蚊蟲共生微生物研究進展

李博琦 劉 鑄 李春曉

(1.牡丹江師范學(xué)院，黑龍江牡丹江 157000；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室, 北京市蟲媒病與自然疫源性疾病重點實驗室，北京 100071)

雙翅目蚊科昆蟲，如按蚊屬、伊蚊屬和庫蚊屬蚊蟲，每年傳播的蚊媒傳染病導(dǎo)致上億人感染，對全球公共衛(wèi)生造成嚴重威脅。并且由于全球貿(mào)易現(xiàn)象導(dǎo)致其以入侵形式影響人類生活，并且范圍逐漸擴大(Schaffneretal., 2013, 王曉明等, 2017)。近年來與蚊蟲有關(guān)共生微生物的研究逐漸成為熱點，這些共生微生物包括細菌、真菌和病毒。研究表明，蚊蟲共生微生物對于蚊蟲的生長、發(fā)育、繁殖、進化以及對病原的傳播效能都有很大影響。明確共生微生物在蚊蟲生命周期和傳播循環(huán)中的作用，將為蚊蟲及蚊媒病防控技術(shù)的發(fā)展提供新的思路和途徑。

1 蚊蟲共生微生物研究方法

蚊蟲共生微生物的研究方法可以籠統(tǒng)地分為兩大類，即細菌培養(yǎng)依賴型方法和非培養(yǎng)依賴型方法(王曉明等, 2017)。培養(yǎng)依賴型方法對培養(yǎng)條件要求較高，同時鑒定的菌種也僅限定在可培養(yǎng)的菌種中，但蚊蟲體內(nèi)的共生微生物通常包含許多不可培養(yǎng)的菌種，所以更適合使用非培養(yǎng)依賴型方法。目前非培養(yǎng)依賴型方法主要使用的分子手段包括變性梯度凝膠電泳(DGGE)、16 S rRNA基因測序、分子雜交、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、核糖體DNA擴增片段限制性內(nèi)切酶分析(ARDRA)、RT-qPCR等技術(shù)以及細菌宏基因組測序技術(shù)等(向候君等, 2018)。

宏基因組學(xué)是將環(huán)境中所有微生物整體作為研究對象，并以測序作為手段，來研究環(huán)境中微生物的多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、基因功能及分類等(Levyetal., 2016)。由于其不需要對環(huán)境微生物進行培養(yǎng)，是將環(huán)境所有微生物進行DNA提取后進行測序，通量高，信息獲取也較為全面，因此，在環(huán)境微生物和醫(yī)學(xué)微生物等領(lǐng)域得到較為廣泛的應(yīng)用(Daniel, 2005; Baldrianetal, 2011)。高通量技術(shù)、宏基因組技術(shù)、宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是宏基因組學(xué)中的關(guān)鍵技術(shù)，具有低成本、高準確度等優(yōu)點，逐漸被應(yīng)用于蚊蟲共生微生物的檢測。

蚊蟲微生物組分析方法主要有宏基因組、高通量測序和16S rRNA測序(Wangetal., 2009)等，測序后需對測得的微生物進行分類、進化、功能等方面的分析。宏基因組測序發(fā)現(xiàn)蚊蟲體內(nèi)主要共生菌為變形菌門(Proteobacteria)，其中包括了Asaia、沃爾巴克氏菌Wolbachia等功能型細菌(Rossietal., 2015)；其中Wolbachia因可引起蚊蟲細胞質(zhì)不親和，并可降低蚊蟲的媒介效能而被應(yīng)用于蚊蟲種群的控制(Caragataetal., 2016)。2017年，研究證實雌性岡比亞按蚊在感染W(wǎng)olbachia后對惡性瘧原蟲孢子蟲感染率和感染強度明顯較低(Gomesetal., 2017)。

2 對蚊蟲生理和行為的影響

蚊蟲的共生微生物群落數(shù)量極其龐大、多樣性豐富，對蚊蟲的免疫、營養(yǎng)、生理、行為等均有著至關(guān)重要的作用。蚊蟲體內(nèi)的微生物也會受到多種因素的干擾，如蚊蟲的種類、性別與營養(yǎng)攝入、生長階段等。

2.1 對蚊蟲多樣性的影響

按蚊喜好在中大型、較為干凈的水塘中孳生，庫蚊喜好在中大型、較混濁水體中孳生，而伊蚊則喜好在較小的容器內(nèi)孳生。按蚊與庫蚊喜好在夜間叮咬動物及人類，而伊蚊則主要在白天叮咬。蚊蟲由于不同種屬的喜好與生活習性不同，導(dǎo)致其體內(nèi)環(huán)境也不盡相同。因此，不同蚊蟲所攜帶的微生物群體的多樣性也存在一定的差異。蚊蟲體內(nèi)共生微生物的多樣性差異，與蚊蟲所處的生理狀態(tài)和環(huán)境不同相關(guān)。

利用高通量測序等方法，對不同種蚊蟲共生微生物多樣性進行檢測，發(fā)現(xiàn)伊蚊、庫蚊、按蚊3個屬的主要共生菌種門類均為變形菌門(Minardetal., 2013)。同屬蚊蟲的微生物組有較高的相似性，但不同屬蚊蟲之間的微生物多樣性就較為豐富了，并且伴隨著許多特有的共生細菌(Gimonneauetal., 2014)。例如，在一些研究中提到按蚊的相關(guān)微生物組中有假單胞菌屬Pseudomonas、產(chǎn)氣單胞菌屬Aeromonas、Asaia、叢毛單胞菌屬Comamonas、伊麗莎白菌屬Elizabethkingia、腸桿菌屬Enterobacter、多源菌屬Pantoea和沙雷菌屬Serratia等多種微生物(Gendrinetal., 2013)。環(huán)跗庫蚊Culextarsalis的主要共生菌為Thorsellia屬(Dugumaetal., 2013; Dugumaetal., 2015)；淡色庫蚊Cx.pipienspallens的主要共生菌為鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、Wolbachia屬(Muturietal., 2016)；致倦庫蚊Cx.pipiensquinquefasciatus的主要共生菌為產(chǎn)氣單胞菌屬、黃桿菌屬Flavobacteria、多源菌屬等(Pidiyaretal., 2002; Osei-Pokuetal., 2012)；伊蚊的主要共生菌是Wolbachia和Dysgonomonas屬兩種微生物(Minardetal., 2014; Minardetal., 2015)。蚊蟲體內(nèi)的核心細菌基因組在不同物種中似乎是相似的，例如Pantoea、Acinetobacter還有Asaia，在蚊蟲中非常普遍，可以存在于各個物種間(Crottietal., 2010; Tereniusetal., 2012; Valiente Moroetal., 2013)。

2.2 對蚊蟲性別的影響

性別差異使蚊蟲體內(nèi)環(huán)境差別較大，行為差也很明顯，例如雄蚊不吸食動物或人類的血液，而雌蚊在交配后通常需要吸食血液，從而促進卵巢發(fā)育來完成它的生殖周期(Foster, 1995)。雌雄蚊蟲的進食差別，導(dǎo)致其從外界獲得微生物的譜系和能力方面出現(xiàn)差異，尤其是外源血液中的某些特殊蛋白質(zhì)等(Wangetal., 2011)。另外，蚊蟲的消化道中水解酶差異也導(dǎo)致微生物菌群有了不同的選擇(Nation Sr, 2015)。因此，攝入的營養(yǎng)物質(zhì)的組成和分布也是影響微生物群落的一個重要因素，例如，憩室結(jié)構(gòu)中的高濃度碳水化合物和酸性pH(5.2～6.5)可以對某些微生物組進行篩選(Gusmaoetal., 2007)。除此之外，雌蚊在吸血后會發(fā)生發(fā)熱現(xiàn)象，使免疫活性降低，從而導(dǎo)致微生物含量大量增加(Kumaretal., 2010; Benoitetal., 2011; Oliveiraetal., 2011)。

雄蚊體內(nèi)檢測出了Bacillus和Staphylococcus等微生物群體，而雌蚊體內(nèi)檢測出了Cryseobacterium、Pseudomonas和Serratia等微生物群體(Ranietal., 2009)，推測雌性蚊蟲中腸主要由伽瑪桿菌組成。另外，假單胞菌屬、沙雷氏菌屬和腸桿菌屬也經(jīng)常出現(xiàn)在雌性蚊蟲的體內(nèi)(Minardetal., 2013)。雄蚊中腸則主要由硬壁菌門細菌組成，包括葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌屬和微球菌屬的細菌(Ranietal., 2009)。類似情況也發(fā)生在其他雌性吸血昆蟲中腸中。有研究表明，蚊蟲體內(nèi)氧化代謝與免疫功能下調(diào)等多方面原因，共同導(dǎo)致了蚊蟲吸血前后微生物組的豐富度有所差異(Wangetal., 2011)。

2.3 對媒介傳播效能的影響

媒介傳播效能是指媒介生物感染和傳播病原體的能力(Lambrechtsetal., 2009)，降低媒介傳播效能對于防控蚊媒疾病的傳播和擴散非常重要。相比于輪胎生活環(huán)境，樹洞的微生物含量更高，直接導(dǎo)致蚊蟲幼蟲生活環(huán)境差別很大，間接導(dǎo)致媒介效能改變(Yeeetal., 2012)。此外，水體的富營養(yǎng)化有助于促進蚊幼蟲更快的發(fā)育并提高它們的媒介效能(Buxtonetal., 2020)。這種糞水所致的水體的富營養(yǎng)化大多來源于各種微生物及其產(chǎn)物；這種方式比較容易了解微生物與媒介效能的相關(guān)關(guān)系，對此還需更深入地研究，以達到大幅度降低媒介效能的目的。

通過研究酵母、細菌和微藻飼料對蚊蟲幼蟲發(fā)育、化蛹時間、成蟲大小、羽化率、存活率、壽命和翅膀形態(tài)的影響，證明了以細菌和微藻為食的幼蟲在發(fā)育速度、化蛹時間、成蟲羽化和存活率方面均表現(xiàn)出嚴重的延遲(Souzaetal., 2019)。此外，催化多巴和多巴胺氧化為黑色素的酚氧化酶(POs)及其編碼基因AsLac2的表達，對于昆蟲的表皮形成和先天免疫維持至關(guān)重要，直接影響著蚊蟲對外界微生物的感染(Duetal., 2017)。

除了間接影響外，微生物直接影響媒介效能相關(guān)的研究也有很多。例如，基因工程改造后，藍細菌可作為蘇云金芽孢桿菌亞種以色列滅蚊毒素的傳遞載體，在蚊蟲生境中降低蚊蟲的媒介效能(Ketseoglouetal., 2016)。蚊蟲微生物群的優(yōu)勢微生物Asaia與Wolbachia的競爭發(fā)育會對蚊蟲的性腺生態(tài)位產(chǎn)生負面影響(Rossietal., 2015)。此外，立克次體感染可導(dǎo)致節(jié)肢動物提高番茄黃葉卷曲病毒的傳播效率。LeptolegniachapmaniiSeymour對多種蚊幼蟲的致病性導(dǎo)致了幼蟲死亡率增高和繁殖力下降，對媒介效能的降低也大有裨益(Pelizzaetal., 2013)。

2.4 在蚊蟲不同發(fā)育時期的作用

蚊蟲卵、幼蟲和蛹主要通過孳生的水體來獲得大量的共生微生物。蚊幼中腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種來源于孳生地的藍藻，這種藍藻在成蚊體內(nèi)卻沒有(Thieryetal., 1991； Vzquez-Martínezetal., 2002)。在岡比亞按蚊幼蟲體內(nèi)，藍藻在其中腸的含量很高，大概占其全部共生微生物的40%左右(Wangetal., 2011)。針對這點，研究發(fā)現(xiàn)許多節(jié)肢動物的中腸食物團附近的圍食膜(PM)可能對蚊蟲攝入微生物有一定影響，而蚊蟲的PM圍繞著胎糞部分則被稱為MPM。在蚊蟲蛻變過程中，蚊蟲的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了根本性的改變，尤其是第一個胎膜周營養(yǎng)基質(zhì)或膜(MPM1)在蛹的早期形成，第2個(MPM2)在成蟲羽化時出現(xiàn)，MPM隔離了在幼蟲階段攝入的微生物使成蟲的腸道內(nèi)微生物得到清除，這些微生物殘渣在成年后會排泄出去(Molletal., 2001；Moncayoetal., 2005)。這種現(xiàn)象很好地解釋了幼蟲與成蚊的微生物群落差異為什么會那么大，例如岡比亞按蚊的幼蟲和蛹時期的微生物數(shù)量是其成蚊的3倍(Wangetal., 2011)。這種變化產(chǎn)生的原因可能是由于圍食膜在蚊蟲不同階段的狀態(tài)不同(Moncayoetal., 2005)。

總體來說，環(huán)境對蚊蟲共生微生物的影響是很大的，野生株蚊蟲的微生物豐度一般都要高于實驗室蚊蟲的豐度，這與環(huán)境中微生物的種類、數(shù)量有著一定的關(guān)系(Nation Sr, 2015)。另外，蚊蟲體內(nèi)的共生微生物不僅來自于孳生的環(huán)境，也可來源于母代，例如在致倦庫蚊、淡色庫蚊和白紋伊蚊中，沃爾巴克氏菌屬的一些種類就可以通過卵巢垂直傳播從母代傳遞至子代，Asaia在岡比亞按蚊Anophelesgambiae和斯氏按蚊An.stephensi中也是如此( Kittayapongetal., 2002；Cooketal., 2010；Damianietal., 2010)。

3 在蚊蟲防控中的應(yīng)用

現(xiàn)今防控蚊蟲最常用的方法是使用化學(xué)殺蟲劑，但殺蟲劑具有環(huán)境污染、不可持續(xù)及易造成抗性蚊蟲產(chǎn)生等多方面缺點，不宜作為長期的防控措施(Davidetal., 2010)?；谖孟x共生微生物的生物防治措施具有環(huán)境友好、對人類安全無害等優(yōu)點，在蚊媒和蚊媒病的防控方面具有良好的應(yīng)用前景(Ahmedetal., 2017)。目前，蚊蟲共生微生物中應(yīng)用于蚊媒病防控主要是Wolbachia，而隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，以及對蚊蟲腸道微生物的日益了解，更多的微生物靶標會被發(fā)現(xiàn)，將為蚊媒傳染病的控制提供新的思路和途徑。

3.1 Wolbachia在蚊蟲防治中的應(yīng)用

Wolbachia是立克次體科(Rickettsiaceae)沃爾巴克氏體屬Wolbachia的一類微生物(Hilgenboeckeretal., 2008)。1971 年，首次提出胞質(zhì)不相容性現(xiàn)象與Wolbachia相關(guān)聯(lián)的假設(shè)(Yenetal., 1971)。Wolbachia可誘導(dǎo)配子結(jié)合時的胞質(zhì)不相容性(cytoplasmic incompatibility，CI)，即當感染了Wolbachia的雄性與不感染或感染了不同型別Wolbachia的雌性交配，雌性產(chǎn)的卵不能成功孵化。除了誘導(dǎo)胞質(zhì)不相容性機制外，Wolbachia還會使其宿主產(chǎn)生殺雄行為、雌性化以及孤雌生殖(Gloria-Soriaetal., 2018)。同時，會降低宿主的生殖能力、縮短宿生成蟲期的壽命和降低宿主的活動能力等(Suroowanetal., 2016; Caputoetal., 2019)，這些生殖方式能夠使Wolbachia在宿主種群中廣泛傳播。目前大量研究顯示，通過轉(zhuǎn)染不同Wolbachia可以達到控制蚊媒和蚊媒病的目的(Moreiraetal., 2009; Walkeretal., 2011; Naznietal., 2019; Rossetal., 2020; Huetal., 2020)。

除胞質(zhì)不相容性之外，Wolbachia還會影響蚊蟲對病原體的感染和傳播能力。已經(jīng)證實在白紋伊蚊、埃及伊蚊和波利尼西亞伊蚊Ae.polynesiensis等蚊蟲對一些病毒有拮抗作用(Moreiraetal., 2009; Bianetal., 2013; Bonneauetal., 2019)。例如埃及伊蚊體內(nèi)的Wolbachia可以防止蚊蟲感染登革病毒和其他黃病毒(Moreiraetal., 2009; Walkeretal., 2011)。將Wolbachia引入蚊蟲體內(nèi)來阻止登革病毒傳播到主要媒介蚊蟲的種群中，通過在馬來西亞大吉隆坡的6個不同地點進行測試，發(fā)現(xiàn)在溫度較高的條件下，釋放地點人群中的登革熱發(fā)病率會降低(Naznietal., 2019)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)Wolbachia對蚊媒病毒的感染傳播有影響后，進行了很多相關(guān)的研究。研究發(fā)現(xiàn)，感染W(wǎng)olbachiawMel菌株的埃及伊蚊會因為高溫而降低wMel的感染率，實驗證明感染率在高溫影響后的第1個月有較嚴重影響，會將感染率降低到88%和83%，但在4個月后又恢復(fù)到了幾乎100%。這說明高溫對wMel的感染率的影響是暫時的，過段時間就會恢復(fù)到原狀(Rossetal., 2020)。

除了功能性研究外，還有學(xué)者對Wolbachia感染蚊蟲的地理因素也進行了研究，例如對中國地區(qū)和其他國家地區(qū)的Wolbachia感染率進行了調(diào)查，認為中國Wolbachia感染的自然流行率遠低于其他國家或地區(qū)。并且在此基礎(chǔ)上，對Wolbachia的gatB、coxA、hcpA、ftsZ、fbpA和wsp基因進行測序，確定了wAlbB的新序列類型(ST)，并進行了驗證，證明了wAlbB與其他族系有著一定的差別，證實了其是一只單獨的族系(Huetal., 2020)。該項研究不僅證明了Wolbachia對白蚊伊蚊的感染率與地區(qū)有著一定聯(lián)系，還證明了可以感染蚊蟲的Wolbachia中又多了一個品系，對于Wolbachia的研究又進了一步，也給我們更多關(guān)于解決蚊媒傳染病防控問題的思路。除此之外對蚊蟲感染W(wǎng)olbachia的感染率與傳播率及受感染導(dǎo)致的不受精率進行相關(guān)性分析，通過現(xiàn)場調(diào)查結(jié)合建立數(shù)學(xué)模型等手段對實驗數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，蚊蟲對Wolbachia的初始感染率能直接影響傳播率，感染率越高，傳播率與胞質(zhì)不相容率也會相對越高，并且經(jīng)過傳播最終會導(dǎo)致所有的野生株樣本都感染(Alfanoetal., 2019)。這種數(shù)學(xué)模型的意義不僅僅是在說明上述問題，更大的意義是為感染率相關(guān)研究提供了一種研究手段和研究思路，也會促進后續(xù)對于Wolbachia感染蚊蟲的相關(guān)研究。這種研究方法在多年前就開始進行了，建立了具有常數(shù)出生率和依賴密度的死亡率的數(shù)學(xué)模型(Keelingetal., 2003；Farkasetal., 2010)，用延遲微分方程研究了Wolbachia感染動力學(xué)(Zhengetal., 2014)，討論了將Wolbachia引入蚊蟲種群對人類登革熱病例的影響(Ndiietal., 2015)。近年來，研究者開始嘗試將基于Wolbachia感染的昆蟲不相容技術(shù)(incompatible insect technique，IIT)與昆蟲不育技術(shù)(sterile insect technique，SIT)相融合，應(yīng)用于蚊蟲控制與蚊媒病防控。該技術(shù)主要通過釋放攜帶有不同種Wolbachia的野生雄蚊，通過胞質(zhì)不相容誘發(fā)雌蚊不育。近幾年，IIT與SIT聯(lián)合應(yīng)用獲得了突破性進展(Zhengetal., 2019)。2016 年，澳大利亞首次報道了通過小規(guī)?，F(xiàn)場試驗釋放人工轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia的蚊蟲進行種群抑制的實驗結(jié)果(O′Neill, 2016)。2019 年，提出應(yīng)用IIT與SIT結(jié)合的技術(shù)來消滅白紋伊蚊(Zhengetal., 2019)。通過胚胎顯微注射技術(shù)，將庫蚊體內(nèi)的WalbachiawPip轉(zhuǎn)移到白紋伊蚊HC蚊株體內(nèi)，同時，對HC雌蚊進行低劑量輻射后，按2%比例將其釋放混入野生種群中。通過2～3年持續(xù)釋放數(shù)百萬工廠化飼養(yǎng)處理后雄性蚊蟲，在2個試驗點基本清除或接近清除了白紋伊蚊的種群數(shù)量，2年內(nèi)野生成蚊數(shù)量平均減少了83%～94%，持續(xù)6周內(nèi)沒有檢測到成蚊。野生幼蟲數(shù)量年度平均減少超過94%，持續(xù)13周沒有檢測到活蚊卵。然而由于社會倫理和生物安全等問題，Wolbachia離實際大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離，隨著對其胞質(zhì)不相容機制和對病原體感染傳播抑制機制的進一步闡明，基于Wolbachia的生物防治技術(shù)在蚊媒與蚊媒病防控領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。

3.2 未來可能應(yīng)用于蚊蟲防控的微生物新靶標

隨著宏基因組和腸道微生物組研究技術(shù)的逐漸普及，除Wolbachia之外，研究者開始針對蚊蟲其他共生微生物開展研究，以期發(fā)現(xiàn)更安全、更有效且更適用于野外現(xiàn)場蚊蟲防控的微生物新靶標。

Ahmed等分離出2種共生菌(HRM1和HS1)，測試這2種菌對于尖音庫蚊的殺滅功能，結(jié)果顯示，經(jīng)過HS1處理過的幼蟲中腸有明顯變形，證明了這2種菌具有防治蚊幼的應(yīng)用前景(Ahmedetal., 2017)。此外，在瘧疾相關(guān)媒介蚊蟲卵巢中發(fā)現(xiàn)一種沙雷氏菌菌株(AS1)，AS1可以穩(wěn)定地存活在蚊蟲中腸、雌性卵巢和雄性附屬腺中，并可在整個蚊蟲種群中迅速傳播。利用AS1達到對蚊蟲種群控制的相關(guān)研究也在進行之中(Wangetal., 2017)。另外一種沙雷氏菌——粘質(zhì)蘇云金桿菌(Wuetal., 2019)，該菌分泌的SmEnhancin可以消化蚊蟲腸道上皮細胞上的膜結(jié)合粘蛋白，從而促進病毒傳播。體內(nèi)含有這種菌的伊蚊相較于不含這種菌的野生伊蚊更容易感染病毒，smEnhancin蛋白還能調(diào)節(jié)哺乳動物宿主腸道病原體的感染(Wuetal., 2019)。

反方向控制傳播效能的研究表明，岡比亞按蚊吸食了含有抗生素的血液后會擾亂體內(nèi)的微生物種群，使得岡比亞按蚊對瘧疾的易感性增加，還會增強蚊蟲的存活率以及繁殖率，進而提高媒介效能(Gendrinetal., 2015)。通過對抗生素類藥物的控制使用來間接地降低蚊蟲對瘧疾的傳播效能。另外，也可以通過驅(qū)避和引誘的方式來進行蟲媒病防治的研究。人類皮膚細菌及其分泌物對岡比亞按蚊、白紋伊蚊和埃及伊蚊等的作用，比現(xiàn)有的引誘劑與驅(qū)避劑更有優(yōu)勢，但具體應(yīng)用還需要進一步的研究(Michaletetal., 2019)。

同時，Elizabethkingia、Chryseobacterium和Wolbachia屬以及細菌綱的未分類微生物也有可能成為一種新的蚊蟲控制方法，應(yīng)用于蟲媒病的防控(Guéganetal., 2018)。