許中華，王 敏 綜述，張 瑗 審校

(陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院骨科，重慶 400038)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性骨腫瘤，占所有惡性原發(fā)性骨腫瘤的20%～35%[1]，最常見的病變部位為生長活躍的股骨遠端、脛骨近端的干骺端，常伴有侵襲性和高度的局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。10%～20%的患者在診斷時可檢測到已經(jīng)轉(zhuǎn)移，而30%的無轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者及80%在初診即合并轉(zhuǎn)移的患者會出現(xiàn)復發(fā)[2]，因此骨肉瘤也是轉(zhuǎn)移和復發(fā)率最高的肉瘤之一，臨床治療挑戰(zhàn)極大。20世紀70年代以前，截肢手術(shù)是該腫瘤的標準治療方法，結(jié)果顯示5年生存率為10%～20%；大多數(shù)患者在術(shù)后1年內(nèi)出現(xiàn)局部復發(fā)或肺部轉(zhuǎn)移[1]。從20世紀70年代開始，化學藥物聯(lián)合廣泛的手術(shù)邊緣切除等多學科方法顯著提高總生存率至60%～70%，保肢率達到90%～95%[2-3]。

盡管如此，骨肉瘤患者的生存率在過去40年里并未比其他實體瘤有質(zhì)的飛躍。表現(xiàn)在近40年來骨肉瘤的治療方案、手術(shù)技術(shù)并未發(fā)生革命性進步。究其原因，(1)骨肉瘤屬于低發(fā)病率腫瘤，在全球范圍內(nèi)受到系統(tǒng)研究力度偏低，特別是分子機制研究仍較薄弱;(2)骨肉瘤屬于高級別肉瘤，腫瘤異質(zhì)性特征非常明顯，本身就有成骨、成軟骨、成纖維細胞型腫瘤等組織來源分型；可分為經(jīng)典型、毛細血管擴張型、皮質(zhì)旁型、小細胞型等病理分型；(3)骨肉瘤的間質(zhì)成分遠高于其他實體瘤，腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)更加復雜，細胞間作用極其微妙，易導致免疫逃避和豁免，乃至發(fā)生化療抵抗和復發(fā)轉(zhuǎn)移[4]。

因此，在臨床進展緩慢的前提下，從分子水平上揭示骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制，將利于采用新的治療理念和策略來改善骨肉瘤患者的預后，這也成為當前腫瘤領(lǐng)域一個具有挑戰(zhàn)性的科學問題。分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展表現(xiàn)出染色體不穩(wěn)定/破裂、原癌基因的激活、抑癌基因失活等特征[5]。此外，某些微小RNA也參與骨肉瘤基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，如Ras、Wnt、Notch等[6]。另外，高通量基因組測序發(fā)現(xiàn)較高的突變負荷,如BOUSQUET等[7]發(fā)現(xiàn)CDK4、MDM2等26個原癌基因和p53、Rb等27個抑癌基因?qū)儆谟行蛔?。這些發(fā)現(xiàn)也得到體外實驗證實，如有研究發(fā)現(xiàn)44%的骨肉瘤標本存在PTEN的表達異常，PTEN基因下調(diào)可以增加PIP3去磷酸化，逆轉(zhuǎn)PIP3向PIP2的轉(zhuǎn)化，增強腫瘤的侵襲能力[8]。另外PD-1/PD-L1軸與患者預后和總體生存率呈負相關(guān)，且PD-1單抗nivolumab可以抑制小鼠骨肉瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移[9]。

最新的研究進展亦顯示，一種位于細胞表面的跨膜蛋白整合素(integrin)，參與了骨肉瘤TME中的形成過程。TME是由腫瘤組織癌巢中的細胞成分和非細胞成分構(gòu)成，對頑固性惡性疾病的進展發(fā)揮了重要作用，具體包括：細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、肌纖維母細胞、成纖維細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞、脂肪細胞、免疫炎癥性細胞、淋巴血管網(wǎng)絡(luò)和整合素家族[10]。整合素作為TME的生物力學傳感器，通過在涉及感知和重塑細胞微環(huán)境的多種情況下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用進而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展[11]。因此，TME正日益被認為是疾病發(fā)展多階段的關(guān)鍵因素，特別是局部耐藥、免疫逃逸和遠處轉(zhuǎn)移，從而對臨床腫瘤一線干預的未來發(fā)展產(chǎn)生重大影響。

1 整合素概述

整合素是由非共價結(jié)合的α和β亞單位組成的異二聚體。在哺乳動物中，有18個α和8個β亞單位可以組裝成24種不同的受體，不同的整合素亞型具有不同的結(jié)合形式和組織分布特點，如整合素αⅡbβ3局限于血小板；整合素α6β4局限于角質(zhì)形成細胞；整合素αEβ7局限于黏膜組織中的T細胞、樹突狀細胞和肥大細胞；整合素α4β1局限于白細胞；整合素α4β7局限于記憶性T細胞亞群；整合素αvβ6的表達僅限于上皮細胞。而整合素αVβ3廣泛分布于內(nèi)皮細胞；整合素α5β1和αvβ3在骨祖細胞和成骨細胞內(nèi)表達上調(diào)，并與成骨細胞的增殖、成骨分化和基質(zhì)礦化關(guān)系密切[12]。整合素作用幾乎涉及機體所有的生理過程，例如其通過細胞黏附這一作用在血小板凝集、創(chuàng)傷愈合、白細胞游出及機體發(fā)育等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

整合素能夠結(jié)合細胞外基質(zhì)中的成分，并調(diào)控細胞骨架構(gòu)成，從而對細胞的生存、增殖、黏附和遷移起到嚴格的控制。如在黑色素瘤從自由基生長期(radical growth phase，RGP)轉(zhuǎn)化為垂直生長期(vertical growth phase，VGP)時，許多整合素表達水平會發(fā)生變化。例如，與RGP比較，VGP中許多原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞中的整合素αvβ1和αvβ3上調(diào)，這種上調(diào)與黑色素瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)展呈正相關(guān)，同時黑色素瘤細胞對整合素αvβ3的過度表達也被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤從非致瘤性RGP轉(zhuǎn)化為具有致瘤性和侵襲性的VGP中起著重要作用[13]。此外，整合素還決定轉(zhuǎn)移部位的定殖，促進循環(huán)腫瘤細胞的錨定非依賴性存活。整合素介導的腫瘤間質(zhì)的感知、硬化和重塑是支持侵襲、獲得腫瘤干細胞特征和耐藥性癌癥進展的關(guān)鍵步驟[14]。如整合素αvβ3與多種趨化因子(如 CXCL12、IL8)、炎癥因子(如 TNF、COX)、生長因子(如 IGF、TGF)等密切關(guān)聯(lián)，被認為是前列腺癌和乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機制[15]。

2 整合素αvβ3的生物學特性

整合素αvβ3是由αv和β3亞基組成的大型跨膜異二聚體蛋白，通過識別骨橋蛋白、玻連蛋白和纖維連接蛋白等配體中保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序介導細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)的黏附[16]。整合素是一類有“由內(nèi)而外”和“由外向內(nèi)”兩種信號傳遞方式的雙向信號分子。整合素激活主要由β亞基發(fā)生構(gòu)象變化而實現(xiàn)，在“由內(nèi)而外”的信號傳遞過程中，β3亞單位的短胞質(zhì)尾通過與talin和kindlin結(jié)合，將整合素與肌動蛋白細胞骨架相連，引起構(gòu)象變化，以高親和力結(jié)合的形式重組整合素，從而增加αvβ3對細胞外配體的親和力[17]。整合素與細胞骨架結(jié)合后，可以協(xié)調(diào)細胞遷移與ECM的相互作用、抑制促凋亡蛋白的存活信號，ECM還能釋放出若干驅(qū)動細胞周期的生長因子，同時整合素αvβ3的信號傳導還可與多種生長因子受體如EGF受體(EGFR)和TGF-β受體(TGFBR)等協(xié)同作用，也可與下游通路(如TGFBRII)直接相互作用[18]。另外研究表明，整合素αvβ3在破骨細胞介導的骨吸收、血管生成和凋亡細胞的吞噬過程中起著重要作用[16]。

3 整合素αvβ3參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的可能機制

3.1 整合素αvβ3在骨肉瘤中異常表達

研究顯示：整合素αvβ3在骨肉瘤中呈過度表達，其在腫瘤血管內(nèi)皮細胞中表達上調(diào)尤為明顯[19]，多項研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3表達的改變與骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以作為骨肉瘤轉(zhuǎn)移潛能的指標[19]。例如，有研究評估了整合素αvβ3在人骨肉瘤143B細胞系子細胞LM1-LM4中的表達，該子細胞轉(zhuǎn)移潛力增大。在裸鼠脛骨原位移植時，LM1-LM4的轉(zhuǎn)移率比143B母系細胞高18倍，而整合素αvβ3的表達水平高6倍[19]。另外在親代SAOS細胞系中發(fā)現(xiàn)了使其肺轉(zhuǎn)移潛力增加的LM2-LM7子細胞，并觀察到整合素αvβ3表達與轉(zhuǎn)移率直接相關(guān)。與親代非轉(zhuǎn)移性SAOS細胞比較，LM2-LM7細胞對肺組織的趨化活性更強，并且在肺組織中的遷移能力比在其他臟器內(nèi)皮細胞中的特異性更強[19]，并且在肺組織中的遷移能力，這種情況與臨床上骨肉瘤轉(zhuǎn)移幾乎只發(fā)生在肺部的情況相符合，亦能解釋骨肉瘤患者早期肺轉(zhuǎn)移這一臨床特征。

有研究評估了整全素αvβ3在趨化和凋亡過程中發(fā)揮作用的各種途徑之間的相互作用。例如，整合素αvβ3與組織抑制物金屬蛋白酶-1 (TIMP-1)的相互作用可使MG-63 人骨肉瘤細胞抵抗腫瘤壞死因子-α (TNF-α)誘導的凋亡。在骨肉瘤特定環(huán)境下，用TNF-α干預MG-63細胞導致TIMP-1分泌增加5倍，且整合素αvβ3上調(diào)，這與凋亡抵抗有關(guān)[16]。此外，整合素αvβ3還可以與其他因素共同表達。整合素αvβ3與FN共同表達形成的FN-αvβ3軸通過上調(diào)整合素連接激酶(integrin linked kinase，ILK)的活性來促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.2 整合素αvβ3參與腫瘤血管生成

血管生成在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，整合素αvβ3在腫瘤血管生成中發(fā)揮了核心作用。整合素表達在血管內(nèi)皮細胞的有腔面和無腔面,介導內(nèi)皮細胞的遷移和毛細血管管腔的形成，而血管生成依賴生長因子和黏附分子的相互作用，生長因子傳導的信號使細胞連接到ECM并促進有絲分裂是大多數(shù)正常細胞增殖所必需的，這提示整合素和生長因子信號通路在某些位點相遇。整合素αvβ3在堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 的刺激下表達上升,提示FGF 可能是通過上調(diào)整合素αvβ3來促進血管生成；整合素αvβ3能與多種含有RGD序列的配體分子結(jié)合,引導血管內(nèi)皮細胞侵入ECM而發(fā)揮促進血管生成的作用；整合素αvβ3通過結(jié)合和激活新血管遷移端的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)，破壞ECM，促進血管生成，進而增強其遷移和浸潤能力[20]。臨床研究表明，使用抗體或低分子量拮抗劑靶向整合素αvβ3功能可抑制多種模型中的血管生成，包括腫瘤血管和氧化性視網(wǎng)膜病變中的新生血管[21]。

3.3 整合素αvβ3具有“原癌”特征

通常認為整合素與細胞骨架重組和黏附斑形成有關(guān)，但在許多病理變化中整合素也表現(xiàn)出其他異常的功能。例如，盡管整合素本身與細胞惡性轉(zhuǎn)化無關(guān)，但他與多種腫瘤蛋白，如SRC家族激酶、黏附斑激酶FAK、酪氨酸激酶受體等聯(lián)系密切，在腫瘤的發(fā)病機制中可能具有更重要的意義，被稱為原癌整合素(pro-oncogenic integrins)。例如表達整合素αvβ3的腫瘤細胞，從細胞外基質(zhì)中分離出來，能在體外以非錨定方式增強腫瘤細胞生長，并以獨立于FAK激活的機制促進腫瘤細胞存活。另外整合素αvβ3激活使下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇激酶(PI3K)/Akt和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化進而調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、侵襲和細胞存活。這些發(fā)現(xiàn)揭示了整合素αvβ3在錨定非依賴性腫瘤細胞生長和侵襲性中的“原癌”特征[22]。課題組對學科積累的骨肉瘤標本進行了組織染色分析和基因蛋白表達檢測，發(fā)現(xiàn)不同級別骨肉瘤細胞表面整合素的表達具有不同特征。

3.4 整合素αvβ3調(diào)控TME的相互作用

研究提示，整合素αvβ3協(xié)調(diào)并參與了骨肉瘤TME中相關(guān)細胞如巨噬細胞、成纖維細胞及破骨細胞的分化和凋亡。例如，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)是機體單核細胞前體在特定條件下從體液循環(huán)遷移至TME內(nèi)，在重構(gòu)的ECM蛋白和腫瘤干細胞特定刺激下發(fā)生了結(jié)構(gòu)和功能改變的一類巨噬細胞。巨噬細胞前體在IFN-γ或LPS的刺激下可分化為具有抗腫瘤特征的TAM(M1型)。而在如IL-4、IL-13、寄生蟲感染等特定情況下，M1型TAM會向致瘤效應(yīng)的M2型分化。TAM功能失調(diào)，特別是M1/M2極化失穩(wěn)是骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要特征[23]。

成纖維細胞是結(jié)締組織中最常見的細胞，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞(mesenchymal cell)分化而來。腫瘤相關(guān)成纖維細胞 (cancer associated fibroblasts，CAFs) 作為TME中的主要細胞類型，其生物學特性具有來源、表型和功能異質(zhì)性，通過產(chǎn)生和分泌各種趨化因子促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，CAFs可介導腫瘤干細胞支持腫瘤生成、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外CAFs可促進SDF-1、TGF-β1、IL-6和MMP-9的分泌，以促進癌細胞的脫離和侵襲[24]。在體外細胞模型中，成纖維細胞的多種細胞外基質(zhì)成分，可招募特定的整合素受體，如整合素αvβ3可以維持cEDS、vEDS、hEDS、HSD和ATS等真皮成纖維細胞的細胞黏附能力，促進腫瘤細胞分裂增殖[18]。

破骨細胞是骨肉瘤TME中的另一種具有組織特異性的單核巨噬細胞，有別于TAM的腫瘤炎癥和免疫功能，骨肉瘤微環(huán)境中的破骨細胞存在高效集中、增殖、分化、激活的特點，腫瘤特異性整合素αvβ3促進骨溶解的分子機制仍在探索中，但研究表明，整合素αvβ3信號傳導導致轉(zhuǎn)錄因子 Runx2上調(diào)了基質(zhì)金屬蛋白酶(如MMP-9，MMP-13)的表達。另外整合素αvβ3可增強TGF-β信號表達，該信號已被證明可刺激腫瘤細胞PTHrP的表達和RANKL在成骨細胞表達，從而促進破骨細胞介導的骨破壞[16]。

4 基于整合素αvβ3的靶向治療進展

整合素αvβ3在高度惡性的骨肉瘤中特異表達提示其可能是骨肉瘤的一個有前景的治療靶點。

4.1 整合素αvβ3的單克隆抗體或拮抗劑抑制整合素的功能

整合素αvβ3抗體對體外培養(yǎng)的MG-63人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力有明顯的抑制作用，其作用表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。DEMIRCIOGLU等[21]在一項調(diào)查研究中提到，CNTO 95是一種整合素αvβ3特異性的人源性單克隆抗體，在體外和體內(nèi)均可抑制腫瘤生長和血管生成，而整合素αvβ3的人源性單克隆抗體LM609(Vitaxin)對腫瘤生長有明顯抑制作用。TOME等[25]使用環(huán)RGD肽拮抗劑echistatin對高轉(zhuǎn)移的LM1-LM4細胞系進行了體外分子靶向藥物測試，結(jié)果提示該拮抗劑顯著降低LM1-LM4細胞系在體外的增殖、遷移、侵襲和黏附能力。ALDAY-PAREJO等[26]報道整合素αvβ3和αvβ5雙重拮抗劑 SCH221153能有效地抑制血管生成和腫瘤生長，對皮內(nèi)注射或皮下注射人黑色素瘤LOX細胞誘導的嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的腫瘤生長具有顯著的抑制作用。

4.2 整合素αvβ3介導的基因治療

以整合素為靶點,通過基因傳遞影響血管生物學，誘導內(nèi)皮細胞大量凋亡,有望成為抗腫瘤血管生成的新戰(zhàn)場。有研究用陽離子納米粒子(NP)與整合素αvβ3靶向配體結(jié)合形成一種小顆粒復合物(αvβ3-NP)，該復合物能選擇性地與整合素αvβ3受體結(jié)合并抑制突變的Raf基因，阻斷內(nèi)皮細胞信號傳導和血管生成，動物實驗中，向小鼠體內(nèi)注射αvβ3-NP復合物，可導致腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞凋亡和已建立的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的持續(xù)消退[27]。

4.3 整合素αvβ3介導的適配體(aptamer)

適配體是一種單鏈核苷酸制備的分子探針，具有靈活的三維構(gòu)型，以高親和力和高度特異性的方式識別和結(jié)合其同源靶點，包括腫瘤表面受體整合素αvβ3、αvβ1等。由于其獨特的內(nèi)在特性，許多適配體可以與骨肉瘤關(guān)鍵基因特異性結(jié)合以定向地將抗癌藥物轉(zhuǎn)移到腫瘤部位，以減少系統(tǒng)的細胞毒性，并增強這些殺瘤劑的滲透性進而達到抑制腫瘤基因轉(zhuǎn)錄和表達的目的[24]。

4.4 整合素αvβ3介導的其他治療

本課題組研究探討了一種新型重組蛋白修飾的仿生陶瓷界面對表面參數(shù)和細胞行為的影響。將設(shè)計制備的重組纖維連接蛋白/鈣粘蛋白復合脂(rFN/CDH)重組蛋白和重組纖維連接蛋白/鈣粘蛋白-紫杉醇復合體(rFN/CDH-PTX)納米顆粒通過層層自組裝技術(shù)嫁接在雙向磷酸鈣(BCP)表面，發(fā)現(xiàn)該界面可以與整合素α5β1和αvβ3特異性結(jié)合，高效誘導間充質(zhì)干細胞MSC的黏附和骨肉瘤細胞的定向募集，且與界面成骨細胞和骨腫瘤細胞特異性表達的整合素高度相關(guān)，這些結(jié)果表明rFN/CDH具有誘導BCP表面增強黏附、增殖和骨化的功能，有望成為一種有前途的組織工程支架材料用于腫瘤型骨缺損的修復重建[28-29]。

5 展 望

綜上所述，眾多研究結(jié)果表明整合素αvβ3在骨肉瘤中異常表達，通過TME內(nèi)復雜的分子信號調(diào)節(jié)骨肉瘤相關(guān)細胞的運動、遷移、黏附和侵襲，從而影響骨肉瘤的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制，因此可以推斷整合素αvβ3可以作為腫瘤治療的重要靶點。理論上以整合素αvβ3為靶點進行抗腫瘤治療既可抑制血管生成，又可促進腫瘤細胞凋亡，但由于整合素αvβ3的機制錯綜復雜，目前只停留在體外實驗研究上，未能通過臨床試驗證明其療效。未來研究中整合素仍然是腫瘤治療的有效靶點，但是需要新的臨床前模型和針對骨肉瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)化研究，為開發(fā)研制治療骨肉瘤的新藥提供理論依據(jù)。