豬α冠狀病毒免疫機(jī)制及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

王爍程,張林波

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118)

隨著我國養(yǎng)豬量的不斷增加，豬群中疾病的流行情況也日趨復(fù)雜。腹瀉是豬群中比較常見的疾病，多發(fā)于冬季，主要癥狀是水樣腹瀉并伴有嘔吐，嚴(yán)重程度隨病豬的年齡變化而有差異，年齡越小，癥狀越嚴(yán)重，如今已成為世界范圍內(nèi)的流行病。對(duì)于該病的病原學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究，為該病的預(yù)防及檢測提供了新的思路。

1 豬α冠狀病毒簡介

冠狀病毒(Coronavirus)是自然界中較為常見一類RNA病毒，能夠感染哺乳動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞或呼吸道上皮細(xì)胞，且具有致命性。冠狀病毒最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，為禽類傳染性支氣管炎病毒，隨后又在人類普通感冒患者的鼻腔中發(fā)現(xiàn)人類冠狀病毒229E(HCoV-229E)以及人類冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)。

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)均為α冠狀病毒，屬于正義單鏈RNA病毒，基因組包含50個(gè)非翻譯區(qū)和至少7個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)，其中ORF1a和ORF1b占據(jù)病毒基因組的2/3，編碼2個(gè)非結(jié)構(gòu)性復(fù)制酶多聚蛋白[1-2]，其余1/3則編碼結(jié)構(gòu)蛋白，包括刺突糖蛋白(spike protein，S)，是一種跨膜糖蛋白，從病毒表面突出，其N端胞外域是受體結(jié)合位點(diǎn)，且含有主要的抗原決定簇；膜蛋白(membrane protein，M)含有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，主要功能是進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，并形成病毒外包膜；小包膜蛋白(envelope protein，E)是有離子通道活性的小疏水蛋白，能夠與包膜結(jié)合；核蛋白(nuclear protein，N)包裹RNA形成核衣殼，并且能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，上調(diào)白細(xì)胞介素的表達(dá)。除此以外，少數(shù)冠狀病毒還含有血凝素酯酶[3-5]。

2014年，在美國俄亥俄州腹瀉仔豬的糞便中檢測到一種與豬α冠狀病毒基因組排列近似的冠狀病毒，命名豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)。PDCoV基因組除ORF1a、ORF1a、S、E、N外，還包含輔助蛋白6(accessory protein 6，NS6)、輔助蛋白7(NS7)和輔助蛋白7A(NS7a)。迄今，PDCoV僅在豬中被發(fā)現(xiàn)具有傳染性[6-7]。

2 豬α冠狀病毒感染的受體

病毒侵入宿主細(xì)胞起始于病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合。目前認(rèn)為，PEDV、TGEV等利用氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)作為與細(xì)胞結(jié)合的受體。APN是一種Ⅱ型細(xì)胞膜金屬蛋白酶，其存在于細(xì)胞表面，通過N端的胞質(zhì)域與細(xì)胞連接，廣泛分布于成熟的小腸上皮細(xì)胞、小腸微絨毛表面等部位。APN能夠作為細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑、血管作用肽等物質(zhì)的底物，在降低T細(xì)胞對(duì)MHCⅡ類分子-抗原肽的識(shí)別等方面發(fā)揮作用[8-10]。

APN糖基化區(qū)域存在動(dòng)物物種差異，使其具有高度的物種特異性，如人類冠狀病毒無法以豬氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N，pAPN)作為細(xì)胞受體；TGEV能夠與純化的pAPN特異性結(jié)合，說明pAPN是TGEV的受體[11]。多項(xiàng)研究證明，pAPN在PEDV的感染中也發(fā)揮作用：①通過將表達(dá)pAPN的基因轉(zhuǎn)染到犬腎細(xì)胞(mardin darby canine kidney，MDCK)，使MDCK能夠表達(dá)pAPN，能夠被PEDV感染，且MDCK不是PEDV的易感細(xì)胞，說明pAPN能夠提升細(xì)胞對(duì)PEDV感染的敏感性；②采用病毒鋪覆蛋白結(jié)合試驗(yàn)研究PEDV的受體，鑒定出一種150 ku的蛋白，是小腸上皮細(xì)胞和豬睪丸細(xì)胞的PEDV受體，使用抗pAPN抑制劑后，該蛋白與PEDV的結(jié)合被阻斷，說明該受體蛋白是pAPN；③表達(dá)pAPN的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠被PEDV感染；④用pAPN抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育后，接種PEDV時(shí)感染受到了干擾。然而近來的很多研究發(fā)現(xiàn)，pAPN可能不是PEDV感染的唯一受體：①通過使用外源表達(dá)并親和純化后的TGEV-S1和PEDV-S1蛋白，以流式細(xì)胞術(shù)分析兩種蛋白與pAPN的結(jié)合能力發(fā)現(xiàn)，TGEV-S1能夠與MDCK表達(dá)的pAPN結(jié)合而不與親代MDCK表面結(jié)合，但PEDV-S1并不與細(xì)胞表達(dá)的pAPN結(jié)合；②將豬睪丸細(xì)胞(swine testis，ST)細(xì)胞中的pAPN基因通過CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除后，發(fā)現(xiàn)基因敲除后ST細(xì)胞依然能夠被PEDV感染。此外，HeLa細(xì)胞也能夠被PEDV感染，但該感染過程并不需要pAPN作為受體[12]；③將豬小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，pAPN的表達(dá)量僅達(dá)到了成熟豬小腸上皮細(xì)胞的約11%，說明培養(yǎng)3 d的細(xì)胞尚未完全成熟，培養(yǎng)7 d后pAPN的表達(dá)量有了明顯提高，且培養(yǎng)7 d的小腸上皮細(xì)胞對(duì)TGEV敏感性顯著高于培養(yǎng)3 d的，這與病毒主要感染并破壞小腸絨毛內(nèi)襯的成熟小腸上皮細(xì)胞的情況相吻合，而PEDV的感染率卻沒有因?yàn)榕囵B(yǎng)細(xì)胞的成熟出現(xiàn)明顯變化。通過分析衰老的小腸上皮細(xì)胞和經(jīng)分化因子處理的小腸上皮細(xì)胞的pAPN表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，以上兩種細(xì)胞均能表達(dá)較高水平的pAPN，增強(qiáng)其對(duì)PEDV感染的敏感性[13-14]。說明pAPN是PEDV感染的受體但并不唯一受體。PEDV是通過頂膜進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞的，除pANP外，其他分子在小腸上皮細(xì)胞分化過程中也于頂膜表達(dá)，如氫化可的松。氫化可的松在脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝過程中具有重要作用，并且也是內(nèi)皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，還能夠顯著上調(diào)人皮膚成纖維細(xì)胞中APN的表達(dá)，說明其也有可能是PEDV感染的另一受體[15]。

3 豬α冠狀病毒感染過程中與細(xì)胞免疫相關(guān)的重要物質(zhì)

3.1 真核翻譯起始因子4-α

M蛋白是豬α冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制過程中具有重要作用，且該蛋白能夠用于特異性檢測和治療。M蛋白作為連接因子與高爾基體前區(qū)隔中的基因組RNA和核蛋白相互作用來啟動(dòng)病毒顆粒的裝配。M蛋白的配體是真核翻譯起始因子4-α，將外源表達(dá)的GST-EIF4A2融合蛋白添加到含有相同濃度的GST-M蛋白的瓊脂糖微珠中，通過免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)，EIF4A2和TGEV-M能夠在體外相互作用[16-18]。TGEV感染的細(xì)胞，通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)發(fā)現(xiàn)，EIF4A2分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而M蛋白與EIF4A2在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)部分重疊，說明在TGEV感染細(xì)胞中，EIF4A2與M蛋白存在相互作用。通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制宿主細(xì)胞EIF4A2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TGEV的復(fù)制受到了抑制，說明EIF4A2在TGEV的復(fù)制中發(fā)揮重要作用，該蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于開發(fā)防控TGEV感染的新型制劑[19-20]。

3.2 膽固醇25-羥化酶和25-羥膽固醇

膽固醇25-羥化酶(cholesterol 25-hydroxylase，CH25H)是一種宿主細(xì)胞限制因子，能夠催化膽固醇被氧化為25-羥膽固醇(25-hydroxycholesterol，25HC)，而25HC在宿主抑制病毒感染中有重要作用[21]，該蛋白能夠抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins ，SREBPs)。通常情況下，SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein，SCAP)與SREBPs在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成復(fù)合體。當(dāng)合成固醇時(shí)，SREBP-SCAP在高爾基體中被位點(diǎn)1蛋白酶和位點(diǎn)2蛋白酶裂解為轉(zhuǎn)錄因子；當(dāng)脂質(zhì)過剩時(shí)，SCAP的構(gòu)象發(fā)生變化，并與胰島素誘導(dǎo)基因結(jié)合(insulin-induced genes ，INSIGs)。25HC通過控制固醇生物合成過程中INSIGs的表達(dá)來增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的SREBP-SCAP復(fù)合體的含量[22]。因此，25HC被認(rèn)為是固醇抑制劑。用構(gòu)建的pCAGGS-CH25H重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)后，用PEDV感染Vero細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，感染組N蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。通過IFA分析發(fā)現(xiàn)，PEDV的復(fù)制被抑制，說明CH25H能夠抑制PEDV感染，且即使在CH25H酶活性較低的情況下，依然能夠抑制PEDV的復(fù)制。當(dāng)用siRNA抑制CH25H表達(dá)時(shí)，PEDV N蛋白和mRNA表達(dá)水平都有所增加，通過測定TCID50發(fā)現(xiàn)，敲低CH25H會(huì)顯著提高病毒滴度，說明25HC和CH25H均對(duì)PEDV感染有抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴性。對(duì)感染YZ、MS、CV777、SH等4種PEDV毒株的Vero細(xì)胞使用25HC發(fā)現(xiàn)，25HC對(duì)4種毒株的復(fù)制均有抑制作用，說明25HC對(duì)PEDV的抑制具有廣譜性[23-24]。然而，25HC對(duì)抗PEDV感染的機(jī)制尚不明確，推測其可能是通過阻斷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式來抑制PEDV感染，并且對(duì)TGEV和PEDV感染均具有抑制作用。

4 豬α冠狀病毒的免疫逃逸機(jī)制

干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)是病毒與宿主相互作用的重要組成部分，在抗感染過程中發(fā)揮重要作用[25]。通常病毒侵入宿主細(xì)胞后，細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR) 首先對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，而后誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)，PRR的主要成分是維甲酸誘導(dǎo)基因-1樣受體，包括遺傳學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2、黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation associated gene 5 ，MDA5)和維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ)。正常生理狀態(tài)下，RIG-Ⅰ通過N端的Caspase激活募集結(jié)構(gòu)域與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein ，MAVS)相互作用，處于自抑制狀態(tài)。RNA病毒感染后，產(chǎn)生的干擾素激活RIG-Ⅰ和MDA5。環(huán)指蛋白135通過K63蛋白釋放出RIG-Ⅰ自抑制所必須的E3連接酶，而MDA5通過CARD和MAVS的相互作用激活干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在此過程中，MAVS激活絲氨酸激酶1(TANK binding kinase 1，TBK1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2 ，TRAF2)，TRAF3，TRAF5和TRAF6。而后通過干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)使TBK1進(jìn)入細(xì)胞核，通過相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生包括IFN-β在內(nèi)的主要抗病毒因子[25-26]。目前認(rèn)為，不同冠狀病毒的N蛋白作為拮抗劑，通過靶向不同的信號(hào)蛋白介導(dǎo)RLR信號(hào)通路。如PEDV的N蛋白能夠螯合HEK293T細(xì)胞中TBK1-IRF3復(fù)合物，從而抑制IFN-β和核轉(zhuǎn)錄因子κB的活化。PDCoV的N蛋白也能夠抑制RIG-Ⅰ介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。PDCoV N蛋白可以直接靶向RIG-Ⅰ，并通過干擾K63阻斷其早期活化[27-28]。除N蛋白外，PDCoV的輔助蛋白NS6也是IFN-β的拮抗劑[29]。說明PDCoV N蛋白的作用機(jī)制與其他冠狀病毒不同，也說明了N蛋白在冠狀病毒感染、免疫逃逸等方面具有重要作用。

除了N蛋白外，PEDV的核酸核糖內(nèi)切酶(endoribonuclease ，EndoU)在逃避宿主巨噬細(xì)胞先天免疫中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。用構(gòu)建的PEDV EndoU缺陷病毒株感染PK1細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，缺陷型PEDV感染PK1細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的IFN水平均高于野生型，由于PK細(xì)胞主要分泌Ⅲ型IFN，巨噬細(xì)胞主要分泌Ⅰ型IFN，由此推斷EndoU能夠減輕機(jī)體的Ⅰ型和Ⅲ型IFN的應(yīng)答，從而逃避宿主的先天免疫防御[30-31]。除PEDV外，其他冠狀病毒，如嚴(yán)重急性呼吸綜合癥病毒(SARS-CoV)也表達(dá)EndoU，說明EndoU在研究冠狀病毒的免疫逃逸及設(shè)計(jì)新型減毒活疫苗方面有重要意義[32]。

5 豬α冠狀病毒檢測新技術(shù)研究

對(duì)于豬冠狀病毒的檢測方法，目前研究十分廣泛，如RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增以及適用于大批量樣品檢測的雙抗夾心ELISA方法等[33-34]，以上方法是利用引物來擴(kuò)增病毒核酸或通過外源表達(dá)病毒蛋白來檢測相應(yīng)病毒抗體的傳統(tǒng)方法。除常用方法外，生物芯片、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像等新型技術(shù)也不斷被用于豬冠狀病毒的檢測，顯著提高了檢出效率。

5.1 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是以NC膜作為載體，結(jié)合可視化顯色技術(shù)的可視化蛋白芯片。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是對(duì)常規(guī)ELISA方法的擴(kuò)展，因?yàn)镹蛋白在豬α冠狀病毒免疫逃逸方面的重要作用，通常采用外源表達(dá)方式獲取N蛋白作為檢測用的抗原蛋白，來檢測待測血清中的相應(yīng)抗體，其優(yōu)點(diǎn)在于成品芯片在操作方面的便利。然而，以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測手段受個(gè)體差異及免疫逃逸等因素的影響，在檢測準(zhǔn)確率方面尚不及高通量成像技術(shù)。除N蛋白外，其他蛋白在豬冠狀病毒檢測中也有應(yīng)用，通過外源表達(dá)S、M、N、E蛋白來檢測PEDV抗體發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的S、M、N蛋白均能與抗體發(fā)生反應(yīng)，而抗體的應(yīng)答強(qiáng)度取決于抗原含量，S蛋白構(gòu)成了病毒表面的日冕狀突起，M蛋白是病毒體膜中的主要蛋白，N蛋白是病毒感染過程中的主要蛋白，而E蛋白僅少量存在于病毒包膜中，以蛋白作為抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)檢測的強(qiáng)度與該蛋白在病毒中的含量情況相吻合，即含量越高，反應(yīng)越靈敏。N蛋白的N端存在PEDV、TGEV等冠狀病毒相同的抗原表位[35]，以N蛋白作為檢測抗原可能會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，在豬冠狀病毒的免疫學(xué)檢測中，S、M蛋白具有更大的價(jià)值，這一方面尚待深入研究。

5.2 高通量實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像及功能分析技術(shù)

高通量實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像及功能分析技術(shù)與高通量細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，被用于豬冠狀病毒的檢測。該方法是將熱滅活的待測血清樣本在MEM培養(yǎng)基中用含有蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶進(jìn)行稀釋，而后將血清樣本與PEDV等比例混合并孵育，再將混合物添加到含有Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行孵育后與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，然后在高通量成像細(xì)胞儀上以541 nm讀取數(shù)據(jù)，通過與陰性對(duì)照對(duì)比，來判定是否為豬冠狀病毒感染[36]。該方法利用檢測中和抗體的細(xì)胞成像技術(shù)，具有可視化和計(jì)量細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。在檢測過程中，使用高通量成像細(xì)胞儀進(jìn)行讀取并評(píng)估結(jié)果，客觀的數(shù)據(jù)讀取方案和計(jì)算方法消除了人為操作的主觀性，且讀取時(shí)間不超過4 min。細(xì)胞成像術(shù)提供了一種客觀且快速的檢測方法。

6 展望

豬流行性腹瀉于20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)，是由豬α冠狀病毒引起的傳染病，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害，其感染相關(guān)受體和免疫逃逸機(jī)制的研究為相關(guān)疫苗和檢測技術(shù)的研發(fā)提供了重要依據(jù)。近年來，對(duì)于病毒功能性受體的研究已成為病毒相關(guān)研究的重要內(nèi)容。隨著相關(guān)研究的不斷深入，相信不久的將來由冠狀病毒引起的疾病一定會(huì)得到有效控制。