楊秀梅，楊 雨，王丹陽(yáng)，張愛(ài)蓮

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046)

中草藥含有多種免疫調(diào)節(jié)成分，中草藥中的黃酮、多糖以及皂苷等具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用[1-3]。近年來(lái)，中草藥活性成分作為有效的免疫刺激物在防治人和動(dòng)物多種疾病中發(fā)揮了重要的作用。補(bǔ)益類(lèi)中藥一般均能較好地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體的免疫力，且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒副作用，是良好的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，作為天然、安全生物活性成分的來(lái)源用于動(dòng)物和人類(lèi)傳染病的防治有著不可替代的優(yōu)勢(shì)。

新疆荒漠肉蓯蓉 (Cistanchedeserticola)為列當(dāng)科植物，產(chǎn)于我國(guó)新疆等荒漠化干旱地區(qū)，是一種具有極高藥用價(jià)值的中草藥，有“沙漠人參”的美譽(yù)，作為補(bǔ)益類(lèi)中藥在中國(guó)等地被普遍用作滋補(bǔ)食品已有多年歷史[4-6]。研究者對(duì)肉蓯蓉已經(jīng)做了大量的研究，主要針對(duì)肉蓯蓉有效成分分離、藥理作用，藥物療效，肉蓯蓉的化學(xué)組成等方面開(kāi)展了深入而細(xì)致的研究，分離了百余種化合物，包括苯乙醇苷、木脂素類(lèi)及生物堿和多糖等成分[7-9]，可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，具有抗衰老、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等作用[10-14]。由于不同中草藥的活性成分含量有很大的差別，從具有免疫活性的中草藥中進(jìn)行廣泛篩選，尋找合適的中草藥活性成分對(duì)于動(dòng)物和人類(lèi)各種疾病的防治具有實(shí)際的意義。

為了闡明新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物對(duì)特異性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性質(zhì)和強(qiáng)度，基于中藥有效成分可以通過(guò)激活抗原提呈細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)的成熟和功能而發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]，本研究以新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物為研究材料，OVA為抗原，采用皮下途徑免疫小鼠，檢測(cè)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，以及促進(jìn)DCs成熟和對(duì)Treg的影響，通過(guò)深入探究新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物對(duì)OVA特異性免疫應(yīng)答的特點(diǎn)和作用機(jī)制的初步研究，為篩選具有良好免疫調(diào)節(jié)作用的中草藥活性成分的研究和新型疫苗佐劑的發(fā)現(xiàn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康ICR小鼠，雌性(5～6周齡，體重18～22 g) 購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。新疆野生荒漠肉蓯蓉(EEWCD，其中，苯乙醇苷類(lèi)化合物含量為17.12%，作者實(shí)驗(yàn)室制備)[18]；OVA、噻唑藍(lán)(MTT)、刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA) 和脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 均購(gòu)自Sigma公司；鋁佐劑 (Imject Alum Adjuvant, Alum)購(gòu)自Thermo公司；羊抗鼠過(guò)氧化物酶抗體(IgG-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP)購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司；Cytofix/Cytoperm buffer、Perm/Wash buffer、CD4-FITC、CD8-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-APC、CD11c-PE、CD40-FITC、CD80-APC、CD86-APC和MHCII-FITC抗體購(gòu)自BD公司。Treg染色試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。其他各類(lèi)試劑和耗材均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口產(chǎn)品。

1.2 免疫及分組

EEWCD用Tween-20:0.9% NaCl =1∶9溶解。EEWCD與溶解在0.9% NaCl 的OVA配制成疫苗后備用。小鼠免疫抗體檢測(cè)分組見(jiàn)表1，共分為7組，每組5只小鼠，0.9% NaCl 組為空白對(duì)照組，EEWCD為對(duì)照組，Alum和OVA為陽(yáng)性對(duì)照組，其他組為試驗(yàn)組。皮下免疫兩次，間隔2周，免疫前眼眶采集小鼠血，制備血清后用于抗體檢測(cè)。MTT、細(xì)胞因子、DCs及Treg檢測(cè)采用同樣的策略免疫小鼠，免疫分組見(jiàn)表1，在抗體檢測(cè)分組的基礎(chǔ)上增加了Tween-20為對(duì)照組。

表1 小鼠抗體水平、MTT檢測(cè)分組設(shè)計(jì)(n=5)

1.3 EEWCD免疫小鼠后抗體滴度及亞類(lèi)檢測(cè)

EEWCD與OVA皮下免疫小鼠后，小鼠眼眶采血，收集初免疫后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清，間接ELISA法檢測(cè)OVA特異性IgG抗體滴度及分型：將OVA抗原(2.5 μg·mL-1)包被96孔板后4 ℃ 過(guò)夜。將稀釋好的血清加入到96孔板中37 ℃ 孵育1 h。 接著，加入IgG-HRP、IgG1-HRP和IgG2a-HRP的抗體稀釋液到96孔板中，37 ℃避光1 h。加入TMB顯色液，避光顯色10～20 min后，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD450 nm/OD655 nm的值。

1.4 EEWCD免疫小鼠后對(duì)脾細(xì)胞增殖的檢測(cè)

ELISA檢測(cè)初次免疫后21 d小鼠血清中IgG抗體水平，驗(yàn)證抗體有效后，采用MTT法檢測(cè)EEWCD對(duì)脾細(xì)胞的增殖作用：制備初次后21 d脾單細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板后，分別加入20 μL 濃度為10 μg·mL-1的 OVA、10 μg·mL-1的 OVA323-339、5 μg·mL-1的ConA和5 μg·mL-1的 LPS刺激細(xì)胞48 h，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，未處理的空細(xì)胞和空培養(yǎng)基為對(duì)照。刺激后加入20 μL 的5 mg·mL-1的MTT，37 ℃孵育3～4 h，棄上清后，加入DMSO溶解甲瓚顆粒后，檢測(cè)OD570 nm/OD630 nm值，計(jì)算刺激指數(shù)SI (stimulation index, SI)：(OD處理- OD培養(yǎng)基)/(OD未處理-OD培養(yǎng)基)。

1.5 FCAS檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子

采用FACS進(jìn)行CD4+IL-4、CD4+IFN-γ和CD8+IFN-γ的檢測(cè)，具體步驟：初次免疫后21 d，制備脾單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107個(gè)·mL-1， 單細(xì)胞懸液鋪到24孔板細(xì)胞培養(yǎng)中，OVA刺激4 h，加入Golgi stop繼續(xù)孵育12 h，收集細(xì)胞，Perm/Washing buffer洗滌2次，先進(jìn)行細(xì)胞表面分子CD4-FITC和CD8-FITC染色，避光20 min，細(xì)胞用Cytofix/Cytoperm buffer進(jìn)行固定和破膜后，Perm/Washing buffer洗滌細(xì)胞后，分別加入IL-4和IFN-γ，避光孵育15～20 min，Perm/Wash buffer洗滌細(xì)胞后，F(xiàn)ACS檢測(cè)，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.6 FCAS檢測(cè)DCs表面分子

采用FCAS檢測(cè)EEWCD對(duì)小鼠脾中DCs的成熟和Treg的影響：制備初次免疫后21 d 脾單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌細(xì)胞后，進(jìn)行DCs表面分子CD11c-PE、CD40-FITC、CD80-APC、CD86-APC和MHCII-FITC避光染色20 min，F(xiàn)ACS檢測(cè)，F(xiàn)lowJo分析結(jié)果。

1.7 FCAS檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞

用eBioscience試劑盒進(jìn)行檢測(cè)EEWCD對(duì)小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的影響，具體操作：PBS洗滌脾單細(xì)胞，CD4-APC和CD25-FITC細(xì)胞避光染色20 min，用eBioscience Fixation/Permeabilization buffer的進(jìn)行固定破膜細(xì)胞，室溫孵育20 min，Permeabilization buffer洗滌后，加入PBS后，F(xiàn)CAS檢測(cè)，F(xiàn)lowJo分析結(jié)果。

1.8 EEWCD對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況的影響

EEWCD皮下免疫小鼠后，在免疫前和免疫后不同時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠行為，測(cè)量小鼠體重，觀察小鼠的日常行為，同時(shí)，檢測(cè)EEWCD免疫后對(duì)小鼠體重的影響，初步判斷EEWCD免疫小鼠后的安全性。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 EEWCD對(duì)OVA特異性抗體滴度的影響

為了檢測(cè)EEWCD對(duì)體液免疫的影響，采用ELISA檢測(cè)了初免后14、21、35和49 d小鼠血清中OVA特異性的抗體滴度。從圖1中可以看出，EEWCD的抗體滴度與0.9% NaCl空白對(duì)照組相當(dāng)，免疫后各組的抗體滴度隨著免疫時(shí)間的增加抗體水平有所增加，與OVA處理組相比，EEWCD-M組和EEWCD-H組在21、35和49 d均能夠提高OVA特異性抗體2倍左右，抗體滴度為18萬(wàn)～24萬(wàn)，Alum 組的抗體滴度為24萬(wàn)～30萬(wàn)。EEWCD-M組和EEWCD-H組抗體水平高于EEWCD-L組，EEWCD-M為最佳劑量組，Alum組為抗體水平最高劑量組。這些結(jié)果表明，EEWCD可以提高體液免疫水平。

圖1 初免后不同時(shí)期EEWAR對(duì)OVA特異性抗體滴度的影響(n=5)Fig.1 Detection of IgG titer in different time after immunization(n=5)

2.2 EEWCD對(duì)OVA特異性抗體亞類(lèi)的影響

小鼠初免后35 d對(duì)其抗體分型進(jìn)行了檢測(cè)，圖2的結(jié)果表明，EEWCD-M和EEWCD-H極顯著促進(jìn)OVA特異性IgG水平(P<0.01)，顯著促進(jìn)了IgG1的水平(P<0.05)，與鋁佐劑沒(méi)有顯著差異(P>0.05)； EEWCD-M極顯著促進(jìn)IgG2a的水平(P<0.01)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)，EEWCD-H顯著促進(jìn)IgG2a的水平(P<0.05)，與Alum相比差異不顯著(P>0.05)。這表明EEWCD不僅可以提高體液免疫水平，也可以促進(jìn)Th1和Th2的免疫反應(yīng)，與Alum相比，尤其是可以促進(jìn)Th1的反應(yīng)。

2.3 EEWCD對(duì)脾細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法進(jìn)行了EEWCD對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的檢測(cè)。首先，采用間接ELISA檢測(cè)小鼠初免后21 d抗體水平，如圖3 A所示，EEWCD-L、EEWCD-M和EEWCD-H均能夠顯著或極顯著促進(jìn)抗體水平(P<0.05或P<0.01)，Alum也能夠極顯著促進(jìn)抗體水平(P<0.05)，EEWCD-M為最佳劑量，且與Alum之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。在此基礎(chǔ)上，采用MTT法檢測(cè)了EEWCD對(duì)脾細(xì)胞增殖的影響，如圖3B-E所示，在OVA和OVA323-339刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M和EEWCD-H均能夠顯著或極顯著促進(jìn)脾細(xì)胞增殖水平(P<0.05或P<0.01)，EEWCD-M和EEWCD-H的刺激作用顯著高于Alum (P<0.05)，EEWCD-M為最佳劑量。在ConA和LPS刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M、EEWCD-H和Alum對(duì)脾細(xì)胞增殖的作用也達(dá)到了顯著或極顯著的水平(P<0.05或P<0.01)， EEWCD-M和EEWCD-H顯著高于Alum(P<0.05)，且EEWCD-M為最佳劑量。試驗(yàn)結(jié)果表明，EEWCD可以促進(jìn)OVA特異性的脾細(xì)胞增殖。

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01;與Alum組相比，#.P<0.05 Compared with OVA group, *. P<0.05; **.P<0.01; Compared with Alum group, #.P<0.05圖2 EEWCD對(duì)OVA特異性抗體亞型的影響(n=5)Fig.2 Effects of the EEWCD on OVA-specific IgG subclasses (n=5)

2.4 EEWCD對(duì)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用

細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和防御感染中起重要的作用。為了檢測(cè)EEWCD對(duì)IL-4和IFN-γ分泌的影響，EEWCD加強(qiáng)免疫7 d后，分離制備小鼠脾單細(xì)胞懸液，與OVA抗原體外共培養(yǎng)后進(jìn)行CD4+/IL-4、CD4+/IFN-γ、CD8+/IFN-γ染色，F(xiàn)ACS檢測(cè)結(jié)果如圖4，EEWCD-M顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞IL-4和IFN-γ的分泌(P<0.05)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)；EEWCD-M極顯著促進(jìn)CD8+T細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生(P<0.01)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)。綜上表明，EEWCD可以促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，尤其促進(jìn)了IFN-γ的產(chǎn)生。

2.5 EEWCD對(duì)DCs成熟的影響

DCs在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，采用FACS檢測(cè)了初免后21 d小鼠脾細(xì)胞中DCs共刺激分子CD80、CD40、CD86和MHCII的表達(dá)水平，探究EEWCD對(duì)DCs成熟的影響。從圖5可以看出，EECCD-M極顯著CD40的表達(dá)水平(P<0.01)， EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H均能夠極顯著促進(jìn)CD80和MHCII的表達(dá)(P<0.01)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)。EWCCD-M、EWCCD-H和Alum可以顯著增強(qiáng)CD86的表達(dá)(P<0.05)，與Alum相比差異不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果表明，EEWCD可以促進(jìn)DCs的成熟。

2.6 EEWCD對(duì)Treg的影響

為了更好地了解EEWCD在免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)作用，小鼠加強(qiáng)免疫后7 d，利用FACS檢測(cè)了CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的變化。如圖6所示，與OVA組相比，EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H極顯著降低了CD4+CD25+Foxp3+Treg頻率(P<0.01)，Alum也極顯著降低了Treg頻率(P<0.01)，EWCCD處理組和Alum組沒(méi)有顯著差異，EEWCD可以顯著下調(diào)Treg的水平。

2.7 EEWCD免疫小鼠對(duì)體重的影響

EEWCD免疫小鼠后，觀察小鼠的日常行為，每周稱(chēng)量小鼠的體重，觀察整個(gè)免疫期間EEWCD對(duì)小鼠的影響。在整個(gè)免疫期間小鼠無(wú)任何異常行為，如沒(méi)有脫毛、拒食等現(xiàn)象，在同一時(shí)間點(diǎn)，各組體重之間無(wú)顯著差異(P<0.01)，同一組小鼠隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)體重也在不斷增加，詳見(jiàn)表2。

3 討 論

中草藥在動(dòng)物和人類(lèi)疾病治療中起著重要的作用，如黃芪多糖作為口蹄疫疫苗的免疫增強(qiáng)劑能夠提供更好的免疫保護(hù)作用，枸杞多糖可通過(guò)抑制炎癥改善過(guò)敏性哮喘，人參醇提物具有良好的抗炎活性等[19-22]，由于中草藥活性成分良好的免疫調(diào)節(jié)活性和安全性，因此，許多中草藥用于免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)的篩選研究。本研究選取新疆荒漠地區(qū)的益補(bǔ)類(lèi)中藥荒漠肉蓯蓉醇提物為研究材料，已有研究表明，肉蓯蓉醇提物中主要活性成分是苯乙醇苷，具有抗炎，抗病毒，免疫調(diào)節(jié)等多種功能[9,23-26]。利用已經(jīng)建立的體內(nèi)疫苗佐劑篩選平臺(tái)，采用動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)荒漠肉蓯蓉醇提物進(jìn)行體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性評(píng)價(jià)，通過(guò)檢測(cè)DCs成熟和Treg的表達(dá)來(lái)初步分析其作用機(jī)制。在動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)EEWCD針對(duì)OVA抗原具有良好的免疫增強(qiáng)活性，在EEWCD免疫的小鼠中未觀察到炎癥反應(yīng)和異常行為，提示EEWCD具有一定的安全性。

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; 與Alum組相比，#.P<0.05, ##.P<0.01, ###.P<0.001 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with Alum group, #.P<0.05, ##.P<0.01, ###.P<0.001圖3 EEWCD對(duì)脾細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of EEWCD on splenic lymphocyte proliferation

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01； 與Alum組相比，#.P<0.05 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with Alum group, #.P<0.05圖4 EEWCD對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞IL-4和IFN-γ分泌的影響Fig.4 Analysis of EEWCD on IL-4 and IFN-γ in CD4+ and CD8+ T cells

中草藥活性成分對(duì)非特異和特異性免疫反應(yīng)及各類(lèi)免疫細(xì)胞的功能有明顯的調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)T/B淋巴細(xì)胞的活化、抗原遞呈細(xì)胞的成熟和功能[27-28]，且這些免疫調(diào)節(jié)作用存在一定的量效關(guān)系[29]。試驗(yàn)中篩選到EEWCD-M和EEWCD-H提高OVA特異性IgG抗體滴度2～3倍，僅次于Alum，且EEWCD沒(méi)有免疫原性。從MTT試驗(yàn)中可以看出，與Alum相比，EEWCD的3個(gè)劑量都可以更好地促進(jìn)OVA和OVA323-339特異性的脾細(xì)胞增殖，激活T/B細(xì)胞，EEWCD-M為最佳劑量。這些結(jié)果說(shuō)明EEWCD通過(guò)激發(fā)有效的B/T淋巴細(xì)胞促進(jìn)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01； 與Alum組相比，#.P<0.05 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with Alum group, #.P<0.05圖5 EEWCD對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響Fig.5 Analysis of Co-stimulatory molecules in DCs by FACS

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01圖6 EEWCD對(duì)Treg表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of the EEWCD on Treg frequency

表2 EEWCD對(duì)小鼠體重的影響

Th1/Th2反應(yīng)是動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)所必需，Th1免疫反應(yīng)是機(jī)體抵御某些傳染病的關(guān)鍵，如口蹄疫、禽流感、豬瘟等[30-32]。為了闡明EEWCD對(duì)OVA抗原的Th1/Th2免疫效應(yīng)特點(diǎn)，本研究結(jié)果顯示，EEWCD-M和EEWCD-H可以增強(qiáng)IgG1(Th2)和IgG2a(Th1)的抗體水平，尤其可以增強(qiáng)IgG2a的水平，效果優(yōu)于Alum，Alum只能顯著促進(jìn)IgG1抗體水平；細(xì)胞因子檢測(cè)的結(jié)果表明，EEWCD-M 顯著促進(jìn)了CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ，效果優(yōu)于Alum。這部分研究結(jié)果說(shuō)明EEWCD增強(qiáng)了對(duì)OVA抗原特異性的Th1/Th2免疫反應(yīng)，尤其可以促進(jìn)IFN-γ的分泌增強(qiáng)Th1免疫反應(yīng)，這對(duì)于各種動(dòng)物傳染病的防治有積極的意義。

DCs在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。DCs通過(guò)捕獲和遞呈抗原激活抗原特異性T細(xì)胞，分泌免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，調(diào)控B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的功能，DCs的激活或成熟對(duì)免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，很多中草藥活性成分可以通過(guò)促進(jìn)DCs的成熟和功能促進(jìn)特異性的免疫反應(yīng)[1，15，33]。Treg細(xì)胞可提高體液和細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡[34]。為了初步闡明EEWCD增強(qiáng)OVA特異性免疫反應(yīng)的機(jī)制，F(xiàn)ACS檢測(cè)了免疫后小鼠脾中DCs的成熟情況，結(jié)果顯示，EEWCD-M顯著上調(diào)了DCs的表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-II的表達(dá)，下調(diào)了Treg的表達(dá)，說(shuō)明EEWCD可以通過(guò)促進(jìn)DCs的成熟和抑制Treg頻率來(lái)提高OVA特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

4 結(jié) 論

通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)EEWCD對(duì)OVA特異性免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，EEWCD可以通過(guò)激活DCs，下調(diào)Treg，增加抗體水平，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而增強(qiáng)Th1和Th2應(yīng)答，尤其可以增強(qiáng)Th1的反應(yīng)，EEWCD展示出了良好的免疫調(diào)節(jié)活性。