右美托咪定通過(guò)α2AR介導(dǎo)的ERK1/2減輕急性肺損傷大鼠肺水腫*

夏明珠， 王 琦， 黃 志， 樂(lè) 琴， 姜遠(yuǎn)旭△

[1深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)羅湖區(qū)人民醫(yī)院，2深圳市人民醫(yī)院（南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院）麻醉科，3深圳市麻醉醫(yī)學(xué)工程技術(shù)中心，廣東深圳518020]

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘 迫 綜 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的早期形式，肺水腫是ALI 最重要的特征[1]。肺水腫導(dǎo)致的頑固性低氧血癥，常危及患者生命。盡管過(guò)去對(duì)ALI 的治療作了多種探索，但只有小潮氣量肺保護(hù)性通氣及俯臥位通氣收到了比較明確的效果[2]，藥物治療尚未取得突破。因ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，雖然在某些方面取得了進(jìn)展，但ALI 臨床死亡率仍然高達(dá)30%～40%[2]，給家庭社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋求有效減輕肺水腫的治療藥物尤為重要。

右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種高選擇 性α2腎 上腺素 能受體（α2adrenergic receptors，α2AR）激動(dòng)劑，具有良好的鎮(zhèn)靜作用[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Dex 可抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥細(xì)胞因子而發(fā)揮抗炎作用[4-6]，且能減輕不同致病因素所致的ALI 肺水腫[7-8]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)Dex 減輕肺水腫的作用與上調(diào)水通道蛋白（aquaporin，AQP）有關(guān)[9]。研究表明，肺泡內(nèi)水的清除不但與AQP 有關(guān)、更與肺泡上皮細(xì)胞鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[10]，其中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+-ATPase）在鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)及肺泡液體轉(zhuǎn)運(yùn)中扮演重要角色[11-12]。那么，Dex 減輕肺水腫的作用是否與Na+/K+-ATPase 的表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制又如何，尚不清楚。因此，本研究致力于觀察Dex 是否通過(guò)上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達(dá)而減輕脂多糖誘導(dǎo)的ALI 相關(guān)肺水腫，同時(shí)進(jìn)一步探究其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)Wistar 大鼠24 只，4～6 周齡，體重180～220 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2019-0035。所有大鼠均在恒溫（25℃），恒濕（50%）條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)歷至少1個(gè)晝夜循環(huán)，且禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物和試劑 細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；Escherichia coli055：B5）購(gòu)自Sigma；右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司）；測(cè)定TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 的ELISA 試劑盒以及測(cè)定丙二醛（malonaldehyde，MDA）的和髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；抗α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激 酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）抗體（Abcam）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗（CST）；抗β-actin抗體（Santa Cruz）。

2 方法

2.1 模型建立和分組 24 只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水（normal saline，NS）對(duì)照組、急性肺損傷模型組（LPS 組）、右美托咪定治療組（LPS+Dex 組）和α2AR抑制劑育亨賓（yohimbine，YHB）和右美托咪定合用治療組（LPS+Dex+YHB 組）。LPS組大鼠經(jīng)腹腔注射LPS（20 mg/kg）誘導(dǎo)ALI模型；LPS+Dex組大鼠于LPS注射后即刻腹腔注射Dex 100 μg/kg 進(jìn)行干預(yù)；LPS+Dex+YHB 組大鼠腹腔注射0.1 mg/kg YHB，30 min后注射LPS 和Dex；以腹腔注射N(xiāo)S 作為對(duì)照。干預(yù)完成后8 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉大鼠，頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。

2.2 肺組織病理學(xué)檢查 取部分肺組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋及切片，HE 染色。采用半定量評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)肺損傷，包括肺泡充血、肺泡出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡壁厚度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為無(wú)損傷，1 分為輕度損傷（25%），2 分為中度損傷（50%），3 分為重度損傷（75%），4 分為極重度損傷（100%）。各項(xiàng)評(píng)定分?jǐn)?shù)相加為肺損傷總評(píng)分。

2.3 動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）的檢測(cè) 大鼠處死前，用肝素注射器經(jīng)頸動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血0.5 mL 進(jìn)行血?dú)夥治觯瑴y(cè)PaO2，依據(jù)吸入氧濃度計(jì)算PaO2/FiO2。

2.4 肺指數(shù)及肺組織濕/干重比（W/D）的測(cè)定 大鼠處死后，立即剖胸，取出全肺，稱(chēng)重。以全肺濕重除以體重得出的數(shù)值為肺指數(shù)。取出右肺上葉，精確稱(chēng)重后（濕重），置75 ℃恒溫烤箱中，烘烤24 h 至恒重后稱(chēng)重（干重），計(jì)算W/D 值。

2.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的獲取及其中TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 濃度的檢測(cè) 大鼠處死后，立即剖胸，暴露心肺，分離左右主支氣管，結(jié)扎右支氣管。自制導(dǎo)管插入主支氣管。然后，將2 mL 冷磷酸鹽緩沖生理鹽水注入左肺，并來(lái)回抽取3 次。收取支氣管肺泡灌洗液，采用ELISA 法測(cè)定TNF-α、IL-β、IL-6 和IL-10 濃度，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

2.6 肺組織中MDA 濃度及MPO 活性的檢測(cè) 取肺組織100 mg解凍，制備肺組織勻漿用于測(cè)定MDA 濃度和MPO活性，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

2.7 Western blot 檢測(cè)肺組織α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 和p-ERK1/2 的蛋白水平 分別取適量的肺組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿，離心收取上清液，提取總蛋白并定量。應(yīng)用10% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。脫脂奶粉溶液封閉1.5 h；洗 膜 后 加 入 抗α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase、p-ERK1/2 和β-actin 抗體，4℃孵育過(guò)夜；洗膜后加入Ⅱ抗，室溫下孵育2 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，自顯影。采用圖像分析處理系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶掃描分析，測(cè)得的目的蛋白吸光度值與β-actin吸光度值的比值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析（one-way AONVA）和SNK-q檢驗(yàn)，ALI 評(píng)分采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 肺組織病理學(xué)檢查

肺組織HE 染色顯示，NS 對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；LPS 組肺組織間隔增厚，肺血管充血，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Dex 治療組肺組織病理變化減輕，見(jiàn)圖1A。肺損傷分?jǐn)?shù)比較顯示，與NS 組相比，LPS組肺損傷分?jǐn)?shù)升高（P＜0.01）；Dex 治療組肺損傷分?jǐn)?shù)低于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用，肺損傷分?jǐn)?shù)升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

2 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2的變化

與NS對(duì)照組相比，LPS組PaO2及PaO2/FiO2降低（P＜0.01）；Dex 治療組PaO2及PaO2/FiO2高于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 各組大鼠肺指數(shù)和W/D的變化

與NS 對(duì)照組相比，LPS 組肺指數(shù)和W/D 增加（P＜0.01）；Dex 治療組肺指數(shù)和W/D 低于LPS 組（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-β、IL-6和IL-10濃度的變化

與NS 對(duì)照組相比，LPS 組TNF-α、IL-β 和IL-6 及IL-10 濃度升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組TNF-α、IL-β 和IL-6 濃度降低，IL-10 濃度進(jìn)一步升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

5 肺組織MDA濃度及MPO活性的變化

與NS 對(duì)照組相比，LPS 組MDA 的濃度及MPO的活性升高（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組MDA 的濃度及MPO 的活性降低（P＜0.01），而α2AR抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex 的作用（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

6 各組大鼠α1 Na+/K+-ATPase和β1 Na+/K+-ATPase蛋白水平的變化

與NS 對(duì)照組相比，LPS 組α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的蛋白水平降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，Dex 治療組的α1Na+/K+-ATPase、β1Na+/K+-ATPase 蛋白水平升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex的作用（P＜0.01）），見(jiàn)圖6。

7 各組大鼠p-ERK1/2蛋白水平的變化

與NS 對(duì)照組相比，LPS 組p-ERK1/2 的蛋白水平降低（P＜0.01）；與LPS組比較，Dex治療組p-ERK1/2的蛋白水平升高（P＜0.01），而α2AR 抑制劑育亨賓部分逆轉(zhuǎn)了Dex的作用（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

討論

LPS是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，常用來(lái)誘導(dǎo)ALI 模型[13]。我們的研究結(jié)果清楚地表明，LPS 導(dǎo)致ALI 大鼠肺指數(shù)和W/D 比值明顯升高，而Dex 降低了肺指數(shù)和W/D 比值，說(shuō)明Dex 減輕了LPS誘導(dǎo)的ALI 大鼠肺水腫。此外，肺組織病理學(xué)的檢查發(fā)現(xiàn)，在ALI 模型組，肺泡間隔增厚，肺泡充血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而Dex治療則明顯改善了LPS導(dǎo)致的肺組織病理學(xué)改變。與這些研究結(jié)果一致，LPS 導(dǎo)致PaO2和PaO2/FiO2顯著降低，給予Dex 治療后，PaO2和PaO2/FiO2上升，表明肺水腫的消除可有效改善氧合功能，從而有利于ALI患者的轉(zhuǎn)歸。

Figure 1. Pathological changes and injury scores of lung tissues（HE staining，×200）. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group圖1 HE染色觀察右美托咪定對(duì)各組大鼠肺組織病理學(xué)改變及肺損傷分?jǐn)?shù)的影響

Figure 2. Effects of Dex on PaO2 and PaO2/FiO2 in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05 vs LPS+Dex group.圖2 右美托咪定對(duì)各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2的影響

肺水腫的消除不僅依賴(lài)于肺泡內(nèi)液生成的減少，更依賴(lài)于肺泡內(nèi)液體的清除。研究發(fā)現(xiàn)，Na+/K+-ATPase在肺泡上皮細(xì)胞膜上表達(dá)增加或其活性增強(qiáng)能夠促進(jìn)肺泡液體清除[14]。相反，Na+/K+-ATPase 在肺泡上皮細(xì)胞膜上低表達(dá)或活性被抑制則導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體清除降低[15-17]。近年來(lái)的研究表明：不同致病因素導(dǎo)致的ALI 肺組織Na+/K+-ATPase 表達(dá)降低，肺泡內(nèi)液體清除也降低[18-20]，提示維持肺泡上皮細(xì)胞Na+/K+-ATPase 正常表達(dá)，有利于促進(jìn)肺泡內(nèi)液體清除及減輕肺水腫。在本研究中，我們觀察到LPS 可導(dǎo)致肺組織α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的表達(dá)降低，Dex 治療明顯上調(diào)α1Na+/K+-ATPase 和β1Na+/K+-ATPase 的表達(dá)。這些結(jié)果提示，Dex 減輕肺水腫的作用與促進(jìn)Na+/K+-ATPase的表達(dá)有關(guān)。

Figure 3. Effects of Dex on W/D ratio（A）and lung index（B）in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖3 右美托咪定對(duì)各組大鼠W/D和肺指數(shù)的影響

Figure 4. Effects of Dex on TNF-α（A），IL-β（B），IL-6（C）and IL-10（D）in BALF in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖4 右美托咪定對(duì)各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-β、IL-6和IL-10濃度的影響

Figure 5. Effects of Dex on MPO activity（A）and MDA level（B）in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖5 右美托咪定對(duì)各組大鼠肺組織MPO活性和MDA水平的影響

Figure 6. Effects of Dex on expression of Na+/K+-ATPase in the rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖6 Western blot觀察右美托咪定對(duì)各組大鼠Na+/K+-ATPase表達(dá)的影響

Figure 7. Effects of Dex on protein level of p-ERK1/2 in rats with LPS-induced ALI. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs NS group；##P＜0.01 vs LPS group；&&P＜0.01 vs LPS+Dex group.圖7 Western blot觀察右美托咪定對(duì)各組大鼠p-ERK1/2蛋白水平的影響

LPS 能夠激活中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，釋放TNF-α、IL-1β 和IL-6 等大量炎性細(xì)胞因子，而IL-10 等抑制性炎癥細(xì)胞因子分泌不足，最終導(dǎo)致全身瀑布樣炎癥反應(yīng)，而肺部最先受到打擊。以往，我們過(guò)多關(guān)注炎癥反應(yīng)對(duì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，而對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的影響重視不夠。最近研究發(fā)現(xiàn)：TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥細(xì)胞因子能夠抑制肺泡上皮細(xì)胞Na+/K+-ATPase 的表達(dá)[21-23]。與這些研究結(jié)果一致，我們的研究顯示，LPS 導(dǎo)致肺組織大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且BALF中促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 明顯增加，雖然抑制性炎癥細(xì)胞因子IL-10 分泌增加，但不足以抵抗促炎反應(yīng)，而Dex 減少了BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的濃度，同時(shí)增加了IL-10 的濃度。以上研究結(jié)果提示，在LPS 誘導(dǎo)的ALI 模型中，Dex 上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達(dá)可能與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)引起Na+/K+-ATPase 表達(dá)和活性變化的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了相關(guān)研究。ERK1/2是絲裂原激活的蛋白激酶信號(hào)家族中的重要成員，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，并與某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)密切相關(guān)。以往的研究表明，ERK1/2 在調(diào)控Na+/K+-ATPase 中扮演重要的角色[24]，研究發(fā)現(xiàn)：甲狀腺激素通過(guò)激活ERK1/2 增加鼠肺泡上皮細(xì)胞Na+/K+-ATPase 的活性[25-26]，多巴胺通過(guò)激活ERK1/2 提高肺泡上皮細(xì)胞Na+/K+-ATPase的活性[27]。在人骨骼肌細(xì)胞上，Na+/K+-ATPase 的活性也依賴(lài)于ERK1/2 的激活[28]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，LPS 抑制p-ERK1/2 的水平，而Dex 治療極大的增加了p-ERK1/2 的蛋白水平，以上這些研究結(jié)果提示在LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠模型中，Dex 上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達(dá)可能與ERK1/2 的激活有關(guān)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Dex 可激活ERK1/2 減輕腦缺血再灌注損傷及心臟缺血再灌注損傷，而給予α2AR 抑制劑后會(huì)消除Dex 的保護(hù)作用[29-30]，提示Dex可能通過(guò)α2AR 介導(dǎo)ERK1/2 的激活而發(fā)揮器官保護(hù)作用。我們的研究也得出了類(lèi)似的結(jié)果，在Dex 和α2AR 抑制劑育亨賓同時(shí)干預(yù)后，Dex 單獨(dú)干預(yù)時(shí)其抑制肺部炎癥反應(yīng)，上調(diào)Na+/K+-ATPase 表達(dá)及減輕肺水腫的作用被部分逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，Dex 可通過(guò)上調(diào)Na+/K+-ATPase 的表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的ALI相關(guān)肺水腫，其機(jī)制可能與大鼠α2AR介導(dǎo)的ERK1/2激活有關(guān)。