王艷 趙懿琛 趙德剛

摘要：為了解杜仲基因密碼子使用模式，該文以杜仲基因組密碼子為研究對(duì)象，運(yùn)用CodonW軟件對(duì)杜仲的320個(gè)蛋白編碼基因進(jìn)行同義密碼子相對(duì)使用頻率（RSCU）分析、ENCGC3s關(guān)聯(lián)分析編碼基因的密碼子ENC值、PR2plot偏倚分析編碼基因的密碼子堿基使用頻率，并運(yùn)用CUSP軟件與Codon Usage Database軟件對(duì)杜仲基因密碼子的GC含量、使用頻率與代表性物種煙草、擬南芥、大腸桿菌和釀酒酵母的密碼子GC含量和使用頻率進(jìn)行比較。結(jié)果表明：杜仲基因密碼子的RSCU>1的密碼子有30個(gè)，其中18個(gè)以G/C結(jié)尾、12個(gè)以A/U結(jié)尾，說(shuō)明杜仲基因密碼子偏好以G/C結(jié)尾，且偏好性較強(qiáng);有效密碼子數(shù)（ENC）范圍為30～60，該范圍內(nèi)的密碼子距離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，其ENC值小，偏好性較強(qiáng);PR2plot偏倚分析堿基使用頻率顯示，G>C、U>A;杜仲與代表性物種的GC含量分析顯示，杜仲的GC12、GC3以及平均GC含量均高于代表性物種;杜仲與代表性物種的密碼子使用頻率分析顯示，杜仲與煙草、釀酒酵母的密碼子偏好較為接近，杜仲與擬南芥、大腸桿菌的密碼子偏好差距較大。杜仲是我國(guó)特有的珍貴中藥材，對(duì)其進(jìn)行密碼子使用模式分析，并研究其密碼子偏好規(guī)律，為杜仲植物基因工程中外源基因的改良及表達(dá)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 杜仲基因， 密碼子， 偏好性， 使用模式， 代表性物種

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2021）02027409

Abstract：To comprehend the codon usage pattern of genes in Eucommia ulmoides， taking the E. ulmoides genome codons as the research object， the 320 coding DNA sequences was analyzed to obtain the results of relative synonymous codon usage（RSCU）， ENCGC3s analysis of codon ENC values of coding genes and PR2plot bias analysis of the codon base usage frequency of the coding genes. By using CUSP and Codon Usage Database software to compare the GC contents and codon occurrence frequency of E. ulmoides with those of Arabidopsis thaliana， Nicotiana tabacum， Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. The results were as follows：The number of RSCU value greater than 1 had 30 codons， including 18 genes with ending G/C and 12 genes ending with A/U， and these suggested that the codons preferred ends with G/C， and had a strong bias; The number of effective codons （ENC） ranges from 30 to 60， and the codons within this range were far away from the standard curve and their ENC values were smaller and had a higher preference; PR2plot analysis showed that G>C，U>A， in the base usage frequency; Analysis of GC contents of Eucommia ulmoides and representative species showed that the E. ulmoides GC12， GC3 and average GC contents were higher than those of representative species; The analysis of the codon usage frequency of E. ulmoides and representative species showed that the codon preferences of E. ulmoides and Nicotiana tabacum，? Saccharomyces cerevisiae were close， and the codon preferences of Eucommia ulmoides， Arabidopsis thaliana and Escherichia coli were quite different. Eucommia ulmoides is a precious Chinese medicinal material unique in China. Analysis ofthe codon usage pattern and studies of its codon preference will provide a theoretical basis for the improvement and expression of foreign genes in E. ulmoides plant genetic engineering.

2.2 ENC與GC3s關(guān)聯(lián)分析

以杜仲基因密碼子ENC值為縱坐標(biāo)，GC3值為橫坐標(biāo)作圖分析（圖1）。由圖1可知，杜仲基因ENC值多集中分布于30～60之間，該區(qū)域內(nèi)的密碼子距離標(biāo)準(zhǔn)曲線的距離遠(yuǎn)近不一，但大部分密碼子距離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，其ENC值小，偏好性較強(qiáng)。

2.3 PR2plot偏倚分析

對(duì)杜仲基因密碼子進(jìn)行PR2plot偏倚分析，如圖2所示。由圖2可知，密碼子多分布于平面圖的下方和右方，說(shuō)明堿基使用頻率為G>C、U>A。

2.4 杜仲與代表性物種的GC含量及密碼子使用頻率比較

將杜仲與4種代表性物種的GC含量進(jìn)行比較，如表2所示。由表2可知，杜仲基因密碼子的平均GC含量最高為51.7%，密碼子第三位堿基GC含量也最高，為53.61%，說(shuō)明杜仲基因密碼子偏好GC結(jié)尾。其次為大腸桿菌、擬南芥、煙草和釀酒酵母。杜仲與代表性物種的密碼子使用頻率以及頻率比值結(jié)果如表3所示，由表3可知，杜仲與代表性物種的密碼子使用頻率比值≥2或≤0.5的分別有31、34、34、32個(gè)，該值說(shuō)明兩物種間對(duì)該密碼子的使用偏差。表3中杜仲與大腸桿菌和擬南芥的密碼子使用偏好具有明顯差異，而杜仲與煙草、釀酒酵母的密碼子偏好性差別較小。若要為杜仲基因?qū)ふ宜拗鞅磉_(dá)系統(tǒng)的話，可選擇煙草或釀酒酵母較為合適。

3討論與結(jié)論

氨基酸由三聯(lián)體密碼子編碼，密碼子簡(jiǎn)并性可使堿基第三位改變的情況下編碼正確的氨基酸，保證蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確。不同生物的密碼子使用偏好存在差異，即便同一生物不同基因的密碼子使用偏好也存在差異（吳憲明等，2007）。密碼子使用偏好是生物在進(jìn)化過(guò)程中突變、選擇的綜合結(jié)果，研究表明密碼子偏好與基因表達(dá)水平相關(guān)，高表達(dá)基因傾向使用最優(yōu)密碼子（趙洋等，2011）。密碼子偏好性也反應(yīng)了生物間進(jìn)化的關(guān)系，可作為生物進(jìn)化關(guān)系的參考（陳哲等，2017）。密碼子使用模式分析可為生物的外源基因插入及表達(dá)提供一定的理論依據(jù)（羅洪等，2015）。杜仲是我國(guó)特有的珍貴藥材，具有降血壓、安胎等功效。但因其為木本植物、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等原因，杜仲遺傳轉(zhuǎn)化不易進(jìn)行且轉(zhuǎn)基因杜仲移栽至土里存活率不高。因此，探究杜仲基因的密碼子使用模式可為杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化提供更多可能性。

本研究以杜仲基因組為對(duì)象，分析杜仲基因密碼子使用模式。結(jié)果表明杜仲基因密碼子RSCU>1的有30個(gè)，其中18個(gè)密碼子以G/C結(jié)尾、12個(gè)密碼子以A/U結(jié)尾，說(shuō)明杜仲基因密碼子偏好以G/C結(jié)尾，這種偏好可能是由于以 G/C結(jié)尾的密碼子具有較高的結(jié)合能，有利于保證翻譯的準(zhǔn)確性 （蔣瑋等，2014）。ENC值大小可量化一個(gè)基因的密碼子使用頻率與同義密碼子平均使用頻率的偏差，從而檢測(cè)單個(gè)基因密碼子的偏好程度（朱婷婷等，2017）。ENC值與期望ENC值差異越小，說(shuō)明突變對(duì)密碼子偏好性影響越大;ENC值與期望ENC值差異越大，說(shuō)明選擇對(duì)密碼子偏好性影響越大（楊國(guó)鋒等，2015）。分析杜仲基因密碼子ENC值，其值集中分布于30～60間，且該區(qū)域內(nèi)的密碼子距離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，偏好性較強(qiáng)。PR2plot分析中，平面圖顯示各基因的堿基組成，其中點(diǎn)代表無(wú)偏倚性使用時(shí)的密碼子狀態(tài)，即A=U，G=C（尚明照等，2011;邢朝斌等，2013）。杜仲基因密碼子的PR2plot分析顯示堿基使用頻率為G>C、U>A。說(shuō)明杜仲基因密碼子的使用偏好受到自然選擇和基因突變的影響。杜仲與擬南芥、煙草、大腸桿菌、釀酒酵母等代表性物種的密碼子使用頻率都具有不同程度的差異，若這些生物的基因要在杜仲中表達(dá)，則應(yīng)先進(jìn)行密碼子優(yōu)化。杜仲與煙草、釀酒酵母的密碼子偏好性差別較小，與大腸桿菌、擬南芥的密碼子偏好性差別較大。如果煙草、釀酒酵母的基因要在杜仲中表達(dá)則只需優(yōu)化個(gè)別密碼子，若要為杜仲基因?qū)ふ宜拗飨到y(tǒng)，則煙草、釀酒酵母較為合適。

隨著基因工程的廣泛應(yīng)用，外源基因的功能驗(yàn)證多采用轉(zhuǎn)基因異源表達(dá)。外源基因?qū)胨拗飨到y(tǒng)后由于其密碼子與宿主系統(tǒng)的密碼子使用偏好不同，導(dǎo)致表達(dá)效率低下。密碼子偏好性分析在基因異源表達(dá)方面具有重要意義，基于同義密碼子的使用頻率不同，為了提高外源基因的表達(dá)水平，可對(duì)稀有密碼子進(jìn)行改造，增加優(yōu)勢(shì)密碼子使用頻率使得外源基因更好地表達(dá)（胡曉艷等，2019）。本研究分析珍貴中藥材杜仲的基因密碼子使用模式，對(duì)于杜仲中外源基因的插入及高效表達(dá)具有重要意義并提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）