劉元杰，張 媛，王秀麗，張一幟，李 建，李俊平

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

目前我國動(dòng)物疫苗佐劑仍然以鋁鹽佐劑為主，除此之外，也有油乳和蜂膠等佐劑疫苗批準(zhǔn)生產(chǎn)并投入使用。佐劑是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑，可輔助特異性抗原進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為，佐劑對(duì)疫苗作用的促進(jìn)主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是增加疫苗的穩(wěn)定性，從而延長疫苗作用時(shí)間；二是激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增加疫苗作用強(qiáng)度。

目前針對(duì)新型疫苗佐劑的研究很多，主要有鋁鹽佐劑、油乳佐劑、天然佐劑、脂質(zhì)體佐劑、納米粒子佐劑、細(xì)胞因子佐劑等，部分新型佐劑已經(jīng)普遍應(yīng)用，還有部分正在研究和不斷完善中。

1 鋁鹽佐劑

鋁鹽佐劑早在1926年就已經(jīng)被批準(zhǔn)使用，在此后也一直被廣泛應(yīng)用，直到現(xiàn)在仍然是動(dòng)物疫苗中最主要的佐劑。鋁鹽佐劑可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，而且不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副反應(yīng)，具有較好的安全性[1]。鋁鹽佐劑價(jià)格低廉、工藝成熟，但也存在一定的缺點(diǎn)，如注射部位的紅腫、過敏反應(yīng)，不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答等。近年來，分子生物學(xué)和基因工程學(xué)發(fā)展迅猛，多種DNA疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗相繼上市，傳統(tǒng)鋁鹽佐劑分子質(zhì)量小、免疫原性差等問題開始突顯，已不能滿足新型疫苗的更高要求。

2 油乳佐劑

油乳佐劑按油料區(qū)別可分為礦物油佐劑和非礦物油佐劑，按分散狀態(tài)不同分為水包油、油包水和雙相型乳液三種形式。目前應(yīng)用和研究較多的油乳佐劑有白油佐劑、MF59、AS03等。

2.1 白油佐劑 目前市場上的動(dòng)物油佐劑疫苗大多為白油佐劑。白油佐劑為礦物油佐劑，可以使抗原免疫時(shí)間延長，減少免疫次數(shù)。但其存在因黏度大導(dǎo)致的注射困難和注射部位炎癥反應(yīng)的問題。研究表明，影響白油佐劑免疫效果的主要因素為芳烴、重金屬含量和白油運(yùn)動(dòng)的黏度兩方面[2]。白油粒子的均一性對(duì)疫苗免疫效果影響不大，但是均一性更高的白油佐劑引起的炎癥反應(yīng)更輕[3]。

2.2 MF59 MF59是最具代表性的水包油佐劑，主要成分是角鯊烯，在肝臟中自然合成，易于降解。MF59中兩種非離子表面活性劑吐溫80和span85(山梨酸酐三油酸酯)可以起到穩(wěn)定油滴的作用，從而增加疫苗作用時(shí)間。MF59誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的體液免疫效果明顯高于鋁鹽佐劑，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫反應(yīng)。有研究顯示MF59可以產(chǎn)生Th1型和Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，但是未發(fā)現(xiàn)CD8+毒性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的報(bào)道[4]。MF59已經(jīng)應(yīng)用于部分亞單位疫苗中，其安全性高，擴(kuò)散快，而且不形成抗原儲(chǔ)庫[5]，但需要抗原與佐劑免疫相同位置才能增強(qiáng)免疫反應(yīng)。有學(xué)者將自主構(gòu)建的H7N9禽流感病毒疫苗加MF59制備成品疫苗，驗(yàn)證了以MF59為佐劑的禽流感疫苗不僅具備長期免疫原性[6]，而且有良好的穩(wěn)定性，在2～8 ℃至少可保存30個(gè)月[7]。

2.3 AS03 AS03是葛蘭素史克公司在2009年研發(fā)的一種佐劑系統(tǒng)，與MF59相比，增加了一種主要成分α-生育酚。該物質(zhì)可以增加誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平，促進(jìn)單核細(xì)胞的抗原攝取水平，進(jìn)一步提高誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平[8]。目前AS03已經(jīng)被用于H5N1流感病毒疫苗[9]和 H7N9 流感病毒疫苗[10]臨床試驗(yàn)階段的研究。

新型油乳佐劑的研究還有很多，如同樣由葛蘭素史克公司研發(fā)的AS02已經(jīng)被應(yīng)用于結(jié)核病的臨床試驗(yàn)階段[11]。姜佳琪等[12]對(duì)SP01佐劑進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，驗(yàn)證了其無毒，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無過敏性反應(yīng)。

油乳佐劑通過油乳本身對(duì)抗原的包裹使抗原可以在機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在，從而使抗原刺激的時(shí)間延長，免疫效果大幅提高[13]。但也正是因?yàn)橛腿樽魟┻@個(gè)特點(diǎn)，在持續(xù)的刺激下，機(jī)體中容易出現(xiàn)組織損傷、應(yīng)激反應(yīng)、礦物油的殘留等，存在一定的安全隱患。未來針對(duì)油乳佐劑的研究方向在于如何在保證其長效抗原刺激的同時(shí)進(jìn)一步提高其安全性，避免因長期存在于體內(nèi)造成各種不良反應(yīng)。

3 天然佐劑

天然佐劑主要來源于天然植物中提取的某些具有免疫活性的成份，這些成分具有毒性低、易于代謝的特點(diǎn)，主要包括蜂膠佐劑和殼聚糖佐劑等。

3.1 蜂膠佐劑 蜂膠是由從植物中提取的樹脂和蜜蜂分泌物經(jīng)特定工序加工而成的膠狀物質(zhì)，可以增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加白細(xì)胞數(shù)量，刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而使免疫效果得到顯著提高。因其為天然物質(zhì)，與其他類型佐劑相比安全性較高。翟曉虎等[14]在豬細(xì)小病毒疫苗的研制過程中比較了油佐劑與蜂膠佐劑，發(fā)現(xiàn)蜂膠佐劑可以提高豚鼠細(xì)胞免疫和早期體液免疫。趙晶[15]比較了不同類型的蜂膠佐劑和其他佐劑豬圓環(huán)病毒疫苗活性的促進(jìn)作用，結(jié)果顯示蜂膠佐劑豬圓環(huán)病毒疫苗能顯著增強(qiáng)豬群的特異性免疫和非特異性免疫，且具有良好的安全性，為蜂膠佐劑疫苗臨床推廣應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。

近年來蜂膠佐劑的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛，在特定種類疫苗中，蜂膠佐劑疫苗的生產(chǎn)數(shù)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)疫苗，有逐漸取代傳統(tǒng)疫苗的趨勢。統(tǒng)計(jì)2017-2019年部分細(xì)菌滅活疫苗批簽發(fā)數(shù)據(jù)，其中禽大腸桿菌類滅活苗、禽多殺性巴氏桿菌類滅活苗、豬鏈球菌類滅活苗三種主要細(xì)菌相關(guān)產(chǎn)品中蜂膠佐劑疫苗生產(chǎn)量占比分別為51.8%、30.4%、30.9%，從數(shù)量上看蜂膠苗在滅活苗中已經(jīng)占據(jù)了相當(dāng)大的比例。

3.2 殼聚糖佐劑 殼聚糖是天然中存在的堿性多糖，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可溶于部分無機(jī)酸中，但不溶于水。殼聚糖中游離的氨基和羥基可通過氫鍵和靜電吸引作用吸附于機(jī)體粘膜上[16]。通過作用于Toll樣受體4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的活化[17]，提高共刺激膜蛋白CD80和CD86的表達(dá)，從而激活免疫系統(tǒng)。殼聚糖能在較溫和條件下進(jìn)行一系列化學(xué)修飾，形成具有不同生物特性的衍生物[18]。殼聚糖-三磷酸鹽是近年來研發(fā)出的多聚糖衍生物，克服了殼聚糖在生理pH下溶解度低的缺點(diǎn)，延長抗原釋放時(shí)間并降低降解率，從而提高疫苗的有效性[19]。殼聚糖是存在于昆蟲甲殼中的天然物質(zhì)，在生產(chǎn)過程中成本相對(duì)較低，而且具有良好的生物相容性，安全性較高[20]。在殼聚糖類佐劑應(yīng)用的過程中，使用黏膜免疫的方法更有利于發(fā)揮其本身黏膜吸附性的優(yōu)勢。通過黏膜免疫的方法，在黏膜中可以產(chǎn)生分泌型IgA抗體，這說明殼聚糖可以促進(jìn)機(jī)體的黏膜免疫[21]。

盡管殼聚糖有著安全性和黏膜吸附性的優(yōu)勢，但在實(shí)際應(yīng)用的過程中還存在兩個(gè)主要問題。其一是溶解性低。殼聚糖本身不易溶于水，不利于在機(jī)體中發(fā)揮作用。一般可以通過化學(xué)修飾來提高其溶解性，但是在化學(xué)修飾過程中很難避免出現(xiàn)因重金屬殘留而導(dǎo)致的毒性增加。未來殼聚糖改造工藝仍然有待進(jìn)一步研究。其二是黏膜免疫在機(jī)體中存在的各種阻礙，如口服易在胃中被消化，滴鼻在鼻腔內(nèi)作用時(shí)間短等問題?？梢酝ㄟ^將殼聚糖轉(zhuǎn)化為納米粒的形式來保證疫苗在體內(nèi)的持續(xù)性。有學(xué)者將新城疫病毒F基因 DNA 疫苗封裝到殼聚糖納米粒中，促進(jìn)了黏膜免疫傳遞系統(tǒng)的持續(xù)釋放，提高了免疫效率[22]。

4 脂質(zhì)體佐劑

4.1 類病毒顆粒 類病毒顆粒是模擬病毒表面蛋白結(jié)構(gòu)的非感染性空衣殼，可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和CTL等細(xì)胞免疫反應(yīng)，還可以傳遞多肽、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[23]。不同于其他病毒樣顆粒，類病毒顆粒不是在宿主內(nèi)合成，而是在體外裝配形成，所以不具有感染性。與鋁鹽佐劑相比，類病毒顆粒具有更高的安全性，因其本身為膜蛋白，更容易降解。目前類病毒顆粒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于亞單位疫苗的載體和佐劑，如以此為基礎(chǔ)的流感疫苗和乙肝疫苗已經(jīng)上市[24]。

4.2 AS01 AS01是由單磷酸脂質(zhì)體(MPL)和皂素QS-21作為免疫激活劑輔以脂質(zhì)體組成。與一般油乳佐劑不同，QS-21的作用機(jī)制并非延長抗原在機(jī)體內(nèi)的存在時(shí)間，因?yàn)镼S-21和抗原注射機(jī)體后24 h就不能檢測出QS-21的存在[25]。AS01的作用機(jī)制在于MPL和QS-21聯(lián)合作用于抗原，將特異性免疫反應(yīng)的效力達(dá)到最大，刺激細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生[26]。2015年，應(yīng)用AS01佐劑技術(shù)研發(fā)的瘧疾疫苗已經(jīng)被歐洲藥監(jiān)局批準(zhǔn)使用。在結(jié)核病的臨床試驗(yàn)中，AS01 佐劑也作為重要的技術(shù)手段被加以應(yīng)用[27]。

4.3 AS04 AS04是由鋁鹽佐劑添加MPL制備而成，相比鋁鹽佐劑可以更高水平地誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和Th1型細(xì)胞反應(yīng)。AS04已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于人宮頸癌的預(yù)防[28]和乙型肝炎疫苗[29]。

脂質(zhì)體佐劑在安全性和免疫原性上具有顯著優(yōu)點(diǎn)，但是制作工藝復(fù)雜，成本較高。目前脂質(zhì)體佐劑主要應(yīng)用于人用疫苗，未來在大量生產(chǎn)中還有很大的技術(shù)難題需要攻破。不過其作為一種高效、安全的新型佐劑，未來在動(dòng)物疫苗領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用前景。

5 納米佐劑

納米佐劑是指用聚合物類等納米粒子材料制成的佐劑，具有獨(dú)特物理性質(zhì)，既可避免滲入血管，又可限制納米粒子在淋巴管中的傳輸速度。納米粒子佐劑的優(yōu)勢在于可通過多種途徑與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相互作用，促進(jìn)APCs的交叉遞呈，提高抗原對(duì)異型病毒的交叉保護(hù)力。而且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以在不改變藥物作用機(jī)理的條件下發(fā)揮作用。生物相容性材料的應(yīng)用促進(jìn)了其在生物體內(nèi)的吸收和降解，使納米粒子佐劑有著高于傳統(tǒng)佐劑的安全性。

PLGA(poly lactic-co-glycolic acid，聚乳酸-羥基乙酸共聚物)是一種聚合物類納米粒，在機(jī)體中可自行降解。在美國，PLGA通過食品和藥品管理局(FAD)認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典。用 PLGA 包被的禽流感病毒經(jīng)多種途徑免疫都明顯增強(qiáng)了抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[30]。簡敏捷[31]以聚乙二醇-400(PEG-400)作為材料包裹產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌(ETEC)蛋白，開辟了治療ETEC的新方法。α-甘露聚糖肽是一種聚糖類有機(jī)納米物質(zhì)，作為佐劑能夠在轉(zhuǎn)基因小鼠模型上提高E75乳腺癌疫苗的免疫效應(yīng),具有增強(qiáng)基于細(xì)胞免疫的多肽類腫瘤疫苗免疫原性的能力[32]。

目前針對(duì)于納米粒子佐劑的研究以人類腫瘤病為主。在技術(shù)上，因人與動(dòng)物本身免疫系統(tǒng)的差異導(dǎo)致在選取納米材料上存在一定的技術(shù)難題，因?yàn)椴煌{米材料理化性質(zhì)差異較大，由此免疫策略也不相同。

6 細(xì)胞因子佐劑

細(xì)胞因子是機(jī)體產(chǎn)生的具有廣泛生物調(diào)節(jié)性質(zhì)的調(diào)節(jié)因子，具有免疫佐劑效應(yīng)的細(xì)胞因子有干擾素和白細(xì)胞介素等。例如IL-2、IL-12和IFN-γ可促進(jìn)Th1細(xì)胞的刺激，從而產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，IL-4、IL-5和IL-10可促進(jìn)Th2 細(xì)胞的發(fā)育和抗體產(chǎn)生，在宿主抵御細(xì)胞外病原體中發(fā)揮著重要作用。柏玲等[33]在研制水貂阿留申病毒(ADV)VP2核酸疫苗時(shí)，構(gòu)建了IL-12、IFN-γ細(xì)胞因子真核表達(dá)質(zhì)粒，并且在體外細(xì)胞水平鑒定了上述目的基因的成功表達(dá)?？锫逗萚34]在禽腺病毒亞單位疫苗的研發(fā)過程中添加雞源白細(xì)胞介素和γ-干擾素作為免疫佐劑，增強(qiáng)了疫苗的免疫保護(hù)效果。

細(xì)胞因子佐劑在使用的過程中不僅可以促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)，也可以最大激發(fā)非特異性免疫，應(yīng)用前景十分廣泛。但是就臨床應(yīng)用而言，目前細(xì)胞因子佐劑還存在半衰期短、價(jià)格昂貴的問題[35]。除此之外，對(duì)劑量的把握也是細(xì)胞因子佐劑在應(yīng)用過程中亟待解決的難題，因?yàn)閯┝渴褂貌划?dāng)可能會(huì)導(dǎo)致潛在的自身免疫安全隱患。

7 Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)

TLRs是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR作為非催化性跨膜蛋白，可以識(shí)別微生物中具有保守結(jié)構(gòu)的分子。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時(shí)，TLR可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

目前已經(jīng)鑒定的TLRs共有15種，不同動(dòng)物所含TLRs種類略有不同，如在哺乳動(dòng)物中有13種[36]，而禽類中有10種。不同種類的TLRs功能不同，如TLR1-6和TLR10等主要在細(xì)胞表面表達(dá)，可以識(shí)別脂蛋白、肽聚糖、鞭毛等病原體細(xì)胞膜成分；TLR3、TLR7-9等又被稱為抗病毒 TLRs，可以作為胞內(nèi)受體識(shí)別細(xì)胞內(nèi)外源雙鏈RNA[37]；TLR4和TLR5可以識(shí)別細(xì)菌脂多糖和鞭毛蛋白[38]。Bashir K等[39]在IBDV疫苗中使用了TLR2 配體和TLR3 配體為佐劑，促進(jìn)了T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，維持疫苗的免疫活性，減少了IBDV疫苗的副作用。Bhardwaj R等[40]使用TLR4 配體 LPS作為雞新城疫疫苗佐劑，血液和組織樣品中IL-12、IFN-γ、IL-4和TLR4的含量和血清效價(jià)均得到一定程度的上調(diào)，驗(yàn)證了LPS引發(fā)的抗原特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的結(jié)論。

8 結(jié) 語

目前市場中獸用疫苗絕大多數(shù)仍然為鋁鹽佐劑疫苗，油乳佐劑疫苗和蜂膠苗也在市場中占重要地位。一些新型佐劑的研發(fā)是在已經(jīng)成熟應(yīng)用佐劑的基礎(chǔ)上添加新成分，如AS04在鋁鹽基礎(chǔ)上添加了MPL，鄒勇娟等[41]將白油佐劑與殼聚糖微球混合作為禽流感疫苗佐劑。未來佐劑的研發(fā)方向傾向于多種佐劑組合使用，充分發(fā)揮每種佐劑的優(yōu)勢。蜂膠佐劑在滅活疫苗中占有一定的比重，但仍然有進(jìn)一步發(fā)展的空間。以豬鏈球菌類滅活疫苗產(chǎn)品為例，雖然從數(shù)量上來看，蜂膠苗在滅活苗中占比達(dá)到30.9%，但蜂膠苗種類在滅活苗種類中占比只有16.7%。蜂膠苗產(chǎn)量大，但種類并不多，這也恰恰說明了已有蜂膠苗已經(jīng)被市場所認(rèn)可。不過，蜂膠佐劑雖然在部分特定種類疫苗中市場數(shù)據(jù)可觀，但其免疫效果仍需要進(jìn)一步跟蹤觀察，針對(duì)蜂膠佐劑的作用機(jī)理也需要進(jìn)一步研究。未來可以應(yīng)用蜂膠佐劑技術(shù)對(duì)已有傳統(tǒng)疫苗進(jìn)行升級(jí)改造，擴(kuò)大蜂膠佐劑的應(yīng)用范圍。納米佐劑、脂質(zhì)體佐劑、細(xì)胞因子佐劑等技術(shù)手段相對(duì)復(fù)雜，還有很大的技術(shù)難題需要攻破，如納米佐劑的材料選取難題和細(xì)胞因子佐劑的劑量控制難題。除此之外，成本問題也是疫苗在臨床應(yīng)用過程中必須面對(duì)的問題。當(dāng)前已經(jīng)被批準(zhǔn)使用的如MF59、AS系列佐劑和重構(gòu)流感病毒顆粒等主要應(yīng)用于人用疫苗，這些技術(shù)在未來動(dòng)物疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用具有很大空間，隨著技術(shù)的不斷完善，相信會(huì)有越來越多的新型動(dòng)物疫苗出現(xiàn)。