耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分型方法研究進展

武 杰，趙建平

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是革蘭陽性球菌，在一般人群中的攜帶率為25%～50%，但在某些情況下也可成為致病菌，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）已經(jīng)成為了醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染重要病原之一[1]。由于抗生素的廣泛使用，MRSA不僅對β內酰胺類耐藥，對其他臨床常用抗生素敏感率也逐漸降低。在歐洲，金葡菌中MRSA的檢出率約為29.9%[2]。在中國，根據(jù)2019 年CHINET 三級醫(yī)院細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，臨床分離的革蘭陽性菌中最多的是金葡菌，而在金葡菌中MRSA的檢出率為31.4%，并且相比于甲氧西林敏感菌株，MRSA對大環(huán)內酯類、氨基糖苷類和喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率均較高[3]。

為此，近年一些臨床實驗室開展多種MRSA的分型研究以了解MRSA分布、耐藥性和系統(tǒng)發(fā)育情況，為進一步預防和控制MRSA感染提供理論依據(jù)。MRSA的分型方法多種多樣，傳統(tǒng)的有噬菌體分型，而新興的分型方法大多基于基因的多態(tài)性運用分子生物學的方法，常用的分型方法有噬菌體開放閱讀框分型法（phage open-reading frame typing，POT）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型、葡萄球菌染色體盒（SCC）mec（staphylococcal cassette chromosomemec，SCCmec）分型、輔助基因調節(jié)因子（accessory gene regulator，agr）分型、多位點序列分型（MLST）、葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，spa）分型、DNA微陣列分型[4-5]等。本文對國內外一些主要的MRSA分型方法進行綜述，旨在為MRSA感染的分析和流行病學調查方法提供思路。

1 噬菌體分型

由于不同細菌感染不同噬菌體的能力不同，當金葡菌受到一系列噬菌體的攻擊時，根據(jù)攻擊的結果，即細菌是否被噬菌體群殺死，可以確定細菌的噬菌體類型。國際公認的23個噬菌體（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和其他噬菌體）的基本組合可用于金葡菌的噬菌體分型。通常將23種噬菌體（RTD濃度）分別滴一滴于已培養(yǎng)好的涂布了MRSA的分型瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)后觀察結果，根據(jù)溶菌結果判定分型情況。在最初進行MRSA的流行病學研究時，噬菌體分型在分析已知流行菌株中有一定價值; 但是其分型結果重復性差、結果分析存在主觀性以及較多MRSA菌株不能分型[6-7]，現(xiàn)在國內有關MRSA分型的報道中已較少使用該方法。

2 POT

為了克服噬菌體分型不便于實驗室間比較等缺點，2006年Suzuki等[8]報道了一種基于PCR的快速MRSA菌株分型新方法，即POT，其擴增片段為MRSA中噬菌體基因組的開放閱讀框。Kawamura等[9]分別使用POT和PFGE對分離自醫(yī)院內的44株MRSA進行分型，表明兩種分型方法結果一致，均有效地鑒別出了12次MRSA感染暴發(fā)中的11次，鑒定成功率為91.7%,可見POT法是調查醫(yī)院MRSA感染暴發(fā)的一種有效的流行病學工具。但是近年使用POT對MRSA分型的報道仍然很少，可能與該方法的不穩(wěn)定性和重復性差有關。

3 PFGE分型

PFGE是一種有效的基因分型方法，于1984年Schwarz和Cantor首次提出，由于其分型率高、分辨率高、重復性好等優(yōu)點曾被認為是MRSA分型的“金標準”[10]。在一項關于MRSA引起的非醫(yī)院環(huán)境感染的薈萃分析中，通過PFGE的分型表明MRSA菌株來自醫(yī)院和社區(qū)，且非醫(yī)院環(huán)境中MRSA感染的比例總體上很高[11]。PFGE分型在MRSA相關性分析、感染源追蹤和感染控制等方面作用明顯。對患者、醫(yī)護人員和病房環(huán)境中分離細菌的PFGE帶型進行分析，有助于院感部門確定感染源和傳播途徑，采取有效措施根除傳染源，阻止傳播，極大降低發(fā)病率和死亡率[12-13]。在一項分析來自中國東南地區(qū)某三級醫(yī)院不同病區(qū)和科室醫(yī)護人員的常規(guī)拭子以及MRSA分離菌的PFGE分型結果的報道中，由于從外科病房分離的2株MRSA具有相同的PFGE模式，表明MRSA可能在外科醫(yī)護人員之間傳播，提示醫(yī)院應有效控制可能存在的交叉感染[14]。

然而，這項技術操作耗時長、技術要求高、試劑成本大、需要專業(yè)的設備，對于差異很小的某些菌株難以區(qū)分，且PFGE帶型可表示菌株克隆關系的遠近而不表示真正的系統(tǒng)發(fā)育過程。此外，凝膠制備和電泳條件（如溫度、濕度、設備等）的細微改變也會影響最終的分型結果，使得不同實驗室間的結果比較存在差異。

4 SCCmec分型

遺傳元件SCCmec是MRSA的耐藥決定基因所在位點。SCCmec主要由mec基因復合物、ccr基因復合物和J區(qū)（連接區(qū)，分為J1、J2、J3）構成。mec基因復合物以mec基因為主，共有A、B、C、D、E 5種mec基因復合物類型，其中最重要的是mecA基因，可編碼對大多數(shù)β內酰胺類抗菌藥物結合力較低的一種新的青霉素結合蛋白（PBP）2a，從而對此類藥物耐藥。ccr基因復合物中起主要作用的是盒式染色體重組酶（ccr）基因，ccr基因被分為ccrA、ccrB、ccrC三種類型[15]，可以對葡萄球菌染色體上的SCCmec切除和/或整合。根據(jù)mec基因復合物、ccr基因復合物和J區(qū)的各自不同類型，可將SCCmec分為各種類型（包括亞類），過去國際公認的有Ⅰ型～ⅩⅢ型，而最近又新發(fā)現(xiàn)了SCCmecⅩⅣ型[16-17]。研究表明，中國MRSA分離株中，SCCmecⅢ型最多，其次為Ⅳa型、Ⅱ型、Ⅰ型等[18]。由于SCCmecⅠ～Ⅲ型主要見于醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)，而SCCmecⅣ、Ⅴ型主要為社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)，此方法可能對鑒別醫(yī)院和社區(qū)感染，了解當前出現(xiàn)的MRSA暴發(fā)的流行病學起到重要作用。

在方法學上，SCCmec分型主要通過多重PCR，即同一反應體系中加入多對針對不同SCCmec型所設計的引物，最終對目的DNA進行擴增。2002年Oliveira等[19]使用多重PCR法初步快速鑒定MRSA菌株SCCmecⅠ～Ⅳ型。2005年Zhang等[20]開發(fā)了一種新的多重PCR方法，可分析MRSA菌株中SCCmecⅠ～Ⅴ型及Ⅳ型的4種亞型Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd，他們提出并驗證了新的8對引物對SCCmec（包括亞型）分類的可行性和實用性。2007年Boye等[21]設計4對引物就可將MRSA菌株分為SCCmecⅠ～Ⅴ型的方法，此方法簡便、節(jié)約成本，但未能對亞型分類。鑒于先前的研究，2013年Mcclure-Warnier等[22]設計并發(fā)現(xiàn)了一種簡單的多重PCR方法，用于快速篩選主要的SCCmec類型，主要為Ⅰ～Ⅴ型及Ⅵ型和Ⅷ型，其中Ⅳ型最多可分為A～F亞型。遺憾的是，目前的多重PCR法主要用于SCCmecⅠ～Ⅴ型分析，不僅需要開發(fā)新的PCR對Ⅵ～ⅩⅢ型分型，更需要一種方法能將所有SCCmec類型及亞型進行準確分析。不僅如此，不斷新發(fā)現(xiàn)的SCCmec類型將對多重PCR法要求更高。

5 agr分型

agr是金葡菌的重要調控成分，參與調控不同獨立基因的表達和控制多種毒力因子的產(chǎn)生。agr是基因組中的一個多態(tài)性位點，agr高變區(qū)包括agrB基因C末端的三分之二、整個agrD基因以及agrC基因N末端的一半。agr可分別通過P2、P3啟動子轉錄RNAⅡ和RNA Ⅲ。RNAⅡ促進agrB、agrC、agrD、agrA基因表達，其產(chǎn)物膜蛋白AgrB將AgrD即前體自動誘導肽（AIP）轉化為成熟的AIP并分泌到胞外，當AIP濃度到達臨界閾值時，AIP與膜結合受體組氨酸激酶AgrC結合并使AgrA磷酸化，活化后的AgrA又可促進RNAⅡ和RNAⅢ的轉錄[23]。由于不同MRSA菌株agr具有多態(tài)性，其編碼產(chǎn)生的AIP及相應受體氨基酸序列也具有多態(tài)性，所以金葡菌分為4個agr型（Ⅰ～Ⅳ型）[23-24]。RNA Ⅲ可上調多種毒力因子如溶血素、腸毒素等的表達和下調細胞表面蛋白如纖維連接蛋白等的表達,以抵抗宿主防御和促進組織侵襲[24]。Francois等[25]報道了一種多重實時定量PCR可快速地確認agr類型，并且由于試劑成本較低，也適用于臨床實驗室和流行病學檢測。Abimannan等[26]對印度南部分離自醫(yī)院和社區(qū)的MRSA菌株進行分型，發(fā)現(xiàn)主要的agr類型為agrⅡ型，其次是agrⅠ、agrⅢ和agrⅣ型。但agr分型具有地區(qū)差異性，Goudarzi等[27]對伊朗德黑蘭地區(qū)106株MRSA進行分型發(fā)現(xiàn)agrⅠ型菌株是最多的，其次為agrⅡ、agrⅢ，而未發(fā)現(xiàn)agrⅣ，這與國內賈珉等[28]的研究結果一致。有研究表明大部分MRSA菌株的agr類型與特定的臨床感染有關。例如，大多數(shù)引起經(jīng)期中毒性休克綜合征的MRSA菌株屬于agrⅢ型；引起葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征（SSSS）、大皰性膿皰病的MRSA多為agrⅣ型[29]。大多數(shù)萬古霉素耐藥的MRSA菌株屬于agrⅡ型[30]，而從患有心內膜炎的患者身上分離到的MRSA菌株主要與agrⅠ型相關[31]。agr分型具有可靠性高、重復性好、特異性強等特點，MRSA菌株的agr分型有助于了解其遺傳背景特征及致病性的特點，進而對預防MRSA感染和臨床用藥提供指導，并廣泛應用于MRSA的流行病學調查和監(jiān)測。但是agr分型更適用于攜帶毒力基因的菌株，并且不同地區(qū)agr分型結果難以統(tǒng)一，因此需要參考其他分型方法綜合分析。

6 MLST

MLST是在多位點酶電泳(multilocus enzyme eiectrophoresis，MLEE)分型技術的基礎上發(fā)展而來，MLEE是從細菌中提取出蛋白質進行凝膠電泳，根據(jù)蛋白質條帶之間的相似程度對細菌分型，而MLST對MRSA菌株的7個管家基因擴增測序，極大地改善了MLEE分型的精確性[32]。這7個管家基因分別是arcC（編碼氨基甲酸激酶，456 bp）、aroE（編碼莽草酸脫氫酶，456 bp）、glpF（編碼甘油激酶，465 bp）、gmk（編碼鳥苷酸激酶，429 bp）、pta（編碼磷酸乙酰轉移酶，474 bp）、tpi（編碼磷酸三酯異構酶，402 bp）和yqiL（編碼乙酰輔酶A，516 bp）。由于等位基因的多樣性，不同來源的MRSA菌株其管家基因有著不同的核酸序列，對7種管家基因擴增測序，并將結果提交到MLST數(shù)據(jù)庫（http://www.mlst.net）對比分析，最后得到菌株MLST結果，并賦予每個菌株數(shù)字形式的序列類型（ST）。對我國海南省分離自臨床的金葡菌的分子特征分析顯示，ST398、ST188和ST45是金葡菌分離株中的主要類型，其中ST398和ST45分別是甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）和MRSA分離株中的主要克隆[33]。然而，對意大利南部一家養(yǎng)殖場的豬和工作人員MRSA分離株進行MLST測定，結果顯示ST398是家畜相關MRSA（livestock associated MRSA，LA-MRSA）其主要類型[34]?？梢?，MRSA菌株的ST流行類型的多樣性與地區(qū)、宿主有關，并且HA-MRSA、CA-MRSA和LA-MRSA中的優(yōu)勢ST型有較大差異，提示MRSA感染的來源和潛在的傳播路徑。

MLST分型精確性好、可重復性強。對于新發(fā)現(xiàn)的ST型，上傳到MLST網(wǎng)站后其結果也便于不同實驗室間進行比較確認，使這項技術成為一個全球非常有用的流行病學分析工具。但是這種方法與MRSA的毒力基因沒有任何關系，MRSA的致病性不能被清楚認知。MLST的另一缺點是成本高且操作復雜。

7 spa分型

spa基因具有多態(tài)性，編碼特異性蛋白A，在金葡菌中高度保守，并提供合適的短重復序列區(qū)域作為單基因座序列分型的靶點，即spa分型。這是一種基于DNA序列的分型方法，專門用于金葡菌的鑒定，spa基因經(jīng)PCR擴增后進行序列測定，即可獲得分型。spa基因長度約為2 150 bp，包含三個區(qū)域：Fc結合區(qū)、X區(qū)和C末端區(qū)域。X區(qū)域，也稱為重復區(qū)域，由數(shù)目不定的長度為21～27 bp（主要為24 bp）的重復序列組成。由于重復序列的數(shù)量、排列順序和缺失、插入等改變，該區(qū)域具有多態(tài)性[35]，進而反映spa的多種類型。

截止現(xiàn)在，Ridomspa服務器數(shù)據(jù)庫（http：//www.spaserver.ridom.de）包含19 392種spa類型、802個重復序列和431 456個菌株，其數(shù)據(jù)來自全球143個國家及地區(qū)，可以對測得的spa分型結果進行對比分析，并收錄新發(fā)現(xiàn)的spa類型。除了使用PCR方法外還可使用高分辨率熔解（highresolution melt，HRM）曲線分析spa基因分型，該方法也需要對spa基因擴增，然后升溫解鏈，根據(jù)與標準曲線對比進行分析，是一種可靠、經(jīng)濟且簡便的分型方法，可以用作流行病學研究[35-36]。

spa分型穩(wěn)定性高、重復性好。Malachowa等[37]用59株醫(yī)源性金葡菌對PFGE、MLST、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復分析（MLVA）和spa分型四種分型方法進行了水平比較，結果表明spa分型更接近MLST，并且建議將多種分型方法結合起來可進一步研究MRSA菌株分型結果。

與其他方法相比，spa分型具有成本效益高、操作方便、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。此外，spa分型穩(wěn)定，有一個標準化的國際命名法，可以整合到國際數(shù)據(jù)庫，使用spa分型有助于了解醫(yī)院和社區(qū)環(huán)境中MRSA的克隆多樣性及其傳播[38]。但是，spa分型只局限于spa基因X區(qū)域的突變，對于MRSA基因組其他部分的改變未能有效判別，甚至出現(xiàn)錯誤分型。研究表明[39]，t008和t002是全球分布最廣的spa類型，t032是歐洲最普遍的spa類型，主要集中在英國和德國且該類型菌株大多是MRSA，t008是美國最流行的類型，而t030是我國的主要類型。

8 DNA微陣列分型

DNA微陣列，也稱DNA芯片或基因芯片，是一種利用有序的附著在固體表面的DNA探針對樣品DNA進行識別測定的新技術。探針可以是寡核苷酸或基因片段，當其與樣本DNA（通常用熒光素標記）雜交時，產(chǎn)生的信號被采集并通過檢測器分析，以檢測特定細菌物種中是否存在互補核苷酸序列。據(jù)報道，DNA微陣列可以共價固定大約與180多個金葡菌基因相關的300個特異性探針，這些基因可以是分型位點、毒素基因、微生物表面成分相關基因以及藥物抗性基因，因此通過基因芯片技術，對病原菌進行基因分型的同時，也可研究其毒力和耐藥性，擴大了MRSA研究范圍，為臨床防治MRSA感染提供更全面的指導意見[40-42]。雖然DNA微陣列分型準確度高、分析范圍廣，但是需要昂貴的儀器和繁瑣的操作步驟，并且無法檢測到微陣列中未包含的基因。該實驗耗時較長，需要將從細菌中提取的DNA擴增后才可用于雜交。

9 總結與展望

MRSA在世界各地蔓延，分型方法對于醫(yī)院感染控制和流行病學研究至關重要。目前，傳統(tǒng)的分型方法幾乎已被淘汰。除DNA微陣列分型（此方法應用較少）外，PFGE分型、SCCmec分型、agr分型、MLST和spa分型等是主流方法，但由于每種方法優(yōu)劣不同，現(xiàn)在多綜合運用多種方法，詳細分析各地區(qū)MRSA的流行類型和分子特征。除此之外，在PCR方法中還有擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分型，隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分型以及極具潛力的更為精細的全基因組測序方法。在未來，MRSA分型方法將不斷創(chuàng)新，向分辨率更高、可重復性更強、分析速度更快、操作更簡便、信息化和自動化更完善的方向發(fā)展，能廣泛地應用于臨床實驗室，為預防和治療MRSA感染以及流行病學調查和追蹤提供全面、準確、及時的信息。