殼寡糖對干旱脅迫下‘鳳丹’幼苗生長及生理特性的影響

石欣隆，楊月琴，薛 嫻，劉 偉，宋程威，郭麗麗，侯小改*

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/牡丹學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南省油用牡丹工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

牡丹(Paeoniasuffruticsa)是我國特有的木本名貴花卉，集觀賞、藥用、食用等多種價值于一身[1]。干旱會直接影響牡丹體內(nèi)的生理生化過程，造成形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，根系活力下降，最終導(dǎo)致生長受抑制，嚴(yán)重時會直接導(dǎo)致植株死亡，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。因此，開展牡丹抗旱相關(guān)性研究具有重要意義。‘鳳丹’(P.ostii‘Feng Dan’)在油用牡丹品種中結(jié)實(shí)能力較強(qiáng)，出油率高，是提供牡丹籽油原料的重要品種[4-5]。‘鳳丹’籽油中油酸、亞油酸、亞麻酸等對人體有益的不飽和脂肪酸含量豐富，其中作為人體必需的亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)42.82%，油用表現(xiàn)相當(dāng)可觀[5-6]。故本研究選用‘鳳丹’作為研究材料。

殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)是一種新興抗逆誘導(dǎo)劑，可使植物維持較高的葉綠素含量，降低葉片氣孔開度，提高光合性能，促進(jìn)作物生長，還能調(diào)節(jié)LEA基因表達(dá)，促進(jìn)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的合成，進(jìn)而延緩衰老，提高植物抗逆性[7-9]。干旱脅迫下外施COS可提高玉米(ZeamaysL.)葉片的相對含水量和葉綠素含量，且超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性增加，從而提高玉米的抗旱能力[10-11]。在甘蔗(SaccharumL.)中同樣發(fā)現(xiàn)外源COS能提高其抗氧化酶活性，并能增加葉片中的滲透物質(zhì)含量，改變細(xì)胞質(zhì)膜滲透率，減緩膜質(zhì)過氧化，從而緩解干旱脅迫對其的毒害作用[12-13]。目前有關(guān)COS促進(jìn)牡丹抵御干旱脅迫的研究鮮見報道。筆者以兩年生油用牡丹品種‘鳳丹’(P.ostii‘Feng Dan’)盆栽苗為試驗材料，探究葉面噴施COS對干旱脅迫下‘鳳丹’植株生長生理及抗氧化酶系統(tǒng)的影響，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用外源物質(zhì)提高牡丹抗旱性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在河南科技大學(xué)牡丹試驗基地進(jìn)行。供試材料為生長健康、長勢一致的兩年生盆栽‘鳳丹’苗，花盆直徑18 cm，高17 cm，盆栽基質(zhì)為河沙與田園土按體積比5∶1混勻。試驗前期統(tǒng)一澆水量，正常水分管理。供試試劑為購自上海圻明生物科技有限公司，相對分子量<3 000的COS溶液。

1.2 試驗設(shè)計

采用逐漸干旱對‘鳳丹’盆栽苗進(jìn)行干旱脅迫。2018年5月25日停止?jié)菜?，開始進(jìn)行干旱處理，7 d后(即2018年5月30日)分別用20、40、60、80 mg/L COS溶液整株噴施，以清水為對照(CK)，共噴施3次，即測定日6：00、12：00、18：00各噴施1次，每株每次噴施量為20 mL。各處理重復(fù)3次，每個處理30株。分別于斷水后7、9、11、13、15 d選取從下向上倒數(shù)3葉，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)及生物量

斷水后第15天，各處理隨機(jī)選取5株‘鳳丹’，整株從盆中取出，蒸餾水清洗干凈后用直尺測量苗高，游標(biāo)卡尺測量莖粗。隨后，分別稱量地上部生物量和地下部生物量，并計算幼苗總生物量和根冠比。

1.3.2 葉片相對含水量

斷水7 d起，每隔2 d用飽和含水量法[14]測定葉片相對含水量(relative water content，RWC，公式中記為CRWC)。計算公式為：CRWC=[(WF-WD)/(WT-WD)]×100%。式中，WF為葉片鮮質(zhì)量，WT為葉片浸水24 h后達(dá)到葉片吸水飽和穩(wěn)定時的葉片質(zhì)量，WD為80 ℃烘干48 h后的葉片質(zhì)量。

1.3.3 葉綠素含量和凈光合速率

采用丙酮法[15]測定‘鳳丹’葉片葉綠素含量(chlorophyll content，Chl)；用Li-6400便攜式光合儀(LI-COR，Lincoln，Nebraska，USA)測葉片凈光合速率(Pn)，選擇晴朗天氣，測定時間為9：00—11：00。

1.3.4 葉片丙二醛和過氧化氫含量

采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的丙二醛含量試劑盒、過氧化氫含量試劑盒分別測定葉片中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)和過氧化氫(H2O2)含量。

1.3.5 葉片抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍(lán)四唑比法測定，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定，過氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用紫外吸收法測定[15-16]。

1.3.6 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量

可溶性糖(soluble sugar，SS)含量采用蒽酮乙酸乙酯法測定，可溶性蛋白(soluble protein，SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，脯氨酸(proline，Pro)含量采用磺基水楊酸法測定[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并運(yùn)用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(α=0.05)，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’幼苗生長的影響

由不同COS處理對干旱脅迫下‘鳳丹’幼苗生長的影響情況(表1)可知，隨著COS濃度的升高，停水15 d的‘鳳丹’幼苗苗高、莖粗、地上生物量、地下生物量和總生物量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而根冠比呈降低趨勢，說明干旱脅迫顯著抑制了‘鳳丹’幼苗的生長；而噴施COS可以有效緩解干旱脅迫對‘鳳丹’幼苗生長造成的損傷，且主要促進(jìn)‘鳳丹’地上部分的生長發(fā)育。與CK處理相比，噴施40 mg/L COS處理下干旱15 d的‘鳳丹’幼苗苗高、莖粗、地上生物量、地下生物量和總生物量分別增加了25.46%、17.79%、45.97%、20.69%和34.30%，說明噴施40 mg/L的COS對提高‘鳳丹’抗旱性效果最佳。

表1 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’幼苗生長的影響Table 1 Effects of COS on the growth of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

2.2 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片相對含水量的影響

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters in the same column meant significant difference at 0.05 level among treatments.The same below.圖1 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片相對含水量的影響Fig.1 Effects of COS on RWC of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

由 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片相對含水量的影響情況(圖1)可知，隨著干旱脅迫時間的延長，‘鳳丹’葉片RWC呈下降趨勢，相同干旱時間內(nèi)各處理葉片RWC均高于CK組。斷水第7天，各處理間葉片RWC差異不顯著(P>0.05)；斷水第9天，噴施20 mg/L COS后‘鳳丹’葉片RWC略高于CK，其他處理組間葉片RWC差異不顯著，但均顯著高于CK(P<0.05)；斷水第11天后，同等干旱程度下‘鳳丹’葉片RWC隨著COS噴施濃度的增加呈先升高后降低趨勢，且噴施40 mg/L COS后‘鳳丹’葉片RWC均顯著高于其他處理組，與CK相比，‘鳳丹’葉片RWC隨干旱程度的加劇分別增加了11.09%、17.66%、11.76%。

2.3 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片葉綠素含量和凈光合速率的影響

由COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片葉綠素含量和凈光合速率的影響情況(圖2)可知，相同濃度COS處理下，‘鳳丹’葉片Chl含量和Pn隨著干旱天數(shù)的增加均呈先上升后下降趨勢。與CK相比，相同干旱時間內(nèi)各處理間‘鳳丹’葉片Chl含量和Pn均有所增加，說明噴施外源COS能夠提高干旱下‘鳳丹’葉片的葉綠素含量和凈光合速率。干旱7 d時，噴施60 mg/L COS后‘鳳丹’葉片Chl含量顯著高于其他各處理；干旱9 d 后，隨著干旱時間的延長，噴施40 mg/L COS可顯著提高‘鳳丹’葉片Chl含量(圖2A)。噴施COS后干旱脅迫下‘鳳丹’葉片Pn變化趨勢與葉片Chl含量一致(圖2B)。與CK相比，噴施40 mg/L COS效果最佳，可使‘鳳丹’葉片Pn顯著提高16.40%、18.20%、43.10%、45.56%、93.52%。

圖2 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片葉綠素含量、凈光合速率、MDA與H2O2含量的影響Fig.2 Effects of COS on chlorophyll content,Pn,MDA and H2O2 contents of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

2.4 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片丙二醛含量和過氧化氫含量的影響

噴施相同濃度COS后，各處理‘鳳丹’葉片中MDA和H2O2含量隨著干旱時間的延長呈升高趨勢(圖2C、2D)。由圖2C可知，與CK相比，各干旱時間內(nèi)噴施20 mg/L COS后‘鳳丹’葉片中MDA含量降低不顯著，噴施高質(zhì)量濃度COS(40～80 mg/L)后均顯著降低(P<0.05)，其中40 mg/L COS效果最佳，各干旱時間的‘鳳丹’葉片中MDA含量分別降低了23.27%、12.23%、23.22%、17.27%、20.63%。噴施COS可顯著降低‘鳳丹’葉片中H2O2含量(圖2D)，且噴施高質(zhì)量濃度COS (40～80 mg/L)后‘鳳丹’葉片H2O2含量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于CK(P<0.05)。與CK相比，噴施40 mg/L COS后各干旱時間的‘鳳丹’葉片中H2O2含量分別降低了16.65%、22.82%、30.75%、29.14%、38.62%。

2.5 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片抗氧化酶活性的影響

隨著干旱程度的增加，‘鳳丹’葉片SOD、POD、CAT活性均表現(xiàn)為先升高后降低趨勢，噴施不同質(zhì)量濃度COS后，相同干旱程度下‘鳳丹’葉片的SOD、POD、CAT活性隨COS質(zhì)量濃度的增加呈逐漸升高趨勢，說明外源COS能夠提高干旱脅迫下‘鳳丹’葉片的抗氧化酶活性(圖3)。由圖3A可知，干旱7 d，各處理間葉片SOD活性較低，隨著干旱程度的增加，SOD活性逐漸增加；高質(zhì)量濃度COS(40～80 mg/L)的噴施可顯著提高葉片SOD活性(P<0.05)；從各干旱處理段綜合看，當(dāng)COS質(zhì)量濃度超過40 mg/L即可達(dá)到顯著提高效果。隨干旱程度的增加，噴施外源COS后‘鳳丹’葉片POD活性的變化趨勢與SOD一致，具體表現(xiàn)為高質(zhì)量濃度COS可顯著促進(jìn)POD活性的提高(圖3B)。由圖3C可知，噴施COS可提高‘鳳丹’葉片干旱脅迫期間的CAT活性，各干旱脅迫期內(nèi)，隨著噴施濃度的增加，CAT活性呈先增加后降低趨勢，其中高質(zhì)量濃度COS(40～80 mg/L)的噴施可顯著提高葉片CAT活性(P<0.05)，且當(dāng)外源COS噴施質(zhì)量濃度為40 mg/L時，提高效果最明顯。綜合分析可知，外源COS噴施質(zhì)量濃度超過40 mg/L時，對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片SOD、POD、CAT活性的增強(qiáng)效果較佳。

圖3 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片SOD、POD、CAT活性的影響Fig.3 Effects of COS on SOD,POD and CAT activities of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

2.6 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片SS、SP、Pro含量的影響情況(圖4)可知，相同濃度COS處理下，‘鳳丹’葉片中SS、SP、Pro含量均隨著干旱程度的增加呈先升高后降低趨勢；噴施不同質(zhì)量濃度COS后，相同干旱程度‘鳳丹’葉片中的SS、SP、Pro含量隨著COS溶液質(zhì)量濃度的增加呈逐漸升高趨勢。在干旱脅迫下，噴施高質(zhì)量濃度的COS(40～80 mg/L)可顯著提高‘鳳丹’葉片的SS、SP、Pro含量(P<0.05)，但各處理間差異不顯著(P>0.05)。干旱7～9 d時，噴施不同質(zhì)量濃度COS對‘鳳丹’葉片中SS含量無顯著影響(P>0.05)，隨著干旱程度的增加，干旱11 d后，噴施COS可顯著提高‘鳳丹’葉片中SS含量(圖4A)。干旱7～9 d時，與CK相比，噴施20 mg/L COS對‘鳳丹’葉片中SP含量無顯著影響(P>0.05)，高質(zhì)量濃度的COS(40～80 mg/L)可顯著提高‘鳳丹’葉片中SP含量，且高質(zhì)量濃度間無顯著差異(圖4B)。干旱7 d時，噴施不同質(zhì)量濃度COS對‘鳳丹’葉片中Pro含量無顯著影響(P>0.05)，隨著干旱程度的增加，與CK相比，不同質(zhì)量濃度COS均顯著提高‘鳳丹’葉片中Pro含量(圖4C)。綜合分析可知，干旱脅迫下，噴施COS可提高‘鳳丹’葉片中的SS、SP、Pro含量，當(dāng)噴施質(zhì)量濃度超過40 mg/L時，提高效果顯著(P<0.05)，本著降低生產(chǎn)成本的原則，建議噴施質(zhì)量濃度采用40 mg/L。

圖4 COS對干旱脅迫下‘鳳丹’葉片SS、SP、Pro含量的影響Fig.4 Effects of COS on SS,SP and Pro contents of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

3 討 論

1) 殼寡糖(COS)是一種帶正電荷陽離子堿性氨基低聚葡萄糖，被稱為自然界的“天然活性產(chǎn)物”，憑借高效、無毒、來源廣、易降解的優(yōu)勢被大量用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[17-18]。景紅娟等[19]研究表明COS可顯著增加小麥(Triticumaestivum)幼苗的生物量，有效促進(jìn)小麥根、苗和胚芽鞘的生長發(fā)育，提高幼苗成活率。Lin等[20]研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施適宜濃度的COS能有效促進(jìn)黃芪(Astragaliradix)植株及根系的生長，使苗和根粗壯，須根數(shù)減少。本研究結(jié)果也表明噴施外源COS能增加干旱脅迫下‘鳳丹’的苗高，促進(jìn)根系發(fā)育變粗，提高地上部與地下部的生物量，促進(jìn)‘鳳丹’幼苗的生長發(fā)育，增加幼苗生物量。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不同COS處理效果存在差異，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，40 mg/L效果最佳。

水是植物體重要的結(jié)構(gòu)成分，在植物體新陳代謝過程中發(fā)揮著不可替代的作用。李思等[21]研究發(fā)現(xiàn)在自然干旱條件下多次向葉面噴施COS能顯著提高玉米葉片的相對含水量，本研究結(jié)果與其一致，且本研究發(fā)現(xiàn)噴施40 mg/L外源COS可顯著增加干旱脅迫下‘鳳丹’葉片的相對含水量。葉綠素是植物進(jìn)行營養(yǎng)生長、生殖生長和抗逆生長的關(guān)鍵成分，其含量的高低在很大程度上反映了葉片光合作用的強(qiáng)弱[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施外源COS可顯著增加干旱脅迫下‘鳳丹’葉片的葉綠素含量，有效提高葉片凈光合速率，以40 mg/L COS效果最佳，該結(jié)果與郭衛(wèi)華等[23]和李艷等[24]的研究結(jié)果一致。

2) 植物在長期演化過程中形成了一套有效的酶促清除活性氧系統(tǒng)，通過刺激植物體內(nèi)SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性增加，清除過多的自由基，維持活性氧產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，減輕植物細(xì)胞膜脂過氧化，從而提高對逆境(干旱、高溫、鹽漬和重金屬污染等)脅迫的抵抗能力[25]。本研究中隨著干旱脅迫的不斷加劇，‘鳳丹’葉片的MDA和H2O2含量逐漸增加，SOD、POD、CAT活性均表現(xiàn)為先大幅升高后緩慢降低趨勢，說明干旱脅迫下，‘鳳丹’幼苗能通過自身調(diào)節(jié)機(jī)制，提高抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性，清除部分活性氧自由基，但由于自身調(diào)節(jié)能力有限，無法完全清除體內(nèi)過量的自由基，使其不可避免地遭受到氧化脅迫損傷。噴施COS能在一定程度上提高‘鳳丹’葉片的SOD、POD和CAT活性，降低MDA和H2O2含量，減輕膜質(zhì)過氧化程度，緩解干旱脅迫對‘鳳丹’幼苗造成的氧化傷害作用，這與李偉等[26]在野牛草(BuchloedactyloidesNutt.)上的研究結(jié)果類似。孫君艷等[27]研究了殼寡糖對干旱脅迫下花生(ArachishypogaeaLinn.)幼苗葉片保護(hù)酶的影響，也表明外施COS能增強(qiáng)幼苗葉片保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)的生理活性，減輕干旱造成的傷害，從而增強(qiáng)幼苗的抗旱能力。

植物組織中的SS、SP和Pro是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物抵抗外界脅迫的能力與SS、SP、Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量密切相關(guān)[28]。研究表明輕度干旱下，SS可作為小分子物質(zhì)參與滲透調(diào)節(jié)，SP可參與植物體內(nèi)各種代謝，Pro能促進(jìn)蛋白質(zhì)的水合作用，形成具有一定保水能力的聚合物，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，同時還能作為細(xì)胞膜和酶類的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑，維持細(xì)胞滲透平衡[29-30]。李軍等[31]研究表明逐漸干旱脅迫下，隨著水分脅迫程度增加，‘洛陽紅’(P.suffruticosa‘Luoyang Hong’)和‘烏龍捧盛’(P.suffruticosa‘Wulong Pengsheng’)牡丹葉片的SS、SP含量均呈逐漸升高的趨勢，而本研究中隨干旱程度的增加，‘鳳丹’葉片中SS和SP含量均呈先升高后降低趨勢變化，這可能是由于干旱程度加重，葉片細(xì)胞膜質(zhì)過氧化反應(yīng)加快，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞而失去半透性，胞內(nèi)氨基酸、糖類等物質(zhì)大量外滲，最終導(dǎo)致葉片SS、SP含量降低。本研究中，不同濃度COS溶液處理后，‘鳳丹’葉片SP、SS、Pro含量均高于對照，且當(dāng)噴施質(zhì)量濃度超過40 mg/L時，提高效果明顯，這說明適宜濃度的外源COS處理能增加植物體內(nèi)滲透物質(zhì)的含量，對提高細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力、維持細(xì)胞滲透平衡和保護(hù)細(xì)胞膜完整性有重要促進(jìn)作用，該結(jié)果與馬蓮菊等[32]在小麥上的研究一致。

綜上，干旱脅迫下噴施COS能促進(jìn)‘鳳丹’幼苗生長，提高葉片相對含水量、凈光合速率和葉綠素含量，提高抗氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性，提高可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，降低丙二醛和過氧化氫含量，且在本試驗中，噴施質(zhì)量濃度為40 mg/L時，即可降低成本，又能增加收益。