黑豆皮對(duì)鉛中毒導(dǎo)致果蠅機(jī)體損傷的影響研究

李飛翔, 劉志華, 肖桂然

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

鉛是一種環(huán)境持久性毒素、會(huì)引起神經(jīng)、血液、胃腸道、生殖、循環(huán)和免疫病理學(xué)等障礙[1]。多項(xiàng)研究表明,鉛具有催化氧化反應(yīng)并產(chǎn)生活性氧的傾向,這些活性氧會(huì)造成機(jī)體氧化損傷[2-4]。越來(lái)越多的流行病學(xué)研究證據(jù)表明,鉛暴露與鐵缺乏癥密切相關(guān)[5-6]。前期實(shí)驗(yàn)表明,鉛暴露會(huì)導(dǎo)致果蠅全身鐵含量降低并造成果蠅一系列的生理缺陷,食物中加鐵會(huì)顯著地挽救鉛毒性造成的表型[7]。

鐵是人體中最豐富的微量元素,是許多蛋白質(zhì)合成所必需的[8-9]。鐵穩(wěn)態(tài)異常會(huì)導(dǎo)致許多人類疾病[10]。中醫(yī)藥是我國(guó)傳統(tǒng)文化的瑰寶,在治療各種疾病方面有著悠久的歷史,為了中華民族的健康做出了巨大的貢獻(xiàn)。我國(guó)自古以來(lái)都有“藥食同源”的理論,黑色食品有補(bǔ)血補(bǔ)氣的功效,在治療缺鐵性貧血方面有著一定的臨床效果[11]。

黑豆是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食物。根據(jù)《中國(guó)藥典》記載,黑豆具有補(bǔ)血補(bǔ)腎的功效[12]。中醫(yī)歷來(lái)認(rèn)為黑豆具有健脾利水、滋陰潤(rùn)肺、活血解毒等功效[13]。現(xiàn)代研究表明,黑豆的種皮由于含有豐富的花青素,具有多種有益的生物活性[14],例如抗氧化作用、抗糖尿病以及抗肥胖等功效[15-17]。還有研究表明，黑豆皮(black soybean seed coat,BSSC)的提取物能調(diào)控機(jī)體鐵代謝[18]。

本文以經(jīng)典模式生物果蠅研究表明,膳食攝入BSSC能顯著挽救果蠅鉛中毒的表型,包括存活率、生長(zhǎng)周期、行動(dòng)能力以及壽命。進(jìn)一步研究表明,膳食攝入BSSC能顯著挽救鉛中毒導(dǎo)致的果蠅體內(nèi)鐵缺乏。本研究推測(cè),膳食攝入BSSC能夠通過(guò)促進(jìn)鐵吸收緩解鉛中毒，能夠?yàn)殂U中毒的防治提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

果蠅飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的玉米面粉培養(yǎng)基上,飼養(yǎng)環(huán)境為25 ℃、65%濕度。添加黑豆皮粉的質(zhì)量濃度為20 mg/mL,添加乙酸鉛濃度為1 mmol/L,果蠅基因型為W1118，來(lái)自維也納果蠅資源中心。

1.2 方法

1.2.1 存活率的測(cè)定

將新羽化的野生型W1118蠅交配3 d,然后將它們轉(zhuǎn)移到瓊脂平板上并產(chǎn)卵24 h。 新孵化的第1齡幼蟲被轉(zhuǎn)移到不同種類的食物中。 密度控制為每管50只幼蟲,每組10管,統(tǒng)計(jì)羽化果蠅的數(shù)目。存活率計(jì)算公式為:

(羽化的果蠅數(shù)/50)×100%。

1.2.2 行動(dòng)能力的測(cè)定

在各食物處理組中,每組在一根20 cm長(zhǎng)的空管中挑入20只果蠅,將所有果蠅磕入底部,計(jì)時(shí)5 s,統(tǒng)計(jì)果蠅能爬過(guò)10 cm高的數(shù)量。

1.2.3 果蠅壽命的測(cè)定

在各食物處理組中,每組放入20只同一天羽化的雌蠅,每2 d更換培養(yǎng)基,剔除死亡果蠅并計(jì)數(shù),至各組果蠅全部死亡,29 ℃,65%濕度,每組10管。

1.2.4 鐵相對(duì)含量的測(cè)定

采用菲洛嗪比色法測(cè)定果蠅幼蟲鐵。簡(jiǎn)而言之,用PBST(137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4和0.1%Triton X-100,pH值7.4)提取組織樣品；通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品在95 ℃下用濃鹽酸水解20 min,并在16 000g下離心；用75 mmol/L抗壞血酸將上清三價(jià)鐵還原為亞鐵，添加菲洛嗪,渦旋并瞬時(shí)離心；最后,將飽和乙酸銨添加到每個(gè)管中,并在562 nm處測(cè)量吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為(均值±標(biāo)準(zhǔn)差),組間差異使用One-way ANOVA檢驗(yàn),顯著性水平P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆皮挽救鉛暴露果蠅的存活率

鉛暴露的果蠅存活率的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。圖1中，NF表示正常食物;BSSC表示黑豆皮;Pb表示乙酸鉛，下同。由圖1可知,與正常食物組相比,鉛暴露組果蠅的存活率顯著降低,是對(duì)照組的40%,但是黑豆皮粉處理組存活率與鉛暴露組相比得到顯著的挽救,約為正常組的60%。

圖1 不同食物處理組果蠅存活率

2.2 黑豆皮挽救鉛暴露果蠅生長(zhǎng)周期

一般飼養(yǎng)環(huán)境下正常食物果蠅從幼蟲到羽化生長(zhǎng)周期約為10 d,鉛暴露果蠅生長(zhǎng)遲緩,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知, 鉛暴露組果蠅生長(zhǎng)周期與正常食物組相比變得延長(zhǎng),比正常組多1.5 d,而黑豆皮粉處理組果蠅生長(zhǎng)周期與正常組相同。說(shuō)明黑豆皮能挽救鉛所造成的果蠅生長(zhǎng)遲緩。

圖2 不同食物處理組果蠅生長(zhǎng)周期

2.3 黑豆皮挽救鉛暴露果蠅行動(dòng)能力

檢測(cè)鉛暴露條件下果蠅的行動(dòng)能力如圖3所示,由圖3可知,鉛暴露組的果蠅行動(dòng)能力降低,約為正常食物組的70%,但是當(dāng)黑豆皮同時(shí)干預(yù)之后果蠅的行動(dòng)能力恢復(fù)到正常組的90%。

組別

2.4 黑豆皮挽救鉛暴露果蠅壽命

為了檢測(cè)不同食物組對(duì)果蠅壽命的影響,本文選用同一天不同食物上羽化的雌蠅,在29 ℃的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),記錄每天死亡數(shù)目，如圖4所示。

圖4 不同食物上果蠅的壽命

由圖4可知,在鉛暴露食物組果蠅在20 d時(shí)已經(jīng)大部分死亡,死亡率50%時(shí)鉛暴露組中期壽命為16 d,而添加黑豆皮后挽救到22 d。

2.5 黑豆皮攝入提高果蠅體內(nèi)鐵相對(duì)含量

為了進(jìn)一步探討鉛暴露與果蠅機(jī)體鐵代謝的關(guān)系,本文采用菲洛嗪法測(cè)定不同食物上的果蠅三齡幼蟲總鐵相對(duì)含量,如圖5所示。由圖5可知，在鉛暴露組果蠅鐵相對(duì)含量與正常組相比顯著降低,約為正常組的50%,而黑豆皮干預(yù)組鐵相對(duì)含量與鉛暴露組相比顯著升高,約為正常組的75%；單獨(dú)添加黑豆皮組鐵相對(duì)含量與正常食物組相比也有所升高,約為正常組的125%。說(shuō)明黑豆皮本身具有補(bǔ)鐵的作用。

圖5 不同食物組果蠅全蟲鐵相對(duì)含量

3 結(jié) 論

本文以果蠅為模式生物,探究了鉛暴露在果蠅體內(nèi)的危害以及黑豆皮對(duì)鉛暴露果蠅的挽救。結(jié)果表明，鉛暴露使果蠅存活率降低、發(fā)育遲緩、行動(dòng)能力下降以及壽命縮短,而黑豆皮能有效地挽救這些表型；當(dāng)檢測(cè)果蠅身體鐵相對(duì)含量時(shí),鉛暴露會(huì)導(dǎo)致果蠅身體鐵相對(duì)含量降低,而添加黑豆皮能升高果蠅鐵相對(duì)含量。因此推測(cè)黑豆皮能夠提高果蠅機(jī)體鐵水平進(jìn)而挽救鉛中毒。