楊 燕 楊再華 峗薇 尚小麗 羅倩 楊茂發(fā)

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550018； 2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005；3.四川省江油市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 江油 621700；4.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；5.貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州 貴陽 550025；)

云南松(Pinusyunnanensis)隸屬于裸子植物亞門Gymnospermae松杉目Pinales松科Pinaceae松屬Pinus，常綠針葉喬木，是我國西南地區(qū)重要的用材林樹種，也是綠化和更新造林的重要樹種[1-2]。這一樹種也不可避免地會遭到不同昆蟲的取食與危害，其中鉆蛀害蟲云南木蠹象Pissodesyunnanensis在我國西南地區(qū)包括云南、貴州、四川等地云南松林區(qū)常有危害。當(dāng)前在貴州省威寧縣針對云南木蠹象的防治依然以清理被害枝梢燒毀為主，此方法費時費工費錢，也不利于水土保持和森林生態(tài)。因此，為探索有效、安全、經(jīng)濟的防治新方法和新技術(shù)，我們展開了天敵昆蟲定向寄主選擇行為相關(guān)化學(xué)信號的研究。

信息化合物在天敵搜尋寄主的過程中起著重要作用，這些信息化學(xué)物質(zhì)一般來源于寄主取食的植物、寄主本身或者分泌物，以及一些與寄主相關(guān)的有機體等[3-13]。天敵在害蟲綜合治理和生物防治中占有非常重要的地位，是自然控制害蟲種群密度的一個重要組成部分。該文利用固相微萃取技術(shù)，對云南木蠹象幼蟲危害的云南松帶蟲樹皮和帶蟲木質(zhì)部揮發(fā)性成分進行了萃取、分離和鑒定，以期為探索天敵昆蟲與云南木蠹象之間的信息聯(lián)系機制，天敵寄生蜂定向到該蟲的種間化學(xué)信號，為篩選對天敵昆蟲具有生物活性的引誘劑工作的開展，并實現(xiàn)對該蟲的生態(tài)控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

有云南木蠹象幼蟲在其中取食危害的云南松枝條采自貴州省威寧縣秀水鄉(xiāng)華豐村(N26.85，E103.91)云南松林區(qū)，海拔2430m。采集的帶蟲云南松枝條，置于恒溫25±1℃的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)幾天供試。

1.2 儀器

美國安捷倫公司HP6890/5975CGC-MS聯(lián)用儀、手動固相微萃取裝置(美國Supelco公司)、萃取纖維頭為PDMS100μm萃取頭、TB-4002型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、鐵架臺、樣品瓶、記時器。

1.3 固相微萃取

分別稱取3g云南木蠹象幼蟲取食危害的帶蟲云南松樹皮和帶蟲木質(zhì)部，放入50mL樣品瓶中，室溫25℃± 1℃的條件下保持30 min，樣品瓶內(nèi)樣品與頂空中的揮發(fā)物達到動態(tài)平衡，將裝有100μmPDMS纖維頭的手動進樣器針頭插入樣品瓶，固定固相微萃取裝置的手柄，然后小心推出萃取纖維頭，在室溫條件下頂空萃取45 min，快速移出萃取頭并立即插入GC-MS進樣口進行GC-MS測試，250℃熱解析5 min。

1.4 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃(保留2min)，以5℃.min-1升溫至250℃(保留2 min)，運行時間:45min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.35 psi，載氣流量1.0mL/min；分流進樣，分流比20:1，溶劑延遲時間：0.5 min。

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1200V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450amu。

對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及結(jié)合核對Nist 14、Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫和部分標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖，確定揮發(fā)物的成分，并按峰面積歸一化法計算各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

云南松帶蟲樹皮和帶蟲木質(zhì)部氣味揮發(fā)性成分總離子流圖，見圖1，圖2。GC-MS分離鑒定出的樹皮和木質(zhì)部揮發(fā)性成分及相對含量見表1。由表1可知，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分離鑒定出云南松帶蟲樹皮主要揮發(fā)性化合物總共37種，已鑒定的化合物占色譜總餾出峰面積的99.83%，相對含量最大的是α-蒎烯，相對含量為74.98%，其次是β- 蒎烯(8.52%)、檸檬烯(7.27%)和莰烯(2.03%)。云南松帶蟲木質(zhì)部主要揮發(fā)性化合物總共40種，已鑒定的化合物占色譜總餾出峰面積的93.96%，相對含量最大的是α-蒎烯，相對含量為68.40%，其次是反式石竹烯(7.11%)、檸檬烯(5.71%)和β-蒎烯(3.76%)。

圖1 帶蟲云南松樹皮揮發(fā)物總離子流圖

圖2 帶蟲云南松木質(zhì)部揮發(fā)物總離子流圖

在云南松帶蟲樹皮所鑒定的化合物中，單萜有14種，相對含量為95.50%；醇類有7種，相對含量為2.14%；倍半萜有7種，相對含量為0.99%；酮類有4種，相對含量為0.27%；醚有2種，相對含量為0.04%；烷烴有1種，相對含量為0.17%；酯類有1種，相對含量為0.7%；烯烴有1種，相對含量為0.02%。在云南松帶蟲木質(zhì)部所鑒定的化合物中，單萜有13種，相對含量為80.88%；倍半萜有11種，相對含量為9.58%；醇類有7種，相對含量為1.02%；酮類有5種，相對含量為1.12%；烷烴有2種，相對含量為1.04%；酯類有1種，相對含量為0.32%；氧化物有1種。相對含量為0.09%。在帶蟲樹皮揮發(fā)物中，單萜類和醇類相對含量較高，在帶蟲木質(zhì)部揮發(fā)物中，單萜類和倍半萜類相對含量較高。帶蟲樹皮揮發(fā)物中，單萜類、醇類和酯類的相對含量都比帶蟲木質(zhì)部揮發(fā)物中的相對含量高，而帶蟲木質(zhì)部揮發(fā)物中，則是倍半萜、酮類和烷烴類組分的相對含量比帶蟲樹皮揮發(fā)物中的相對含量高。

表1 云南木蠹象幼蟲危害的云南松揮發(fā)物

序號化合物分子式相對分子量帶 蟲 樹 皮 帶 蟲 木 質(zhì) 部 保留時間相對含量保留時間相對含量38十四烷TetradecaneC14H30198﹣﹣21.870.0739刺伯烯JunipeneC15H2420422.20.23﹣﹣40長葉烯LongifoleneC15H24204﹣﹣22.20.4141反式-石竹烯trans-CaryophylleneC15H2420422.530.6122.537.1142(E)-β-金合歡烯(E)-β-FameseneC15H2420423.360.0323.340.1643α-葎草烯alpha.-HumuleneC15H2420423.390.0623.390.8744γ- 依蘭油烯 gamma.-MuuroleneC15H24204﹣﹣23.930.0545大根香葉烯D Germacrene DC15H24204﹣﹣24.060.0446α-依蘭油烯alpha.-MuuroleneC15H24204﹣﹣24.510.2247β-沒藥烯beta.-BisaboleneC15H24204﹣﹣24.660.0248γ- 杜松烯gamma.-CadineneC15H24204﹣﹣24.860.0749δ- 杜松烯delta.-CadineneC15H24204﹣﹣25.060.350石竹烯氧化物Caryophyllene oxideC15H24O220﹣﹣26.530.09

由表1可知，帶蟲云南松樹皮和帶蟲云南松木質(zhì)部揮發(fā)性成分在組成和含量上差別很大。帶蟲云南松樹皮和帶蟲云南松木質(zhì)部共有27種相同的揮發(fā)性成分，其中萜烯類有15種，醇類有6種，酮類有4種，酯類有1種，烷烴類有1種。帶蟲樹皮揮發(fā)性成分相對含量中有99.4%與帶蟲木質(zhì)部相同；帶蟲木質(zhì)部揮發(fā)性成分相對含量中有92.41%與帶蟲樹皮相同。α-小茴香烯、δ- 3-蒈烯、順式- 氧化芳樟醇、諾蒎酮、十四烷、長葉烯、γ- 依蘭油烯、大根香葉烯D、α-依蘭油烯、β-沒藥烯、γ- 蓽澄茄烯、δ- 蓽澄茄烯和石竹烯氧化物僅在木質(zhì)部檢測到。脫氫檜烯、α-水芹烯、鄰甲基苯甲醚、百里酚甲醚、α-長葉蒎烯、長葉環(huán)烯、刺伯烯等成分僅在樹皮中檢測到。α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、桉樹腦在樹皮中的相對含量都較在木質(zhì)部的相對含量高，而反式-石竹烯、對傘花烴、樟腦、松樟酮、異蒎烷酮、馬鞭草烯酮、龍腦、4-松油醇、對- 聚傘花素醇、α-松油醇、桃金娘烯醇在樹皮中的相對含量都較在木質(zhì)部的相對含量低。

3 討論

為探索天敵寄生蜂與云南木蠹象幼蟲之間的信息聯(lián)系機制，研究天敵寄生蜂定向到該蟲幼蟲的種間化學(xué)信號，本文對云南木蠹象幼蟲危害的云南松帶蟲樹皮和帶蟲木質(zhì)部揮發(fā)性成分進行了研究，鑒定出帶蟲樹皮37種揮發(fā)性成分，帶蟲木質(zhì)部40種揮發(fā)性成分。

云南松帶蟲樹皮含有的37種氣味化合物，與報道的固相微萃取分離鑒定的健康松皮、受害松皮，徐穎凱等用蒸餾結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分離鑒定的松皮、張曉龍用同時蒸餾萃取法檢測松樹皮揮發(fā)物的基本成分相比較[14-16]，分別有21、20、15和17種相同成分。其中，三環(huán)烯、α-蒎烯 、莰烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、乙酸龍腦酯這7種化合物是各種有關(guān)云南松樹皮揮發(fā)物研究報道中均被檢測出的共有成分。

本研究帶蟲樹皮揮發(fā)物中，α-蒎烯的相對含量為74.98%，莰烯的相對含量為2.03%，β-蒎烯的相對含量為8.52%，β-月桂烯的相對含量為1.74%，檸檬烯的相對含量7.27%。在報道的固相微萃取方法分離鑒定健康樹皮揮發(fā)物中，α-蒎烯的相對含量為15.945～37.629%，莰烯的相對含量為0.362～1.069%，β-月桂烯的相對含量為5.22～47.759%，檸檬烯的相對含量19.722～39.54%，受害樹皮揮發(fā)物中，α-蒎烯的相對含量為19.821～59.186%[14]。在徐穎凱等研究中，α-蒎烯的相對含量為0.13%，莰烯的相對含量為0.28%，β-蒎烯的相對含量為27.68%[15]。由此可見，帶蟲樹皮揮發(fā)物中α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯和檸檬烯這幾種成分與健康樹皮的相對含量差異較大。帶蟲樹皮中α-蒎烯和莰烯的相對含量都比健康樹皮和不帶蟲的受害樹皮的相對含量高，而β-蒎烯、β-月桂烯和檸檬烯的相對含量都比健康樹皮低。是否是云南木蠹象幼蟲取食危害誘導(dǎo)的各成分變化有待進一步研究。

云南松帶蟲樹皮氣味化合物，與殷彩霞等用石油醚浸提的松梢韌皮揮發(fā)物基本成分相比較[17]，共有5種成分相同，分別是α-蒎烯 、莰烯、香檜烯、β-蒎烯和β-月桂烯。α-蒎烯都是相對含量最高的成分。與報道的固相微萃取方法分離鑒定健康云南松韌皮部揮發(fā)物基本成分相比較[14]，共有17種成分相同，分別是三環(huán)烯、α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、香檜烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、α-松油烯、對傘花烴、(E)-羅勒烯、γ-松油烯、α-異松油烯、乙酸龍腦酯、α-古巴烯、刺伯烯、α-葎草烯。其中α-蒎烯和莰烯在帶蟲樹皮中的相對含量都比健康韌皮部中的相對含量高，香檜烯、β-月桂烯和α-異松油烯在健康韌皮部中的相對含量則比帶蟲樹皮中的含量高，健康韌皮部香檜烯相對含量為0.725～8.914%、β-月桂烯為11.828～19.925%和α-異松油烯1.585～7.409%，帶蟲樹皮中香檜烯為0.21%、β-月桂烯為1.74%和α-異松油烯為0.29%。

云南松帶蟲木質(zhì)部含有的40種氣味化合物，與報道的固相微萃取方法分離鑒定健康云南松木質(zhì)部揮發(fā)物基本成分相比較[14]，有13種成分相同，分別是三環(huán)烯、α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯、對傘花烴、γ-松油烯、α-異松油烯、乙酸龍腦酯、α-古巴烯、α-葎草烯。其中β-蒎烯、β-月桂烯在健康木質(zhì)部中的相對含量比在帶蟲木質(zhì)部中的高。健康木質(zhì)部中β-蒎烯為10.115%，β-月桂烯為3.614%，帶蟲木質(zhì)部中β-蒎烯為3.76%，β-月桂烯為0.37%。

本研究中在帶蟲云南松樹皮揮發(fā)性成分中檢測到了鄰甲基苯甲醚和百里酚甲醚，徐穎凱等在健康云南松樹皮中檢測到的是2-異丙基-5-甲基茴香醚[15]。本文研究云南木蠹象幼蟲-云南松復(fù)合體的揮發(fā)性成分，云南木蠹象幼齡幼蟲取食危害云南松樹皮韌皮部，逐漸隨著幼蟲的生長發(fā)育，會進而在云南松枝干木質(zhì)部及髓心取食危害。云南松樹皮和木質(zhì)部在受到云南松幼蟲危害后，除了部分化合物與健康植株的揮發(fā)物組分相同，還產(chǎn)生不同于健康樹皮和木質(zhì)部的新的揮發(fā)性物質(zhì)，如鄰甲基苯甲醚、百里酚甲醚、異蒎烷酮、對-聚傘花素醇等，且與健康植株相同的成分相對含量還發(fā)生了顯著變化。

受到蟲害后的植物揮發(fā)物成分上表現(xiàn)出來的質(zhì)和量的差異是植物與天敵長期協(xié)同進化的結(jié)果，能給天敵提供精準(zhǔn)的化學(xué)信號[18-19]，有研究表明，蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物可以引誘植食性昆蟲的天敵[20-22]，云南木蠹象幼蟲在云南松樹皮和木質(zhì)部取食危害，天敵寄生蜂是如何精準(zhǔn)定位搜索到它，α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯和檸檬烯這幾種成分在云南松樹皮和木質(zhì)部受害前后相對含量變化較明顯，這幾種化合物是否是引誘天敵的主要物質(zhì)？亦或是新的揮發(fā)性物質(zhì)，如鄰甲基苯甲醚、百里酚甲醚、異蒎烷酮、對-聚傘花素醇？或是其它幾種或某種化合物共同起作用，仍需通過電生理和行為學(xué)實驗進一步證明。