circNCX1通過miR-103-3p調(diào)節(jié)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡*

法鴻鴿， 李萌陽， 常文光， 肖丹丹， 王建勛△

（青島大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，山東青島266021）

臨床上，阿霉素（adriamycin；又稱多柔比星，doxorubicin，DOX）作為一種高效的抗腫瘤藥物，被廣泛用于各種腫瘤的治療，例如乳腺癌，肺癌和卵巢癌等[1]。DOX 所引起的嚴(yán)重的心臟毒性備受關(guān)注，可表現(xiàn)為不可逆的擴(kuò)張型心肌病和隨之而來的充血性心力衰竭，這會影響腫瘤患者長期的、整體的抗腫瘤治療結(jié)果，也使得DOX 的臨床應(yīng)用受到限制[2]。因此，進(jìn)一步探究DOX 誘導(dǎo)心肌毒性的分子機(jī)制，尋找新的治療或干預(yù)靶點(diǎn)將為DOX 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，成熟后分裂和再生能力有限，現(xiàn)有研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是細(xì)胞水平DOX 誘導(dǎo)心肌毒性的主要原因[3-4]，但其分子機(jī)制尚未完全闡明。

非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）已被廣泛報(bào)道參與了細(xì)胞增殖、凋亡、分化和代謝等多種生物學(xué)過程，進(jìn)而在細(xì)胞生理和病理過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。許多研究報(bào)道了非編碼RNA 參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控[6-9]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有特殊結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，它是由外顯子和/或內(nèi)含子反向拼接形成的閉合環(huán)形RNA，沒有5"端帽或3"端poly-A 尾巴[10]。在功能上，環(huán)狀RNA 除了能與各種蛋白相互作用外，也具有競爭性結(jié)合微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的特性，從而抑制了miRNA 對其靶基因的作用[11-12]。此外，一小部分環(huán)狀RNA 仍具備翻譯蛋白的能力[13]。近年來，一些研究表明circRNA 與心血管的發(fā)育和疾病密切相關(guān)，例如circASXL1、circCAMSAP1 和circHIPK3 的表達(dá)水平升高與胎兒心臟發(fā)育有關(guān)，circHRCR 的下調(diào)誘導(dǎo)心臟肥大，circMFACR 的上調(diào)可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死[14-16]。此外，circ-Pan3 和circITCH 也在近期被證明參與調(diào)控DOX 誘導(dǎo)的心肌毒性[17-18]。盡管關(guān)于環(huán)狀RNA 的研究仍處于早期階段，但由于其穩(wěn)定的表達(dá)和組織特異性適合用作治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)記物從而引起了人們的關(guān)注。環(huán)狀RNA 在DOX 誘導(dǎo)的心肌毒性中的作用也值得進(jìn)一步探究。

我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，在心臟中高表達(dá)的環(huán)狀RNA NCX1（circNCX1）在缺血性心肌損傷過程中以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[19]。circNCX1 由細(xì)胞凋亡應(yīng)激誘導(dǎo)，并通過靶向miR-133a-3p促進(jìn)凋亡，而沉默circNCX1在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均能改善心功能并抑制心肌細(xì)胞凋亡[19]。但是其在DOX 誘導(dǎo)的心肌毒性中是否有變化還未見報(bào)道，本研究旨在探討circNCX1 在DOX 誘導(dǎo)的心肌毒性中的作用，以及其下游的作用靶點(diǎn)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

8 周齡的C57BL/6J 雄性小鼠[許可證號：SCXK（魯）2019-0003]被隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組小鼠注射劑量為10 mg/kg 的DOX，每周2 次，共1 周（累計(jì)劑量為20 mg/kg）；對照組小鼠注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。最后一次注射后1 周取小鼠心臟組織進(jìn)行相關(guān)分析。所有動物實(shí)驗(yàn)均得到青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物護(hù)理委員會和使用委員會的批準(zhǔn)。

2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

心肌H9c2 細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究院。DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自上海依科賽生物技術(shù)有限公司；DOX 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；miR-103 mimic 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 購自Invitrogen；Trizol 試劑購自Sigma；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑購自南京諾唯贊；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣；caspase-3/-7 活性檢測試劑盒購自大連美侖；臺盼藍(lán)染料購自北京索萊寶；鏈霉親和素磁珠購自無錫百邁格；生物素探針由華大基因根據(jù)設(shè)計(jì)合成；所用引物由上海生工和北京擎科生物公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 H9c2 細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素。細(xì)胞放置于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。使用2 μmol/L或者0.2 μmol/L的DOX對細(xì)胞進(jìn)行處理。

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 如先前研究[19]所述合成了以pcDNA3.1 為載體的circNCX1 過表達(dá)質(zhì)粒，以及shcircNCX1（序列為5"-AATAGTGTTGGAACAATTGGA-3"），陰性對照序列為5"-ACTACCGTTGTTATAGGTG-3"。miR-103-3p mimic 序 列 為5"-AGCAGCAU UGUACAGGGCUAUGA-3"，陰性對照序列為5"-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3"。依據(jù)試劑的說明，使 用Lipofectamine 3000 進(jìn) 行質(zhì) 粒、sh-circNCX1 和miR-103-3p mimic的轉(zhuǎn)染。

3.3 RT-qPCR 使用Trizol 試劑提取組織和細(xì)胞的總RNA，然后根據(jù)說明使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-103-3p莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄的引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATAG-3′。將cDNA 在CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系 統(tǒng) 進(jìn) 行 檢 測，使 用2-ΔΔCt公 式 計(jì) 算 數(shù) 據(jù)。circNCX1 的表達(dá)量以GAPDH 為內(nèi)參照，miR-103-3p的表達(dá)量以U6為內(nèi)參照，相應(yīng)的引物序列見表1。

3.4 RNA 成環(huán)驗(yàn)證 將細(xì)胞中的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)提取細(xì)胞的gDNA。分別用正向引物和反向引物將兩組樣本進(jìn)行普通PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對向引物序列為F：5′-GACTGTGTCCAACCTGACCTTGATG-3′，R：5′-CACCTCCATGATGCCAATGCTCTC-3′；反向引物序列為F：5′-GAGAGCATTGGCATCATGGAGGTG-3′，R：5′-CATCAAGGTCAGGTTGGACACAGTC-3′。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

3.5 TUNEL 染色 細(xì)胞接種在1 cm×1 cm 的玻片上并置于24 孔板中，經(jīng)過相應(yīng)處理后的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3 遍，然后加4%多聚甲醛固定。根據(jù)制造商的說明，使用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，然后將細(xì)胞放置于含DAPI 染液的介質(zhì)固定。置于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。通過計(jì)算TUNEL 陽性細(xì)胞核數(shù)量占DAPI 染色核數(shù)量的比例，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)的百分比。

3.6 Caspase-3/-7 活性的檢測 收集處理后的細(xì)胞，然后根據(jù)說明，使用caspase-3/-7活性檢測試劑盒對樣本進(jìn)行caspase-3/-7活性的測定。

3.7 臺盼藍(lán)染色 收集處理后的貼壁細(xì)胞，然后根據(jù)說明，使用臺盼藍(lán)染料染色。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板于顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算一個(gè)視野中臺盼藍(lán)染色陽性的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

3.8 RNA pull-down 實(shí)驗(yàn) 用1%無RNA 酶的BSA和0.5 g/L酵母tRNA預(yù)處理鏈霉親和素磁珠，4℃翻轉(zhuǎn)3 h。分別將circNCX1 的生物素探針5"-bio-GAGACTTCCAATTGTTCCAACACTATTTCATCATTC-3" 和對照探針5"-bio-TGATGTCTAGCGCTTGGGCTTTG-3"與磁珠混合孵育，4℃翻轉(zhuǎn)3 h。細(xì)胞經(jīng)PBS 清洗后，用制備的冰浴裂解液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），200 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，6×104U/L RNA 酶抑制劑，1 mmol/L DTT，蛋白酶抑制劑]750 μL 將細(xì)胞刮下來，4℃翻轉(zhuǎn)裂解3 h，然后1 000×g、4℃離心5 min。取上清中的50 μL作為input，剩余的上清分成兩管，然后4℃翻轉(zhuǎn)3 h 使裂解物和探針-磁珠復(fù)合物結(jié)合。使用冰浴的高鹽緩沖液[0.1%SDS，1% TritionX-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），500 mmol/L NaCl]洗滌3次，低鹽緩沖液（0.1% SDS，1% Trition X-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl]洗滌1 次。然后用Trizol 提取磁珠與RNA 的復(fù)合物，通過RT-qPCR檢測miR-103-3p的表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間數(shù)據(jù)運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；多組均數(shù)間的比較運(yùn)用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間的兩兩比較運(yùn)用Tukey"s 事后檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 DOX能夠誘導(dǎo)circNCX1的表達(dá)上調(diào)

首先，分別使用circNCX1 的對向引物和反向引物對H9c2 細(xì)胞的cDNA 和gDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳的條帶顯示對向引物能夠同時(shí)擴(kuò)增cDNA和gDNA，而反向引物只能擴(kuò)增cDNA，表明circNCX1是反向拼接形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1A）。為檢測circNCX1 表達(dá) 量 的 變 化，使 用2 μmol/LDOX 處 理H9c2 細(xì)胞相應(yīng)的時(shí)間（0、3、6、12 和24 h），RT-qPCR結(jié)果顯示，circNCX1在DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中呈時(shí)間依賴性上升（P＜0.05），見圖1B。此外，相比于對照組，注射DOX 的小鼠心肌組織中circNCX1 的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），見圖1C。因此，在DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞和心臟組織中circNCX1表達(dá)上調(diào)。

2 沉默circNCX1 可降低DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率

之前研究表明，circNCX1 在心肌氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用。因此，我們推測在DOX 作用心肌的過程中，circNCX1可能發(fā)揮相似的作用。為證明這一推測，我們首先使用特異性靶向circNCX1 連接區(qū)域的shRNA（sh-circNCX1）來沉默circNCX1在H9c2細(xì)胞中的表達(dá)（圖2A）。接下來，使用2 μmol/L 的DOX 誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)染過sh-circNCX1的H9c2 細(xì)胞24 h。TUNEL 染色的結(jié)果表明，沉默circNCX1能夠明顯減少DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡（圖2C）。此外，凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3/-7 活性的檢測結(jié)果同樣顯示，沉默circNCX1顯著抑制了DOX 引起的caspase-3/-7 活性增強(qiáng)（圖2D）。相反的，使用低DOX（0.2 μmol/L）誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)染過circNCX1 過表達(dá)質(zhì)粒的H9c2 細(xì)胞24 h。臺盼藍(lán)染色顯示，過表達(dá)circNCX1（圖2B）進(jìn)一步增加了低濃度DOX 處理下的細(xì)胞死亡率（圖2E）。以上結(jié)果顯示，circNCX1促進(jìn)了DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而沉默circNCX1可以有效抑制心肌細(xì)胞凋亡。

Figure 1. circNCX1 was up-regulated in DOX-treated H9c2 cells and mouse hearts. A：circNCX1 was a back-splicing formed loop in structure；B：the circNCX1 levels in H9c2 cells under 2 μmol/L DOX treatment with indicated times；C：the circNCX1 levels was increased in DOX-treated mouse heart tissues. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 h group；#P＜0.05 vs control group.圖1 DOX誘導(dǎo)circNCX1的表達(dá)上調(diào)

3 circNCX1與miR-103-3p相互作用

據(jù)報(bào)道，由外顯子形成的circRNA 可以充當(dāng)miRNA 的海綿，以抑制其在細(xì)胞質(zhì)中的活性[20]。在先前的一篇報(bào)道中，作者通過miRNA 微陣列分析篩選了可能與circNCX1 結(jié)合的752 個(gè)miRNA[21]。在此基礎(chǔ)上，我們運(yùn)用了生物信息學(xué)軟件，預(yù)測出了circNCX1 與miR-103-3p 的3 個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)（圖3A），表明circNCX1 與miR-103-3p 之間可能存在直接的相互作用。為了驗(yàn)證這一預(yù)測，我們進(jìn)行了RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)，觀察到與陰性對照相比，circNCX1 的生物素探針能夠富集更多的miR-103-3p（圖3B）。此外，我們過表達(dá)circNCX1，檢測到miR-103-3p 的表達(dá)量下調(diào)，而沉默circNCX1 則促進(jìn)了miR-103-3p 的表達(dá)（圖3C、D）。以上實(shí)驗(yàn)說明，circNCX1 能夠直接結(jié)合miR-103-3p，并且抑制其表達(dá)。

4 miR-103-3p過表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡

DOX誘導(dǎo)的小鼠的心臟組織中miR-103-3p的表達(dá)下調(diào)（圖4A）。我們同樣使用2 μmol/LDOX 處理H9c2 相應(yīng)的時(shí)間，RT-qPCR 結(jié)果顯示，miR-103-3p的表達(dá)隨時(shí)間延長而梯度下降（圖4B），因此，我們推測miR-103-3p 在DOX 作用心肌過程中發(fā)揮保護(hù)作用。在有效的過表達(dá)miR-103-3p 的基礎(chǔ)上（圖4C），我們分別檢測了caspase-3/-7 的活性和細(xì)胞死亡數(shù)（臺盼藍(lán)染色）。結(jié)果顯示，在DOX 誘導(dǎo)下，過表達(dá)miR-103-3p 能顯著抑制caspase-3/-7 的活性，并且減少細(xì)胞死亡（圖4D、E）。此外，在使用低濃度DOX（0.2 μmol/L）誘導(dǎo)H9c2 時(shí)，共轉(zhuǎn)染circNCX1 過表達(dá)質(zhì)粒和miR-103-3p mimic 組心肌細(xì)胞凋亡率明顯較過表達(dá)circNCX1 組細(xì)胞凋亡率減少（圖4F）。這些結(jié)果說明，miR-103-3p 具有抗DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用，且作用與circNCX1的交互作用有關(guān)。

討論

隨著RNA 測序技術(shù)的發(fā)展，環(huán)狀RNA 得到廣泛鑒定，此外，大量研究證實(shí)了環(huán)狀RNA 的基因調(diào)控功能[22-23]。迄今為止，已報(bào)道了環(huán)狀RNA 參與心血管發(fā)育和疾病。這些circRNA 中的某些在心臟?。òㄐ牧λソ撸呐K梗塞和心臟肥大等）中表現(xiàn)出異常的表達(dá)和調(diào)節(jié)活性，這些發(fā)現(xiàn)為指導(dǎo)疾病治療和診斷提供新策略[11，24-26]。作為環(huán)狀RNA 最主要的功能之一，其可以充當(dāng)miRNA 海綿，與miRNA 目標(biāo)位點(diǎn)競爭結(jié)合，以抑制miRNA 活性并參與miRNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。例如最先報(bào)道這一功能的circRNA CDR1as/ciRS-7，它具有63 個(gè)保守的miR-7 結(jié)合位點(diǎn)，能通過結(jié)合miR-7調(diào)節(jié)大腦發(fā)育[12，22]。

Figure 2. Knock-down of circNCX1 attenuated DOX-induced apoptosis of the H9c2 cells. The expression level of circNCX1 in the H9c2 cells transfected with sh_circNCX1 vector（A）and the circNCX1 expression vector（B）were detected；C：apoptosis was tested by the TUNEL assay（green：TUNEL-positive nuclei；blue：DAPI-stained nuclei；scale bar=20 μm）；D：the activity of caspase-3/-7 was tested；E：the percentage of cell death was quantitatively analyzed. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs scrambled control group；△P＜0.05 vs empty vector group；#P＜0.05 vs DOX group.圖2 敲減circNCX1表達(dá)抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

Figure 3. circNCX1 interacted with miR-103-3p. A：putative binding sites of circNCX1 and miR-103-3p；B：the relevant enrichment of pulled-down miR-103-3p levels by circNCX1 probe or control probe. The expression levels of miR-103-3p with transfection of the circNCX1 expression vector（C）and the sh_circNCX1 vector（D）were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs biotin-random group；△P＜0.05 vs empty vector group；#P＜0.05 vs scrambled control group.圖3 circNCX1與miR-103-3p相互作用的驗(yàn)證

circNCX1是從Ncx1基因的第2個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄的環(huán)狀RNA，它在心臟中大量表達(dá)，并在心肌病中顯示出顯著的差異表達(dá)水平。RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，circNCX1 在DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞和小鼠心肌組織中表達(dá)上升，提示circNCX1 可能參與調(diào)控DOX 誘導(dǎo)的心肌毒性。接下來的功能實(shí)驗(yàn)顯示，沉默circNCX1可以減少DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡。相反，過表達(dá)circNCX1 增加了DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡數(shù)。這些結(jié)果說明circNCX1 促進(jìn)DOX 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。生物信息學(xué)預(yù)測了circNCX1 與miR-103-3p 存在結(jié)合3 個(gè)位點(diǎn)。RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)證明了circNCX1 能夠明顯的富集H9c2 細(xì)胞中的miR-103-3p。

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了miR-103-3p對細(xì)胞凋亡具有重要作用。脂多糖誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模擬脊髓損傷的病理過程中，miR-103-3p 過表達(dá)顯著提高了細(xì)胞活力，減少了細(xì)胞凋亡和自噬[27]。在阿爾茨海默病中，circ_0000950 通過對miR-103-3p 的海綿作用，抑制了miR-103-3p的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[28]。此外，miR-103-3p 可以減輕肝臟損傷，包括組織損傷和線粒體損傷，抑制炎癥因子的分泌，并減少了肝細(xì)胞的凋亡[29]。在心血管系統(tǒng)中，miR-103-3p 也參與了心臟疾病的調(diào)節(jié)。在氧化應(yīng)激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，過表達(dá)miR-103-3p 通過介導(dǎo)BNIP3 的下調(diào)抑制活性氧簇的產(chǎn)生，起到細(xì)胞保護(hù)作用[30]。miR-103-3p 可以通過抑制壓力超負(fù)荷大鼠心臟中的TRPV3 信號傳導(dǎo)來降低心肌細(xì)胞自噬活性，從而部分減輕心肌肥大[31]。然而，在心肌壞死的機(jī)制研究中，miR-103-3p 可以通過靶向FADD 促進(jìn)H9c2細(xì)胞的RIPK1和RIPK3依賴性壞死[32]。在本研究中，我們證明了在DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞中，miR-103-3p 的表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下降，而過表達(dá)miR-103-3p 能夠抑制DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡，并且miR-103-3p是作為circNCX1的下游發(fā)揮功能的。然而，在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷中，miR-103-3p的下游靶標(biāo)仍不清楚，其具體的作用機(jī)制將是我們下一步研究的方向。此外，miR-103-3p 在心肌細(xì)胞中所表現(xiàn)出的保護(hù)作用和促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用仍沒有一致的結(jié)論，這可能是因?yàn)閙iR-103-3p 參與了不同信號通路的調(diào)節(jié)，因此值得我們進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究表明circNCX1 在DOX 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞和小鼠的心肌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。沉默circNCX1可通過調(diào)節(jié)與其直接結(jié)合的miR-103-3p發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

Figure 4. circNCX1 increased the apoptosis of H9c2 cells by inhibiting miR-103-3p. A：the miR-103-3p level was decreased in DOX-treated mouse heart tissues（n=5）；B：the miR-103-3p level in the H9c2 cells under 2 μmol/L DOX treatment for indicated time（n=3）；C：the expression level of miR-103-3p in H9c2 cells with transfection of miR-103-3p mimic（n=3）；D：the activity of caspase-3/-7 was tested（n=3）；E，F(xiàn)：the percentage of cell death was quantitative analyzed（n=3）.Mean±SD. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs 0 h group；#P＜0.05 vs negative control group；@P＜0.05 vs DOX（2 μmol/L）+negative control group；^P＜0.05 vs DOX（0.2 μmol/L）group；&P＜0.05 vs DOX（0.2 μmol/L）+negative control+circNCX1 group.圖4 circNCX1靶向miR-103-3p，進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡