沈宗芳 陸添權(quán) 張志榮 蔡傳濤 田波

摘要：葉綠體基因組密碼子偏好性使用模式往往影響基因表達(dá)效率，為促進(jìn)藥用植物葉綠體基因工程的發(fā)展，提高槲蕨藥用品質(zhì)，該研究以川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨三個(gè)近緣藥用植物為材料，使用CodonW、 CUSP 和 SPSS等軟件分析其葉綠體基因組編碼基因密碼子使用偏好性，篩選出三個(gè)物種的最優(yōu)密碼子。結(jié)果表明：川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組的有效密碼子數(shù)（ENC）范圍分別為40.10～61、40.33～61和40.15～61，其密碼子偏好性較弱;ndhE、rpl22、rpl14、rpl20、ccsA、rps4和rpl16編碼基因的ENC值差異較大，表明近緣物種中，部分基因的密碼子偏好性存在一定差異;三個(gè)物種編碼基因的ENC頻數(shù)集中于-0.1～0.1 之間，說(shuō)明槲蕨屬基因密碼子偏好性主要受到突變的影響。川滇槲蕨12個(gè)最優(yōu)密碼子有6個(gè)和櫟葉槲蕨相同，分別是UCU、ACU、GCU、CAA、AAA和GAU;櫟葉槲蕨10個(gè)最優(yōu)密碼子有2個(gè)和槲蕨相同，分別是UUA和AUU，而川滇槲蕨與槲蕨無(wú)相同的最優(yōu)密碼子。該研究結(jié)果可為槲蕨屬藥用植物基因工程中外源基因的改良及其表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 川滇槲蕨， 櫟葉槲蕨， 槲蕨， 葉綠體基因組， 密碼子偏好性

中圖分類號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2021）02026608

Abstract：The codon usage patterns of the chloroplast genes were related to the expression efficiency of genes. In order toimprove the development of the chloroplast genetic engineering of medicinal plant and to promote the quality of medicinal plant Drynaria roosii， the optimal codons in chloroplast genome were identified through analyzing the factors shaping of codon bias of D. delavayi， D. quercifolia and D. roosii using CodonW， CUSP and SPSS softwares. The results were as follows： The effective number of codons （ENC） of the chloroplast gene ranged from 40.10 to 61， from 40.33 to 61， and from 40.15 to 61 in D. delavayi， D. quercifolia， and D. roosii， respectively， which suggested the codon bias was weak among the three species; The ENC of gene ndhE， rpl22，? rpl14， rpl20， ccsA， rps4 and rpl16 showed significant difference among species， which suggested the codon bias of some genes was various in closely species; The distribution of ENC frequency ratio of most coding gene ranged from -0.1 to 0.1， suggesting the codon usage bias was produced by gene mutation in Drynaria species. In addition， 12 codons were identified as optimal codons in D. delavayi， ten in D. quercifolia， and three in D. roosii. The codons UCU， ACU， GCU， CAA， AAA and GAU were the optimal codons in D. delavayi and D. quercifolia， the codons UUA and AUU were the optimal codons in D. quercifolia and D. roosii， while did not in D. delavayi and D.roosii. Our results will be useful for the codon preference analysis of ferns and the chloroplast genetic engineering of medicinal plant.

Key words： Drynaria delavayi， D. quercifolia， D. roosii， chloroplast genome， codon preference

槲蕨屬（Drynaria）共有16個(gè)種，主要分布在亞洲至大洋洲，其中9個(gè)種分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各?。▍^(qū)），包括中華槲蕨（D. sinica）、團(tuán)葉槲蕨（D. bonii）、川滇槲蕨（D. delavayi）、櫟葉槲蕨（D. quercifolia）、槲蕨（D. roosii）等 （中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，2000）?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》記載，“骨碎補(bǔ)”指槲蕨的干燥根莖，可用于多種疾病的治療，如腎虛腰痛、耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)、跌撲閃挫、筋骨折傷、外治斑禿、白癜風(fēng)等，其活性成分主要是柚皮苷，其含量不得少于0.50%（國(guó)家藥典委員會(huì)，2015）。其他種為“骨碎補(bǔ)”的混偽品，“骨碎補(bǔ)”混偽品中柚皮苷含量較低，槲蕨柚皮苷含量為0.77%，櫟葉槲蕨柚皮苷含量為0.11%，而川滇槲蕨柚皮苷含量為0（李順祥等，2003）?！肮撬檠a(bǔ)”雖然分布較廣，但生長(zhǎng)環(huán)境特殊、生長(zhǎng)速度緩慢、品質(zhì)差異大，如果野生資源被破壞將很難恢復(fù)（黃寶優(yōu)等，2014）。隨著“骨碎補(bǔ)”藥材用量不斷加大，依靠野生資源和普通種植方式難以滿足市場(chǎng)需求。利用葉綠體基因工程作為生物反應(yīng)器可以合成大量的次生代謝產(chǎn)物，德國(guó)研究人員將黃花蒿中合成青蒿酸相關(guān)的多個(gè)基因轉(zhuǎn)入到煙草葉綠體基因組中， 提高了青蒿素產(chǎn)量（張劍鋒等，2015）。利用葉綠體基因工程，通過(guò)引入外源基因來(lái)調(diào)控植物的代謝過(guò)程，使代謝途徑向著預(yù)設(shè)的方向變化（溫貝貝等，2016），將有助于提高“骨碎補(bǔ)”品質(zhì)和保護(hù)野生植物資源。

外源基因的導(dǎo)入和外源基因的穩(wěn)定表達(dá)是葉綠體基因工程轉(zhuǎn)化體系的2個(gè)關(guān)鍵步驟（張劍鋒等，2015）。密碼子使用模式會(huì)影響基因的功能和表達(dá)，基因的表達(dá)量越大，其密碼子偏好性越強(qiáng)（Hershberg et al.， 2008; Quax et al.， 2015; Zhou et al.， 2016）。對(duì)密碼子偏好性進(jìn)行分析，有助于提高外源基因的表達(dá)和選擇更合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)，提高外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量（Zelasko et al.， 2013; 李麗莎等，2016）。因此，本文從川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨三個(gè)近緣藥用植物，分析槲蕨屬葉綠體基因組編碼基因的密碼子使用模式及其密碼子偏好性影響因素，并篩選出三個(gè)物種的最優(yōu)密碼子，為槲蕨屬藥用植物基因工程中外源基因的改良及其表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 葉綠體基因組序列

野外采集新鮮的川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨材料，通過(guò)Illumina HiSeq XTen測(cè)序平臺(tái)獲取三種槲蕨的DNA序列的reads，其覆蓋度（coverage）分別為497、304和370。使用SPAdes3.9.0軟件進(jìn)行組裝，參數(shù)按軟件默認(rèn)設(shè)置獲得組裝結(jié)果（Bankevich et al.， 2012）。將SPAdes組裝得到的contigs比對(duì)到參考基因組上，用Geneious 8.0 （Kearse et al.， 2012）對(duì)contigs堿基的位置進(jìn)行人工校對(duì)。川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組長(zhǎng)度分別為151 348、151 536和154 011 bp，通過(guò)GeSeq （Tillich et al.， 2017）在線注釋分別獲得87、86和87個(gè)CDS，去掉小于300 bp和重復(fù)的CDS序列，最終分別保留52、53和52個(gè)CDS進(jìn)行后續(xù)分析。川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組序列提交到NCBI Genbank的序列號(hào)分別為MK761239、MK761243和MK761233。

1.2 方法

1.2.1 密碼子偏好性分析分別對(duì)川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨的編碼基因進(jìn)行過(guò)濾，去掉小于300 bp和重復(fù)的編碼基因。使用CodonW 1.4.2和在線軟件CUSP（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）分析川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨過(guò)濾后的編碼基因，統(tǒng)計(jì)同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU， relative synonymous codon usage）、有效密碼子數(shù)目（ENC， effective number of codon）、總GC含量和密碼子第1位、第2位、第3位堿基組成GC含量（分別用GC1、GC2和GC3表示密碼子第1位、第2位、第3位堿基組成的GC含量）。

1.2.2 中性繪圖以CDS的GC3（第3位堿基GC含量）值為橫坐標(biāo)，GC1（第1位堿基GC含量）和GC2（第2位堿基GC含量）的平均值GC12為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，分析GC3與GC12的相關(guān)性，確定密碼子3個(gè)位置堿基組成的差異性（Sueoka， 1988）。若GC3與GC12相關(guān)性顯著，說(shuō)明堿基的使用模式相同，突變是其主要影響因素;若GC3與GC12相關(guān)性不顯著，說(shuō)明密碼子第1位、第2位堿基與第3位堿基的使用存在差異，選擇壓力對(duì)密碼子使用影響較大。

1.2.3 ENCplot 繪圖分析以 GC3 為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，并與 ENC期望值（ENC=2+GC3+29/（[GC32+ （1-GC3） 2]） 進(jìn)行比較，分析堿基組成對(duì)密碼子偏好性的影響（尚明照等，2011）。通過(guò)基因散點(diǎn)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的位置判斷影響密碼子偏好性的原因，若基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，密碼子偏好性僅受到突變影響;若基因坐落在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置，則密碼子偏好性受到選擇的影響（楊國(guó)鋒等，2015）。

1.2.4 最優(yōu)密碼子確定同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）是該密碼子的實(shí)際觀察值與理論觀察值的比值（楊國(guó)鋒等，2015）。當(dāng)RSCU=1時(shí)，密碼子無(wú)偏好性;當(dāng)RSCU>1時(shí)，密碼子使用頻率偏高;而RSCU<1時(shí)，則說(shuō)明密碼子出現(xiàn)的頻率較低。最優(yōu)密碼子（the most preferred codon）的選擇，以ENC為偏好性標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)川滇槲蕨、櫟葉槲蕨、槲蕨CDS的ENC值進(jìn)行排序，分別從ENC最高和最低兩端選取10%的基因，建立高表達(dá)庫(kù)和低表達(dá)庫(kù)。計(jì)算密碼子的ΔRSCU值，將ΔRSCU>0.08，且整體 RSCU>1的密碼子作為最優(yōu)密碼子（秦政等，2018;石元豹等，2018）。

2結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析

通過(guò) CodonW 1.4.2和在線 CUSP 對(duì)槲蕨、櫟葉槲蕨和川滇槲蕨葉綠體基因組進(jìn)行分析，結(jié)果如表 1 所示。從表1可以看出，川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組A3s（第3位堿基是A）含量分別是36.68%、36.59%和36.11%，T3s（第3位堿基是T）含量分別是37.38%、37.39%和37.39%，說(shuō)明三種槲蕨的第3位堿基主要以A/T為主。川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組GC含量分別為42%、41.8%和42.2%，GC3含量分別為40.53%、40.97%和41.12%，三種槲蕨的GC含量相近。川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組ENC值分別是57.82、58.03和57.96。

川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨的編碼基因密碼的相關(guān)參數(shù)值用熱圖統(tǒng)計(jì)，每一行代表1個(gè)基因，基因名位于圖右側(cè)，圖中的值表示該基因相應(yīng)參數(shù)（列名）值的大小，其結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，三種槲蕨不同位置堿基GC含量不同，大部分基因的GC1含量高于GC2和GC3;川滇槲蕨（40.101～61）、櫟葉槲蕨（40.329～61）和槲蕨（40.148～61）的ENC值都大于40。ndhE、rpl22、rpl14、rpl20、ccsA、rps4和rpl16等基因的ENC值在三個(gè)物種的極差大于5，同一個(gè)基因在近緣物種的密碼子偏好性有較大差異。由于rps12在川滇槲蕨和槲蕨兩個(gè)種編碼基因長(zhǎng)度不到300 bp，故不對(duì)其進(jìn)行分析。

編碼基因GC1、GC2、GC3、GC和ENC及相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，川滇槲蕨的GC1、GC2、GC3與GC均極顯著相關(guān)，且ENC與GC顯著相關(guān)，GC1與GC3，GC2與GC3相關(guān)性不顯著，其編碼基因的3位堿基組成不相似。櫟葉槲蕨、槲蕨的GC1與GC3顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為-0.3和-0.27;GC3與ENC相關(guān)性極顯著。三種槲蕨編碼基因密碼子第3位堿基組成對(duì)密碼子偏好性影響較大。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析結(jié)果如圖3所示，GC12和GC3的分布范圍都較為分散，川滇槲蕨GC12的范圍在0.282 2～0.538 1之間，GC3在0.330 2～0.542 0之間;櫟葉槲蕨GC12的范圍在0.288 4～0.536 9之間，GC3在0.331 8～0.542 0之間;槲蕨GC12的范圍在0.264 0～0.535 5之間，GC3在0.321 1～0.538 1之間。川滇槲蕨、櫟葉槲蕨、槲蕨的Pearson 相關(guān)系數(shù)分別為-0.224、-0.259和-0.24，雙尾檢驗(yàn)結(jié)果不顯著（P>0.05），說(shuō)明GC12和GC3相關(guān)性不顯著;基因分布范圍分散，部分基因的GC3大于GC12，說(shuō)明該部分基因密碼子的偏好性受突變的影響較大。

2.3 ENCplot繪圖分析

由圖4可知，川滇槲蕨、櫟葉槲蕨、槲蕨編碼基因大多分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線兩側(cè)，ENC值與ENC期望值 [ENCexp=2+GC3s+29/（GC3s2+（1-GC3s）2]較為接近。川滇槲蕨的ndhC和psbA、櫟葉槲蕨的ndhE、ndhC和psbA、槲蕨的ndhC和psbA 基因離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)，且ENC值較小，密碼子偏好性較強(qiáng)， 主要受到選擇壓力的影響。根據(jù)ENC比值 [（ENC期望-ENC實(shí)際）/ENC期望]統(tǒng)計(jì)基因ENC的分布頻數(shù)（表2），大部分基因的ENC頻數(shù)集中于-0.1～0.1 之間，進(jìn)一步表明大部分基因的ENC值與ENC期望值差異較小，突變對(duì)編碼基因密碼子偏好性影響較大。

2.4 最優(yōu)密碼子確定

對(duì)三種槲蕨葉綠體基因組編碼基因的ENC值進(jìn)行排序后，先從兩端各選取10%的基因建立高、低表達(dá)基因庫(kù)，然后計(jì)算兩個(gè)表達(dá)庫(kù)中密碼子的RSCU值和兩個(gè)庫(kù)中的ΔRSCU值（ΔRSCU=RSCU高表達(dá)-RSCU低表達(dá)），以ΔRSCU>0.08 為標(biāo)準(zhǔn)篩選高表達(dá)密碼子，以高表達(dá)密碼子和高頻密碼子（RSCU>1）共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，川滇槲蕨24個(gè)高表達(dá)密碼子，其中8個(gè)以A結(jié)尾，6個(gè)以C結(jié)尾，兩個(gè)以G結(jié)尾，8個(gè)以U結(jié)尾，最優(yōu)密碼子有12個(gè)，分別是UUG、UCU、CCU、ACU、GCU、GCA、CAA、AAA、GAU、GAA、UGU和GGU;櫟葉槲蕨28個(gè)高表達(dá)密碼子，其中8個(gè)以A結(jié)尾，6個(gè)以C結(jié)尾，一個(gè)以G結(jié)尾，13個(gè)以U結(jié)尾，最優(yōu)密碼子有10個(gè)，分別是UUA、CAA、AAA、AUU、GUU、UCU、ACU、GCU、UAU、AAU、GAU;槲蕨23個(gè)高表達(dá)密碼子，其中4個(gè)以A結(jié)尾，10個(gè)以C結(jié)尾，9個(gè)以U結(jié)尾，最優(yōu)密碼子只有3個(gè)，分別是UUA、UGC、AUU。川滇槲蕨和櫟葉槲蕨有6個(gè)相同的最優(yōu)密碼子，櫟葉槲蕨和槲蕨有2個(gè)相同的最優(yōu)密碼子，而川滇槲蕨與槲蕨并無(wú)相同的最優(yōu)密碼子。

3討論與結(jié)論

川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組ENC值分別是57.82、58.03和57.96，其葉綠體基因組編碼基因的ENC值都大于40。密碼子偏好性判定標(biāo)準(zhǔn)，以ENC值低于35的為強(qiáng)偏好性密碼子，高于35的為弱偏好性密碼子（Jiang et al.， 2008）。這說(shuō)明川滇槲蕨、櫟葉槲蕨和槲蕨葉綠體基因組的密碼子偏好性較弱。

自然選擇和突變是影響密碼子使用偏好性的重要因素（Sharp et al.， 2011; 石元豹等，2018），ENC值與期望ENC值差異越小，說(shuō)明突變對(duì)密碼RSCU. 同義密碼子相對(duì)使用度。H. 高表達(dá); L. 低表達(dá)。

子偏好性影響越大，ENC值與期望ENC值差異越大，選擇對(duì)密碼子偏好性的影響越大（秦政等，2018）。ENC頻數(shù)位于-0.1～0.1 之間的編碼基因在川滇槲蕨有96%、櫟葉槲蕨有94%、槲蕨有96%，說(shuō)明槲蕨屬基因密碼子偏好性主要受到突變的影響;三個(gè)近緣物種編碼基因密碼子偏好性主要受到突變影響的比例較為一致，說(shuō)明自然選擇和突變兩個(gè)主要因素對(duì)密碼子偏好性影響作用的強(qiáng)弱在近緣物種較一致，可能與物種的遺傳進(jìn)化有關(guān)。

密碼子使用模式會(huì)影響基因的表達(dá)，基因的表達(dá)量越大，其密碼子偏好性越強(qiáng) （Hershberg et al.， 2008; Quax et al.， 2015; Zhou et al.， 2016）。通過(guò)對(duì)三種槲蕨密碼子的偏好性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ndhE、rpl22、rpl14、rpl20、ccsA、rps4和rpl16等基因的ENC值差異較大，說(shuō)明近緣物種中同一個(gè)基因的密碼子偏好性也有一定差異，與柚皮苷代謝相關(guān)的基因可能也會(huì)受到密碼子偏好性的影響而造成基因表達(dá)的不同，可能是槲蕨屬不同種植物柚皮苷含量不同的原因之一。

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（責(zé)任編輯何永艷）