五味子哮喘湯對哮喘小鼠SIRT1/Akt信號通路及肺功能的影響*

孫 毅， 任亞平， 孔 喬， 陳 輝△

（1滕州市中心人民醫(yī)院藥劑科，山東滕州277599；2北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)科，北京100029）

支氣管哮喘簡稱哮喘，是一種常見呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，患者主要表現(xiàn)為咳嗽、喘息和氣促等癥狀，若不及時干預(yù)，可引起肺氣腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，目前傳統(tǒng)治療藥物仍不能有效控制重度哮喘患者癥狀，因此尋找治療哮喘的新型藥物至關(guān)重要[1]。近來研究顯示，中醫(yī)藥在治療哮喘中逐漸彰顯出獨(dú)特優(yōu)勢[2-4]。五味子哮喘湯（Schisandrae-asthma decoction，SAD）涉及五味子、麻黃（蜜炙）、干姜等十四味中藥，為本院正常使用的中藥飲片，產(chǎn)地地道，療效確切，毒副作用小，價(jià)格低廉，使用安全。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（silent information regulation 2 homolog-1，SIRT1）是一種煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的脫乙酰酶，廣泛存在于動物細(xì)胞中，與細(xì)胞周期控制、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)；有研究顯示，SIRT1 可作為一種抗炎因子，在哮喘炎癥進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[5-6]。SIRT1 過表達(dá)可引起蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）磷酸化水平升高，與細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激等有關(guān)[7]。因此，本項(xiàng)工作擬探討五味子哮喘湯對哮喘小鼠肺功能及SIRT1/Akt 信號通路的影響，以期揭示其作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

120 只6 周齡清潔級雌性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0002。于本院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，室溫（23±1）℃，空氣濕度50%～60%，黑暗光照交替時間12 h，自由飲水、采食。本研究經(jīng)過本院動物倫理委員會批準(zhǔn)通過。

2 藥物、試劑及儀器

五味子哮喘湯配方：五味子6 g，麻黃（蜜炙）12 g，干姜6 g，款冬花（蜜炙）12 g，紫菀（蜜炙）12 g，膽南星6 g，地龍10 g，金銀花12 g，蘆根12 g，竹茹10 g，射干10 g，茯苓10 g，西洋參6 g，甘草6 g。藥液制備：將中藥加水浸泡40 min，煎煮兩次，第1 次煎沸后再煎30 min，過濾；第2 次煎沸后再煎20 min，過濾（亦可用自動煎藥機(jī)設(shè)定時間一次煎出藥液）。合并兩次煎液濃縮至400 mL 即得。生理鹽水配制濃度為1 kg/L，備用。地塞米松（dexamethasone，Dex；貨號：50-02-2）購自上海一飛生物科技有限公司；Trizol（貨號：R0016）購自上海碧云天公司；PrimeScript ?RT reagent Kit（Perfect Real Time）和TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）均購自TaKaRa（貨號：RR037A 和RR820A）；兔源Ⅰ抗[抗SIRT1 抗體（貨號：ab32441）、抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（貨號：ab32089）、抗 磷 酸 化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗體（貨號：ab191606）、抗Akt 抗體（貨號：ab32505）、抗磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗體（貨號：ab38449）和抗GAPDH 抗體（貨號：ab9485）]和Ⅱ抗羊抗兔IgG（貨號：ab6721）均購自Abcam；WooⅠ型超聲霧化吸入器購自上海塔望智能科技有限公司；Evolution 220 紫外分光光度計(jì)、ABI 7500 RT-qPCR 儀和FC 型酶標(biāo)儀均購自Thermo。

3 方法

3.1 分組、模型制備及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為對照（control）組、模型（model）組、陽性對照Dex 組、低劑量SAD（low-dose SAD）組、中劑量SAD（middle-dose SAD）組和高劑量SAD（high-dose SAD）組，每組20 只，其中10 只用于檢測肺功能，另10 只取肺組織進(jìn)行病理學(xué)觀察、mRNA 及蛋白檢測。參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建動物模型，除control 組外其余5 組于實(shí)驗(yàn)第1 和8 天皮下注射10 mg 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）+200 mg 氫氧化鋁[Al（OH）3]混合液，于第15天霧化吸入2%OVA 磷酸鹽緩沖液進(jìn)行過敏激發(fā)，每天1 次，每次30 min，持續(xù)1 周。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠煩躁不安，弓背，呼吸加深、加快，嚴(yán)重者甚至伸頸、喘息狀、大小便失禁等。對control 組予以等量生理鹽水注射及霧化吸入。于第16 天給藥處理：Dex 組灌胃Dex（10 mg/kg）；參考文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（中劑量為70 kg 成人每日服用藥物劑量與小鼠表面積換算比值），確定low-dose SAD 組、middle-dose SAD 組和high-dose SAD 組分別予以8.5 g/kg（8.5 mL/kg）、17 g/kg（17 mL/kg）和34 g/kg（34 mL/kg）SAD 灌胃；control 組和model 組灌胃等量雙蒸水，均每天1次，連續(xù)7 d。

3.2 肺功能儀檢測小鼠肺功能變化 末次給藥后24 h，以2%戊巴比妥納0.2 mL 腹腔麻醉各組小鼠，每組取10 只進(jìn)行肺功能檢測，將小鼠氣管切開，置入氣管插管并固定，按要求連接肺功能儀，記錄小鼠0.1 s 用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.1 s，F(xiàn)EV0.1）及最高呼氣流速（peak expiratory flow rate，PEFR）等指標(biāo)。

3.3 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化 小鼠麻醉處死后，取左肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后以0.4 mm 切片，脫蠟、水化后進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

3.4 RT-qPCR 檢 測 肺 組 織SIRT1、PI3K 和Akt 的mRNA 表達(dá)水平 Trizol 法提取各組小鼠部分右肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肦T-qPCR 擴(kuò)增SIRT1、PI3K及Akt mRNA 片段。反應(yīng)體系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA（50 μmol/L）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，61℃34 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法定量分析肺組織SIRT1、PI3K 及Akt 的mRNA 相對表達(dá)水平。所用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 Western blot 檢測肺組織SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白水平 采用Western blot 檢測小鼠肺組織SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt 及p-Akt 蛋白水平。蛋白提取試劑盒提取各組小鼠肺組織總蛋白；BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；進(jìn)行SDS-PAGE 分離，并轉(zhuǎn)膜、封閉，分別添加SIRT1（1∶2 000）、PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶500）、p-Akt（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜，添加Ⅱ抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫避光孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)法顯影，蛋白條帶灰度值用ImageJ軟件分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 五味子哮喘湯對小鼠肺功能的影響

與control 組比較，model 組小鼠肺功能指標(biāo)FEV0.1 和PEFR 水 平 均顯 著 降 低（P＜0.05）；與model 組比較，Dex 組、low-dose SAD 組、middle-dose SAD 組和high-dose SAD 組小鼠肺功能指標(biāo)FEV0.1和PEFR水平均顯著增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effect of Schisandrae-asthma decoction （SAD） on lung function in mice. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖1 五味子哮喘湯對小鼠肺功能的影響

2 五味子哮喘湯對小鼠肺組織病變的影響

HE 染色結(jié)果顯示，control組小鼠肺泡組織形態(tài)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤；model 組小鼠肺壁增厚，肺組織周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；Dex 組、low-dose SAD 組、middle-dose SAD 組和high-dose SAD 組小鼠肺組織病變呈不同程度減輕，見圖2。

Figure 2. Effect of Schisandrae-asthma decoction （SAD） on lung lesions in mice（HE staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：Dex group；D：low-dose SAD group；E：middle-dose SAD group；F：high-dose SAD group.圖2 五味子哮喘湯對小鼠肺組織病變的影響

3 五味子哮喘湯對小鼠肺組織SIRT1、PI3K 和Akt mRNA表達(dá)的影響

與control 組比較，model 組小鼠肺組織SIRT1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與model 組比較，Dex 組、low-dose SAD 組、middle-dose SAD 組和high-dose SAD 組小鼠肺組織SIRT1 mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），而PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. Effect of Schisandra-asthma decoction （SAD） on mRNA expression of SIRT1，PI3K and Akt in lung tissue of mice. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖3 五味子哮喘湯對小鼠肺組織SIRT1、PI3K 和Akt mRNA表達(dá)的影響

4 五味子哮喘湯對小鼠肺組織SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平的影響

與control 組比較，model 組小鼠肺組織SIRT1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與model 組比較，Dex 組、low-dose SAD 組、middle-dose SAD 組和high-dose SAD 組小鼠肺組織SIRT1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Effect of Schisandra-asthma decoction（SAD）on protein levels of SIRT1，PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt in lung tissue of mice. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖4 五味子哮喘湯對小鼠肺組織SIRT1、PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)的影響

討論

本研究采用OVA 配合免疫佐劑Al（OH）3制備哮喘模型，結(jié)果顯示，與control組比較，model組小鼠肺功能指標(biāo)FEV0.1 和PEFR 均顯著降低，肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，與M?kinen 等[10]和Song 等[11]的結(jié)果一致，提示哮喘模型小鼠制備成功。五味子哮喘湯由五味子、麻黃、干姜、款冬花、紫菀等十四味中藥組成，其中主藥五味子具有斂肺、滋腎、收汗、治肺虛咳喘、益氣強(qiáng)陰之功效[12-13]；麻黃可疏解肌表、發(fā)汗，還能化痰止咳、滋陰斂肺、運(yùn)水祛濕，常用于傷風(fēng)感冒、咳嗽氣喘、風(fēng)濕痹痛及陰疽、咳痰等病癥[14]；干姜則有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲之功效；款冬花、紫菀和膽南星具有潤肺下氣、清熱化痰止咳之功效[15]。有研究報(bào)道，五味子及其衍生物對哮喘具有較好的治療效果，但其具體作用機(jī)制尚不完全明了[16]。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠經(jīng)五味子哮喘湯治療后，肺功能及肺組織病理病變改善顯著，且高劑量治療效果優(yōu)于陽性藥物地塞米松，提示五味子哮喘湯可改善哮喘小鼠肺功能，對哮喘具有一定治療作用，其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

哮喘以氣道重塑及慢性炎癥為主要病理特征，其中氣道平滑肌過度增殖及凋亡不足是引起氣管重塑、難治性哮喘的重要原因[17]。SIRT1可通過調(diào)控核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及PI3K/Akt 通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖凋亡過程，在哮喘中亦發(fā)揮重要作用[18-21]。劉楠等[22]的研究表明，SIRT1可通過Akt通路調(diào)節(jié)IL-6水平，影響哮喘患者肺功能。Akt磷酸化是PI3K/Akt通路發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵因子，在肺部生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，五味子哮喘湯增加SIRT1 mRNA 及蛋白表達(dá)，降 低PI3K 和Akt mRNA 及p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt蛋白水平，與孟芝等[23]的研究結(jié)果一致，提示五味子哮喘湯可能通過SIRT1/Akt 信號通路，提高FEV0.1和PEFR水平，從而改善肺功能。

綜上所述，五味子哮喘湯可改善哮喘小鼠肺功能，減輕哮喘癥狀，可能與調(diào)控SIRT1/Akt 信號通路有關(guān)。但其具體機(jī)制及下游調(diào)控炎癥信號通路還是其他信號通路，有待進(jìn)一步深入探究。