金鯧魚(yú)骨中魚(yú)油的提取工藝及脂肪酸成分分析

于淑池 ，李晨晨，徐云升 ，薛長(zhǎng)風(fēng) ，裴志勝

1. 海南熱帶海洋學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院（三亞 572022）；2. 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心（三亞 572022）；3. 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心（三亞 572022）

金鯧魚(yú)（Trachinotus ovatus）系鱸形目，鲹科，學(xué)名卵形鯧鲹，地方名稱(chēng)黃臘鯧、金鯧、黃臘鲹[1]，是海南、廣西、廣東和福建主要海水養(yǎng)殖品種之一[2]，2016年產(chǎn)量約15萬(wàn) t[3]，年產(chǎn)值將近100億元[4]，其體形較大，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，無(wú)肌間刺，是加工魚(yú)塊的優(yōu)良材料[5]；自2005年以來(lái)，金鯧魚(yú)的加工制品比例不斷升高，占總產(chǎn)量的50%～80%[6]。加工過(guò)程中有魚(yú)頭、魚(yú)骨、內(nèi)臟等副產(chǎn)物產(chǎn)生，大多是直接丟棄，這不僅造成資源浪費(fèi)，還污染環(huán)境[7]。實(shí)驗(yàn)室前期從金鯧魚(yú)骨中提取明膠時(shí)發(fā)現(xiàn)[8]，金鯧魚(yú)骨（干質(zhì)量）中粗脂肪含量非常高（43.75%±0.28%），目前從金鯧魚(yú)骨中提取魚(yú)油的報(bào)道鮮見(jiàn)，僅有曹璇等[9]利用超聲波輔助稀堿水解法提取了金鯧魚(yú)骨油，采用酶解法提取金鯧魚(yú)骨油還未見(jiàn)報(bào)道。因此，此次試驗(yàn)采用環(huán)境友好的酶解法提取金鯧魚(yú)骨魚(yú)油，以實(shí)現(xiàn)對(duì)金鯧魚(yú)加工副產(chǎn)物的高值化利用，同時(shí)減少環(huán)境污染。

目前魚(yú)油提取方法主要有淡堿水解法、壓榨法、有機(jī)溶劑法、蒸煮法、低溫提油法、酶解法（水酶法）、酸水解法、超臨界流體萃取法等[10-11]；酶解法是利用蛋白酶水解破壞蛋白質(zhì)和脂肪之間的結(jié)合釋放油脂[12]，具有作用溫和、時(shí)間短的特點(diǎn)，且有效保護(hù)油脂組分，能夠充分釋放原料中的油脂，從而提高魚(yú)油品質(zhì)和魚(yú)油提取率[13]，蛋白酶水解生產(chǎn)的酶溶液可進(jìn)一步加工，亦可以作為廢棄資源再利用；因此避免了加工過(guò)程中原料及副產(chǎn)物的浪費(fèi)。

此次試驗(yàn)以金鯧魚(yú)骨為原料進(jìn)行提取并精煉魚(yú)油，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出最佳酶種類(lèi)及酶解條件，再進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳酶解工藝，對(duì)提取的金鯧魚(yú)骨油進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定及脂肪酸組成分析，為金鯧魚(yú)等水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鯧魚(yú)，市售。氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、酚酞、碘化鉀、磷酸、冰乙酸、異辛烷，均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；凹凸棒土、酵母粉、淀粉，均為食品級(jí)，廣東一品鮮生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（20 000 U/g）、胰蛋白酶（10 000 U/g）、堿性蛋白酶（10 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶（30 000 U/g），深圳恒生生物科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（30 000 U/g），無(wú)錫市聯(lián)合恒洲化工有限公司；所有酶均為食品級(jí)；脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)NuChek-Prep公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-26超級(jí)恒溫水浴槽，金壇市盛藍(lán)儀器有限公司；MultifugeX1R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；LT-DBX23N（熱風(fēng)循環(huán)）烘箱，北京普析通用儀器有限公司；FA2204B電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GM200全新刀片式研磨儀，德國(guó)萊馳公司；PB-10酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；7890A氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油提取的工藝流程

金鯧魚(yú)預(yù)處理（去內(nèi)臟及魚(yú)肉，去掉魚(yú)頭）→魚(yú)骨55 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量→研磨儀（轉(zhuǎn)速10 000 r/min）打碎魚(yú)骨→過(guò)孔徑0.250 mm篩→魚(yú)骨粉→加入一定量水，調(diào)節(jié)料液比→加入NaOH/HCl調(diào)至各酶的最適pH→加酶升溫酶解→滅酶（沸水浴10 min）→離心（5 000 r/min離心10 min）→4 ℃冷藏5 h→倒出酶解液，得粗魚(yú)油→精煉→磷酸脫膠[14]→氫氧化鈉脫酸[14]→凹凸棒土脫色[15]→酵母粉脫腥[15]→計(jì)算魚(yú)油提取率→魚(yú)油品質(zhì)評(píng)價(jià)

1.3.2 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油酶解提取的最佳工藝確定

1) 最佳水解酶種類(lèi)選擇。分別采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶，在各種酶的最適條件（胰蛋白酶：pH 8.0，50 ℃。中性蛋白酶：pH 7.0，50 ℃。胃蛋白酶：pH 2.0，50 ℃[10]。木瓜蛋白酶：pH 7.0，50℃[16]。風(fēng)味蛋白酶：pH 9.0，55 ℃。堿性蛋白酶：pH10.0，65 ℃[17]）下，添加相同的酶用量2.25×103U/g（以原料計(jì)），料液比1∶1（g/mL），酶解時(shí)間5 h，篩選出最適合的蛋白酶，以魚(yú)油提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。魚(yú)油提取率按式（1）計(jì)算。

2) 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油提取的單因素試驗(yàn)方法。利用木瓜蛋白酶提取金鯧魚(yú)骨魚(yú)油，初步固定酶添加量2.25×103U/g、酶解pH 7.0、料液比1∶1（g/mL）、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間5 h，分別展開(kāi)酶添加量（0.75，1.5，2.25，3和3.75×103U/g）、酶解pH（5，5.5，6，6.5和7）、料液比（1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2和1∶2.5 g/mL）、酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）、酶解時(shí)間（3，4，5，6和7 h）5個(gè)因素的單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，以魚(yú)油提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而確定最優(yōu)的單因素條件。

3) 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定木瓜蛋白酶酶解pH 6.0，選擇酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）和酶解時(shí)間（D）4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，以魚(yú)油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.3 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油理化指標(biāo)測(cè)定方法

魚(yú)油的感官指標(biāo)評(píng)價(jià)參照SC/T 3502—2016；過(guò)氧化值的測(cè)定參照GB 5009.227—2016；酸值的測(cè)定參照GB 5009.229—2016；碘價(jià)的測(cè)定參照GB/T 5532—2008；水分及揮發(fā)物的測(cè)定參照GB 5009.236—2016；不溶性雜質(zhì)的測(cè)定參照 GB/T 15688—2008。

1.3.4 氣相色譜法分析脂肪酸成分

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》，采用GC法分析脂肪酸組成，首先利用堿法對(duì)樣品甲酯化，取適量樣品加入1.5 mL正己烷和40 μL乙酸甲酯，再加入100 μL甲醇鈉-甲醇（0.5 mol/L）溶液，在37 ℃下反應(yīng)20 min，然后置于-20 ℃下冷凍10 min，取出后迅速加入60 μL草酸，離心取上清液，并將上清液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱以除去其中的水分，氮?dú)獯蹈桑诱和閺?fù)溶，進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：FID檢測(cè)器，1 μL自動(dòng)進(jìn)樣；色譜柱采用熔融石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，CP-Sil88，Chrompack，Agilent，USA）。進(jìn)樣口溫度為250 ℃。爐溫為程序升溫：45 ℃時(shí)保持4 min，然后以13 ℃/min的升溫速率將溫度升至215 ℃，保持35 min，總測(cè)定時(shí)間為86 min；檢測(cè)器的溫度為250 ℃，氫氣流速為30.0 mL/min；氮?dú)饬魉贋?0.0 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值；單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel作圖，采用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析；脂肪酸的組成分析，采用Agilent Chemstation軟件對(duì)氣相色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，通過(guò)與脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，采用面積百分比確定各種脂肪酸所占的百分含量（以峰面積的百分比表示）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蛋白酶種類(lèi)對(duì)金鯧魚(yú)骨魚(yú)油提取率的影響

蛋白酶具有良好的破乳效果，可水解界面蛋白質(zhì)，降低界面強(qiáng)度，破壞蛋白質(zhì)和魚(yú)油的結(jié)合，促進(jìn)油滴的聚結(jié)和絮凝[18]，釋放出油脂。采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶，在其各自最適溫度與pH條件下對(duì)金鯧魚(yú)骨進(jìn)行酶解提油，魚(yú)油提取率結(jié)果見(jiàn)圖1。在加酶量相同的條件下，木瓜蛋白酶的提油率明顯高于其他5種蛋白酶，魚(yú)油提取率可達(dá)17.2%；風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的提油率在10%左右，胰蛋白酶和胃蛋白酶的提油效果最差，絕大部分魚(yú)油未得到充分的釋放?？赡苁怯捎诓煌冈诘鞍踪|(zhì)上的作用位點(diǎn)不同，蛋白水解程度也不同；李平等[17]利用5種蛋白酶提取三文魚(yú)魚(yú)皮油脂，也是木瓜蛋白酶酶解效果最好，與此次試驗(yàn)結(jié)果一致，推測(cè)可能與木瓜蛋白酶的活性位點(diǎn)、酶解環(huán)境等有關(guān)，木瓜蛋白酶可以切開(kāi)點(diǎn)羧基側(cè)任一氨基酸殘基的肽鍵[19]，水解效率很高；隨著木瓜蛋白酶的水解，與脂質(zhì)相關(guān)的蛋白裂解程度高[20]，從而使魚(yú)油易于釋放。

圖1 不同種類(lèi)蛋白酶對(duì)金鯧魚(yú)骨魚(yú)油的酶解提油效果比較

2.1.2 木瓜蛋白酶添加量對(duì)魚(yú)油提取率的影響

從圖2可以看出，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，魚(yú)油提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為1.5×103U/g時(shí)，提取率達(dá)到最大值（19.35%）。隨著酶量的繼續(xù)增加，提油率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，原因可能是釋放的脂質(zhì)與肽或磷脂乳化，降低了油脂提取率[21]。Del Valle等[22]指出水解度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致乳狀液形成，不利于脂質(zhì)的釋放。因此木瓜蛋白酶的最適添加量為1.5×103U/g。

2.1.3 酶解pH對(duì)魚(yú)油提取率的影響

木瓜蛋白酶催化反應(yīng)的pH范圍是3.5～9，最適pH一般為5～7，單因素水平設(shè)置以最適范圍按等差數(shù)列展開(kāi)。從圖3可以看出，隨著pH增加，魚(yú)油提取率呈現(xiàn)先增大后稍下降并趨于平緩的趨勢(shì)；當(dāng)pH為6.0時(shí)，提取率達(dá)到最大值（8.56%），因此木瓜蛋白酶的最適pH為6.0。

圖2 酶添加量對(duì)魚(yú)油提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)魚(yú)油提取率的影響

從圖4可以知道，料液比在1∶0.5～1∶1.5（g/mL）范圍內(nèi)與酶解提油效果呈正比，水量增加越多，酶解效果越好，魚(yú)油提取率也越好，且在1∶1.5（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值（19.48%）。原因可能是整個(gè)酶解系統(tǒng)內(nèi)水分可以幫助蛋白酶與底物接觸充分，提高酶解速度，增加酶解程度，同時(shí)脂肪也易于溶出[23]。水量一旦超過(guò)限度，水分的增加致使底物濃度降低，造成酶解不完全和油脂提取率降低，因此最佳料液比為1∶1.5（g/mL）。

圖3 酶解pH對(duì)魚(yú)油提取率的影響

圖4 料液比對(duì)魚(yú)油提取率的影響

2.1.5 酶解溫度對(duì)魚(yú)油提取率的影響

木瓜蛋白酶催化反應(yīng)的溫度范圍是20～80 ℃，最適溫度一般為50～60 ℃，單因素水平設(shè)置稍低于最適溫度按等差數(shù)列展開(kāi)。由圖5可知，魚(yú)油提取率隨著溫度的上升呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，55 ℃時(shí)達(dá)到最大值（18.28%），隨后油脂提取率有逐漸下降，究其原因，蛋白酶生理活性在最適宜溫度時(shí)達(dá)到最高，過(guò)高的溫度會(huì)破壞酶的分子結(jié)構(gòu)從而發(fā)生變性，失去活性，降低酶與底物的反應(yīng)速度[15]。與此同時(shí)，溫度過(guò)高也會(huì)加快油脂的氧化導(dǎo)致品質(zhì)降低。綜上所述，較適宜的酶解溫度為55 ℃。

圖5 酶解溫度對(duì)魚(yú)油提取率的影響

2.1.6 酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)油提取率的影響

從圖6可以看出，金鯧魚(yú)骨魚(yú)油的提取率隨初期時(shí)間增加而升高，酶解4 h魚(yú)油提取率達(dá)到最高（21.44%）；酶解時(shí)間4 h后，油脂提取率增速趨于平衡，原因可能是隨著時(shí)間的增加，木瓜蛋白酶與底物充分接觸，作用狀態(tài)基本達(dá)到平衡。此外，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，油脂顏色也逐漸加深，可能是部分多不飽和脂肪酸發(fā)生了氧化[24]。綜合考慮，最宜酶解時(shí)間為4 h。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)魚(yú)油提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2的極差R值分析可知，酶添加量（A）、料液比（B）、酶解溫度（C）和酶解時(shí)間（D）4個(gè)因素對(duì)提油率的影響主次效應(yīng)為A＞C＞D＞B，即酶添加量對(duì)提油率影響最大，其次是酶解溫度，再次是酶解時(shí)間，料液比的影響最小。4種因素的最佳組合為A2B3C2D2，即酶添加量1.5×103U/g，料液比1∶1.75（g/mL），酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間4 h。經(jīng)驗(yàn)證，魚(yú)油提取率可達(dá)24.85%。

王海軍等[25]采用稀堿水解法提取鰱魚(yú)骨粗魚(yú)油，提取率為39.83%（折合成占魚(yú)骨的百分比為5.97%）；曹璇等[9]采用超聲波輔助稀堿水解法提取金鯧魚(yú)骨油，其提取率為80.51%（折合成占魚(yú)骨的百分比為24.12%）；白艷等[26]用胰蛋白酶提取鰻魚(yú)下腳料的魚(yú)油，提取率為23.87%；薛宇航等[27]采用胰蛋白酶和胃蛋白酶雙酶法提取星鰻骨魚(yú)油，提取率為24.44%。此次試驗(yàn)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鰱魚(yú)骨油的提取率，與超聲波輔助稀堿水解法提取金鯧魚(yú)骨油、酶解法提取鰻魚(yú)下腳料魚(yú)油以及雙酶水解星鰻魚(yú)骨油的提取率基本相當(dāng)；而且此次試驗(yàn)得到的是精煉魚(yú)油，顯示出木瓜蛋白酶酶解金鯧魚(yú)骨提油的良好效果和實(shí)際應(yīng)用潛力。

表2 金鯧魚(yú)骨酶解提取魚(yú)油的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 金鯧魚(yú)骨油感官及理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

依據(jù)SC/T 3502—2016，對(duì)最佳提取工藝條件下提取精煉的金鯧魚(yú)骨魚(yú)油進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。金鯧魚(yú)骨魚(yú)油色澤呈淡黃色，澄清透亮，稍有魚(yú)油特有的腥味，無(wú)酸敗味，感官指標(biāo)符合SC/T 3502—2016精制油標(biāo)準(zhǔn)。表4為金鯧魚(yú)骨魚(yú)油相關(guān)理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果。

表3 金鯧魚(yú)骨油感官指標(biāo)

從表4可以看出，金鯧魚(yú)骨魚(yú)油相關(guān)理化指標(biāo)分別為碘價(jià)141.36 g/100 g，過(guò)氧化值2.56 meq/kg，不溶性雜質(zhì)含量0.08%，符合 SC/T 3502—2016精煉魚(yú)油的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；酸值為1.13 mg/g，水分及揮發(fā)物含量為0.17%，符合 SC/T 3502—2016精煉魚(yú)油的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表4 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油理化特性

2.4 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油脂肪酸成分分析

采用氣相色譜法，分析金鯧魚(yú)骨魚(yú)油肪酸組成，結(jié)果見(jiàn)表5。金鯧魚(yú)骨魚(yú)油主要由C12～C22脂肪酸組成，飽和脂肪酸有9種，相對(duì)百分含量為36.88%，其中以棕櫚酸為主。不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量為63.05%，其中單不飽和脂肪酸有6種，相對(duì)百分含量為32.80%，主要由油酸組成；多不飽和脂肪酸有10種，相對(duì)百分含量為30.27%，其中亞油酸的含量最高，其次為α-亞麻酸、DHA，同時(shí)還含有少量的EPA、DPA。郭萌萌等[28]通過(guò)GC法分析金鯧魚(yú)魚(yú)骨主要脂肪酸組成，其飽和脂肪酸含量為32.82%，單不飽和脂肪酸含量為34.27%，多不飽和脂肪酸含量為31.84%；油酸含量為26.91%、亞油酸含量為21.88%；曹璇等[9]采用GC/MS對(duì)超聲波輔助稀堿水解法提取的金鯧魚(yú)骨油脂肪酸C7～C24成分分析發(fā)現(xiàn)，金鯧魚(yú)骨油中飽和脂肪酸含量為31.56%，不飽和脂肪酸含量為68.44%；其中單不飽和脂肪酸總量為37.99%，多不飽和脂肪酸總量為30.45%；其中油酸（27.86%）和棕櫚酸（21.46%）含量最高，富含亞油酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。此次試驗(yàn)與已報(bào)道的金鯧魚(yú)骨油脂肪酸測(cè)定結(jié)果基本一致。

表5 金鯧魚(yú)骨魚(yú)油脂肪酸組成及含量

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)以金鯧魚(yú)骨為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，最終得到金鯧魚(yú)骨魚(yú)油酶解提取的最佳工藝參數(shù)：木瓜蛋白酶為最佳水解酶，在pH 6.0條件下，添加量1.5×103U/g，料液比1∶1.75（g/mL），酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間4 h，最佳工藝條件下的提取率為24.85%；采用木瓜蛋白酶酶解魚(yú)骨提取魚(yú)油提取條件溫和，魚(yú)油質(zhì)量好、純度高。所得魚(yú)油色澤呈淡黃色，澄清透亮，具有魚(yú)油特有的微腥味，無(wú)酸敗味，感官指標(biāo)符合SC/T 3502—2016精制魚(yú)油的標(biāo)準(zhǔn)；碘價(jià)、過(guò)氧化值、不溶性雜質(zhì)3項(xiàng)指標(biāo)符合SC/T3502—2016的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；酸值、水分及揮發(fā)物指標(biāo)符合SC/T 3502—2016的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；氣相色譜分析表明，酶解法提取的金鯧魚(yú)骨魚(yú)油以棕櫚酸、油酸、亞油酸含量最高，不飽和脂肪酸含量（63.05%）遠(yuǎn)高于飽和脂肪酸含量（36.88%），其中單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量分別為32.80%和30.27%，亞麻酸和DHA含量較高，表明金鯧魚(yú)骨油是一種較高品質(zhì)的油脂。此次試驗(yàn)可以為綜合利用金鯧魚(yú)加工副產(chǎn)物提供參考。