甲酸能抑制CDH肺細胞異常分化，并對肺血管形成有一定的促進作用[45]，可能是通過促進VEGF，VEGFR1及VEGFR2表達調(diào)節(jié)[46]。RA可能通過ERK/Jak-STAT通路促進肺氣腫動物肺泡上皮細胞再生[47]。使用RXRs激動劑可以降低肺氣腫動物氣道炎癥和改善基質(zhì)技術(shù)金屬蛋白酶和抗蛋白酶平衡[48]。

5 小結(jié)

目前相關(guān)文獻已經(jīng)證明維生素A在哺乳動物肺發(fā)生發(fā)育過程起重要作用，通過阻斷或激活維甲酸信號通路已經(jīng)證明了部分維甲酸參與肺發(fā)育的機制，隨著單細胞轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)的應用，發(fā)育肺內(nèi)胚層與中胚層之間信號相互作用與受維甲酸調(diào)控下游信號分子機制還有待進一步研究。