高效凈化黑臭水體微生物菌劑的研究*

王海珊 鄒 平# 葉敬旴 包本濤 楊常亮 畢曉伊 王 潔

(1.云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650091；2.云南大學(xué)國際河流與生態(tài)安全研究院，云南 昆明 650091；3.云南省高原山地生態(tài)與退化環(huán)境修復(fù)重點實驗室，云南 昆明 650091；4.云南省國際河流與跨境生態(tài)安全重點實驗室，云南 昆明 650091)

大量污染物進(jìn)入水體，分解代謝消耗溶解氧，導(dǎo)致水體厭氧或缺氧，產(chǎn)生H2S、NH3等氣體，同時形成FeS、MnS等黑色物質(zhì)，從而形成黑臭水體[1]。黑臭水體不僅影響城市景觀，且對人體健康存在危害[2-3]。黑臭水體的治理方法主要有物理法、化學(xué)法及生物法。近年來，生物法由于具有處理量大、成本低、無二次污染等[4]諸多優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于黑臭水體的治理。生物法主要包括微生物強化法、植物吸收法等。

微生物強化法是一種通過投加菌劑、促生劑等手段，使水體中微生物的多樣性及生物量迅速提高，形成一定的菌群規(guī)模[5]，從而強化微生物對污染物降解作用的方法。投加菌劑是黑臭水體治理中極為常用的微生物強化法，目前主要集中于土著菌劑及工程菌劑兩大類型的研究。如楊文娟[6]利用目標(biāo)黑臭水體富集培養(yǎng)光合菌劑及反硝化菌后制成土著菌劑，用于凈化黑臭水體后，TN、TP、COD去除率分別達(dá)到55.30%、42.68%、57.67%。莊景等[7]運用工程菌劑處理無錫市滸溪河水體，其對氨氮、TP、COD去除率分別達(dá)到58.00%、56.00%、43.00%。

土著菌劑及工程菌劑均是通過人為手段篩選并富集培養(yǎng)某些具有較強污染物降解特性的功能菌群后，按一定比例配制而成的菌劑。兩種菌劑菌種來源不同，對黑臭水體的適應(yīng)性、凈化效果等也可能產(chǎn)生差異。但目前對于兩大類型菌劑對黑臭水體適應(yīng)性、凈化效率及機(jī)制的比較研究尚少。故本研究以云南省昆明市晉寧區(qū)晉城百花街東干河為目標(biāo)黑臭水體，選用土著菌劑及工程菌劑代表各1種進(jìn)行黑臭水體凈化實驗，并進(jìn)行高通量測序分析兩種菌劑凈化黑臭水體后的微生物群落結(jié)構(gòu)，比較兩種菌劑對黑臭水體的適應(yīng)性、凈化效率差異，并從微生物的角度分析差異產(chǎn)生的原因，從而對兩種菌劑對黑臭水體的凈化機(jī)制進(jìn)行初步探討，為黑臭水體治理工作中更科學(xué)地選用菌劑提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 微生物菌劑

利用東干河黑臭水分別富集培養(yǎng)硝化菌、酵母菌、光合菌、放線菌，培養(yǎng)期間每天監(jiān)測4種菌的生長狀態(tài)，當(dāng)達(dá)到對數(shù)生長期時，參照前期研究結(jié)果，迅速按3∶3∶3∶4的體積比混勻[8]125，配制成土著菌劑A(本實驗室自主研發(fā))，為保證微生物保持較高活性，避免微生物進(jìn)入衰亡期影響實驗結(jié)果，土著菌劑A需現(xiàn)配現(xiàn)用。工程菌劑B為某環(huán)保公司生產(chǎn)的工程菌劑，其主要組成菌種為植物源枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)、梭菌(Clostridium)、乳酸菌(Lactobacillus)、厭氧繩菌(Anaerolinea)等。

1.2 實驗樣品

實驗所需水樣和底泥取自云南省昆明市晉寧區(qū)晉城百花街東干河，該河道流速較低，且常年黑臭，河道周圍有較多居民居住，并分散著各種中小企業(yè)，是典型的鄉(xiāng)鎮(zhèn)復(fù)合型污染河道。將該黑臭河道的水樣及底泥混勻靜置2 h后，測定黑臭水體背景值，結(jié)果見表1。

表1 黑臭水體背景值Table 1 Black-odorous water background values

1.3 實驗方法

1.3.1 確定工程菌劑的最佳投加量

兩種菌劑對黑臭水體的凈化實驗均需在最佳投加量下進(jìn)行。由前期實驗可知，土著菌劑A最佳投加量為50 ml/L[8]127。工程菌劑B最佳投加量通過單因素實驗得到：投加量依次設(shè)置為0.1、0.5、1.0、5.0、25.0 g/L；實驗在搖瓶機(jī)(ZHWY-2102C)中進(jìn)行，溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min；每天定時取樣，分別測定1個實驗周期內(nèi)(實驗周期的時間長短依據(jù)指標(biāo)去除率而定，當(dāng)指標(biāo)去除率穩(wěn)定時，則實驗結(jié)束，所有實驗均如此)氨氮、TP和COD的去除率；每個實驗重復(fù)操作3次。

1.3.2 不同菌劑在最佳投加量狀態(tài)下對黑臭水體的凈化效果

本實驗設(shè)置3個實驗組，分別按最佳投加量加入土著菌劑A及工程菌劑B，空白組不加菌劑。實驗在搖瓶機(jī)中進(jìn)行，溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min。每天定時取樣，分別測定1個實驗周期內(nèi)氨氮、TP和COD的去除率，比較3個實驗組對氨氮、TP和COD去除率的差異，并探究產(chǎn)生差異的原因。

1.4 水質(zhì)指標(biāo)測定方法

實驗過程中，每天定時取上清液，將其放入離心機(jī)(Allegra X-30R)中(8 000 r/min，-4 ℃)離心5 min，取上清液測定TP、COD、氨氮。TP、COD、氨氮分別采用鉬酸銨分光光度法、重鉻酸鉀法、納氏試劑分光光度法測定[9]。

1.5 微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析方法

本實驗通過高通量測序分析細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，以期從細(xì)菌、真菌角度理解不同菌劑對黑臭水體凈化效率產(chǎn)生差異的原因。凈化實驗結(jié)束后，分別取3個實驗組泥水混合物各50 mL，放入離心機(jī)(12 000 r/min，-4 ℃)離心10 min，收集離心沉淀物并做好標(biāo)記，-80 ℃保存，送至上海某生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序。3個實驗組樣品使用該生物醫(yī)藥科技有限公司的DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，在確定提取的DNA樣品滿足上機(jī)測序的用量需求后，用通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V4～V5區(qū)。用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)擴(kuò)增真菌ITS的ITS1區(qū)。擴(kuò)增結(jié)束后對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物通過MiSeq平臺完成測序。預(yù)處理過程中各參數(shù)的設(shè)置詳見參考文獻(xiàn)[10]。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件及I-Sanger云平臺分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同菌劑對黑臭水體的凈化效率

2.1.1 工程菌劑B的最佳投加量

不同投加量下工程菌劑B對黑臭水體的凈化效果見圖1，當(dāng)投加量為5.0 g/L時，工程菌劑B對黑臭水體中氨氮、TP、COD的去除率最大，分別達(dá)到55.32%、75.57%、45.92%。在一個實驗周期內(nèi)，隨著工程菌劑B投加量的增加，其對黑臭水體中氨氮、TP、COD去除率大體呈先升高后降低趨勢。這可能是因為菌劑投加量過大時，培養(yǎng)體系的養(yǎng)分有限，微生物之間存在激烈的生存競爭，經(jīng)過較短時間的生長繁殖后，菌群迅速進(jìn)入衰亡期，大量微生物死亡，凈化能力下降。

圖1 不同投加量下的去除率Fig.1 Removal efficiency under different dosages

2.1.2 兩種菌劑對黑臭水體的凈化效率

由圖2可知，1個實驗周期內(nèi)，空白、工程菌劑B、土著菌劑A的氨氮去除率分別為25.32%、51.32%、92.39%，TP去除率分別為71.05%、72.57%、89.29%，COD去除率分別為9.52%、43.92%、62.93%。3個實驗組對3個指標(biāo)的去除率表現(xiàn)為土著菌劑A>工程菌劑B>空白。相較于空白，菌劑對氨氮、TP、COD的去除率均有不同程度的提升，這說明投加菌劑對于強化黑臭水體污染物去除是必要的，這也是目前其被廣泛應(yīng)用于黑臭水體治理的原因。

圖2 不同菌劑處理下的去除率Fig.2 Removal efficiency under different microbial agent treatments

在實驗初期土著菌劑A對TP、COD就有較高的去除率，而工程菌劑B對其去除率較低。6 d時，土著菌劑A對氨氮、TP、COD的去除率與工程菌劑B相比分別高41.07百分點、16.72百分點、19.01百分點，凈化效果明顯優(yōu)于工程菌劑B。這可能是因為土著菌劑A的菌種來自于目標(biāo)黑臭水體，其世代生存于目標(biāo)黑臭水體中，已完成馴化及演替過程，對目標(biāo)黑臭水體具有極強的適應(yīng)性及耐受性，能在短時間內(nèi)快速適應(yīng)黑臭水體的極端惡劣環(huán)境，快速降解污染物，故在實驗初期即呈現(xiàn)出較高的去除率，且一直處于領(lǐng)先狀態(tài)。工程菌劑B的菌種并非來自于目標(biāo)黑臭水體，當(dāng)其投入目標(biāo)黑臭水體中時，微生物需要適應(yīng)新的環(huán)境，其生長繁殖有一個較長的延遲期，故在實驗初期呈現(xiàn)出較低的污染物去除率，隨著實驗時間的延長，微生物逐漸適應(yīng)新的生存環(huán)境，逐漸發(fā)揮凈化作用，污染物去除率也逐漸提高，但其去除率在有效時間內(nèi)始終低于土著菌劑A。

綜上所述，土著菌劑A對黑臭水體適應(yīng)性更高，可在短時間內(nèi)迅速降解污染物。工程菌劑B延遲期較長，需要適應(yīng)一定時間，污染物去除率才逐漸提高，但去除率始終低于土著菌劑A。因此，土著菌劑A應(yīng)用于黑臭水體的凈化，可縮短黑臭水體的修復(fù)周期。

2.2 不同菌劑處理下微生物群落結(jié)構(gòu)比較分析

2.2.1 不同菌劑對微生物多樣性的影響

系統(tǒng)中微生物的多樣性及生物量與系統(tǒng)的凈化效率、穩(wěn)定性等相關(guān)，本實驗測定了各實驗組樣品的Alpha 多樣性，結(jié)果見表2。由表2中 Coverage指數(shù)可知，3個樣品的覆蓋率基本無差異，覆蓋率均超過99%，說明本次測序深度足夠反映樣品中細(xì)菌的真實情況。由Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)可知，細(xì)菌群落豐富度表現(xiàn)為工程菌劑B>空白>土著菌劑A。由Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知，細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為工程菌劑B>空白>土著菌劑A。

表2 細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial Alpha diversity index

土著菌劑A的細(xì)菌群落多樣性最低，但其對污染物去除率卻最高，說明不是所有微生物具有污染物去除作用，土著菌劑A處理可能使具有污染物降解特性的優(yōu)勢功能微生物菌群發(fā)生群聚，強化功能微生物對污染物的降解，從而使土著菌劑A對黑臭水體凈化效果較佳。

工程菌劑B中細(xì)菌群落多樣性及豐富度最高，與空白有一些差異但差異較小，提示工程菌劑B可能引入了少量新的微生物，由于工程菌劑B中的微生物對目標(biāo)黑臭水體的適應(yīng)性較差而未能在實驗期內(nèi)大量增長，也就未能發(fā)揮較強的凈化作用，所以其凈化效率不如土著菌劑A。

由表3中Coverage指數(shù)可知，3個實驗組樣品的覆蓋率差異不大，覆蓋率均在97%以上，說明本次測序深度足夠反映樣品中真菌的真實情況。由Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)可知，真菌群落豐富度表現(xiàn)為空白>工程菌劑B>土著菌劑A。由Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知，土著菌劑A與工程菌劑B的真菌群落多樣性相似且高于空白。這說明兩種菌劑處理下真菌群落多樣性均有一定提高。土著菌劑A對黑臭水體的凈化效率顯著高于工程菌劑B，這說明后者的真菌微生物由于對目標(biāo)黑臭水體的適應(yīng)性較差未發(fā)生較強的凈化作用。

表3 真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Fungus Alpha diversity index

綜上所述，土著菌劑A可使具有污染物降解特性的優(yōu)勢功能微生物群落發(fā)生群聚，強化功能微生物對污染物的降解作用；工程菌劑B可使細(xì)菌群落多樣性及豐富度提高，但由于對目標(biāo)黑臭水體的適應(yīng)性較差而細(xì)菌未能大量增長。土著菌劑A、工程菌劑B均可使真菌多樣性提高，但前者由于對目標(biāo)黑臭水體具有較強的適應(yīng)性而有較高的凈化效率。

2.2.2 不同菌劑對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步理解各實驗組對黑臭水體凈化效果產(chǎn)生差異的原因，從門水平及屬水平分析各實驗組的微生物群落結(jié)構(gòu)。

細(xì)菌在門水平上的相對豐度見圖3(a)。工程菌劑B中優(yōu)勢物種為變形菌門(62.66%)、厚壁菌門(16.24%)、放線菌門(10.29%)、擬桿菌門(6.29%)；土著菌劑A中優(yōu)勢物種為變形菌門(68.94%)、厚壁菌門(14.56%)、擬桿菌門(7.58%)、放線菌門(7.09%)；這些微生物已被認(rèn)定為污水處理系統(tǒng)中常見的優(yōu)勢物種[11-13]，在污水處理中發(fā)揮著重要作用。與工程菌劑B相比，土著菌劑A中的變形菌門、擬桿菌門相對豐度均有所提高。變形菌門具有脫氮除磷降解有機(jī)物的能力[14]；擬桿菌門在產(chǎn)酸階段起重要作用，其所含的某些菌屬具備降解碳水化合物、COD的能力[15]。這可能是土著菌劑A凈化效果較好的原因之一。

真菌在門水平上的相對豐度見圖3(b)。工程菌劑B中優(yōu)勢物種為子囊菌門(68.83%)、擔(dān)子菌門(22.43%)、羅茲菌門(4.47%)、被孢霉菌門(4.22%)；土著菌劑A中優(yōu)勢物種為子囊菌門(66.90%)、擔(dān)子菌門(27.03%)、羅茲菌門(3.40%)、毛霉菌門(2.16%)；這些微生物已被認(rèn)定為污水處理中主要的真菌[16-17]。工程菌劑B與土著菌劑A中子囊菌門相對豐度均在66%以上。資料顯示，子囊菌門是真菌中最大的類群，其對纖維素及木質(zhì)素具有降解能力[18]；與工程菌劑B相比，土著菌劑A中擔(dān)子菌門相對豐度提高，其對復(fù)雜的碳水化合物的降解起著重要作用，可以通過酶促反應(yīng)來降解木質(zhì)素[19-20]；毛霉菌門為土著菌劑A獨有的優(yōu)勢物種，相對豐度達(dá)到2.16%，其具有較強的蛋白質(zhì)降解能力。這也可能是土著菌劑A對黑臭水體凈化效果較佳的原因。

圖3 門水平的優(yōu)勢物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of dominant microorganism in phylum level

細(xì)菌在屬水平上的相對豐度排名前20的物種見表4。工程菌劑B中優(yōu)勢菌屬為熱單胞菌、短波單胞菌、苯基桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、梭菌屬、Chryseomicrobium、unclassifiedRhodobacteraceae、氨基桿菌、白色桿菌、擬桿菌屬等；土著菌劑A中優(yōu)勢菌屬為寡養(yǎng)單胞菌、短波單胞菌、微小桿菌、谷氨酸桿菌、明串珠菌、unclassifiedRhodobacteraceae等。與工程菌劑B相比，土著菌劑A中寡養(yǎng)單胞菌相對豐度高出28.01百分點。資料顯示，寡養(yǎng)單胞菌為好氧菌，屬于變形菌門，可用于廢水處理及水體修復(fù)。呂志堂等[21]研究發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌具有較高的脫氮除磷效率。胡起靖等[22]從福州某印染廠污水處理池的活性污泥中篩選分離得到寡養(yǎng)單胞菌，其具有較強脫色能力，脫色效率最高可達(dá)95.70%；此外，短波單胞菌、微小桿菌、谷氨酸桿菌、明串珠菌在土著菌劑A中的相對豐度也明顯高于工程菌劑B。文獻(xiàn)顯示，短波單胞菌具備降解二甲雙胍和吸附鎘的能力；微小桿菌為兼性厭氧菌[23]，能在NaCl為0～12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的條件下生長，具有耐鹽性[24]，在高鹽度皮革廢水中，對COD的去除率高達(dá)90.00%[25]；谷氨酸桿菌對鄰苯二甲酸二丁酯的11 h降解率高達(dá)99.90%[26]；明串珠菌具備拮抗致病菌、高產(chǎn)酸及抗氧化能力。這些也是土著菌劑A對黑臭水體凈化效果較好的原因。

表4 屬水平的細(xì)菌相對豐度Table 4 Relative abundance of bacteria in genus level %

真菌在屬水平上的相對豐度排名前20的物種見表5。工程菌劑B中優(yōu)勢菌屬為Apiotrichum、unclassifiedAscomycota、曲霉菌、青霉菌、Wallemia、Arthrographis、unclassifiedMortierellales、支頂孢屬、unclassifiedRozellomycota、unclassifiedSordariomycetes、念珠菌等；土著菌劑A中優(yōu)勢菌屬為Apiotrichum、Wallemia、unclassifiedAscomycota、曲霉菌、青霉菌、念珠菌、unclassifiedSordariomycetes、unclassifiedPleosporales、Talaromyces、Acaulium等。與工程菌劑B相比，土著菌劑A中Apiotrichum、Wallemia、曲霉菌、念珠菌、unclassifiedSordariomycetes、Talaromyces、unclassifiedPleosporales相對豐度較高。Apiotrichum、unclassifiedPleosporales在污水處理中的作用機(jī)制尚未有資料報道，因此其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。據(jù)文獻(xiàn)報道，Wallemia是污水中常見的真菌[27]，具有耐鹽性；曲霉菌具備降解芳香族化合物、殺蟲劑、除草劑阿特拉津及COD的能力[28]；念珠菌具備降解有機(jī)物及降低橄欖油廠廢水毒性的能力[29]，在最適生長條件下，其對COD去除率可達(dá)84.10%[30]；Sordariomycetes可將 NO2還原為 N2O，促進(jìn)了氮的去除[31]；Talaromyces對污水具有較好的凈化作用，如FANG等[32]采用Talaromyces處理養(yǎng)豬廢水時，COD、TP、氨氮去除率分別可達(dá)52.1%、21.5%、18.6%。這些也可能是土著菌劑A對黑臭水體污染物凈化效果較佳的原因。

表5 屬水平的真菌相對豐度Table 5 Relative abundance of fungus in genus level %

目前對于污水處理過程中真菌作用的機(jī)制研究尚少，很多真菌的具體功能尚不清楚[33]。然而，大量研究表明，真菌在污水處理中表現(xiàn)出極大的多樣性，起著重要作用[34]。真菌在去除有毒化合物、提高脂質(zhì)積累、改善生物轉(zhuǎn)化[35-36]等方面具有重要作用，且其對重金屬的抗性作用強于細(xì)菌[37]。因此對于污水處理過程中真菌的作用機(jī)制的研究具有重要意義，未來應(yīng)擴(kuò)大并深入開展真菌相關(guān)的研究。

3 結(jié) 論

(1) 對目標(biāo)黑臭水體中氨氮、TP、COD的去除效果土著菌劑A優(yōu)于工程菌劑B。

(2) 土著菌劑A可使具有污染物降解特性的功能微生物菌群發(fā)生群聚，強化功能微生物對污染物的降解；工程菌劑B可使細(xì)菌群落多樣性及豐富度提高，但由于其對目標(biāo)黑臭水體的適應(yīng)性較差而凈化作用較弱。

(3) 不同菌劑處理下，微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。共有的優(yōu)勢物種相對豐度存在明顯差異；細(xì)菌和真菌優(yōu)勢菌屬及其相對豐度也不同。