異硫氰酸苯乙酯聯(lián)合阿霉素誘導骨肉瘤細胞凋亡的作用研究

范 鍥，李文浩，丘德贊，黃孝英，李浩曦，何基琛

骨肉瘤是一種罕見的肉瘤類型，但它也是最為常見骨組織來源的惡性腫瘤，常常因早期的肺轉(zhuǎn)移而導致極差的預后[1～3]。骨肉瘤可發(fā)生在所有年齡段，但兒童發(fā)病更為常見，占全球所有兒科惡性腫瘤患者的2.4%[4]。阿霉素(adriamycin，ADM)屬于化療藥物的一種,這種蒽環(huán)類抗生素能夠減緩或阻滯癌細胞的生長[5,6]，已被臨床應用于治療包括骨肉瘤在內(nèi)的各種類型的癌癥[7]。與其他化療藥物一樣，雖然ADM對癌細胞有殺傷作用，但最終也會因癌細胞對ADM產(chǎn)生耐藥性而失效[8,9]。此外，毒副作用降低了患者治療的成功率。因此，有必要探討增強ADM作用的新方法，以降低其臨床用藥量。異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate，PEITC)是多種十字花科蔬菜中天然存在的異硫氰酸酯的化合物，是重要的異硫氰酸酯類家族成員之一[10,11]。PEITC可調(diào)節(jié)前列腺癌、白血病和骨髓瘤細胞的表觀遺傳過程，并抑制組蛋白去乙酰酶[12～14]。有研究[15]表明，PEITC可抑制不同類型腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡。另外，PEITC在臨床中也已被證明可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，并協(xié)同增強化療藥物誘導的癌細胞凋亡[16]。本研究旨在通過細胞實驗探討PEITC與ADM對骨肉瘤細胞凋亡的協(xié)同作用及相關機制，為臨床治療提供科學依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 骨肉瘤U2-OS細胞株購自中國科學院上海細胞庫；ADM購自美國Sigma公司；PEITC購自TCI公司；細胞凋亡蛋白酶(Caspase)-3活性檢測試劑盒購自中國海門市碧云天生物技術研究所；Caspase-3抗體、Caspase-9抗體、細胞表面死亡受體Fas抗體、細胞表面死亡受體配體FasL抗體購自美國genetech公司；二抗購自中國南京金斯瑞生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自中國Solarbio公司。

1.2細胞培養(yǎng) 采用含10%濃度胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U2-OS細胞，細胞培養(yǎng)箱條件設置為5% CO2、37 ℃。根據(jù)細胞生長狀況進行細胞傳代，取處于對數(shù)生長期的U2-OS細胞進行后續(xù)相關實驗。

1.3MTT法檢測細胞增殖能力 選取呈現(xiàn)對數(shù)生長的U2-OS細胞，稀釋至5×104cells/ml，以100 μl/孔種植到96孔無菌培養(yǎng)板中，以37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)6～12 h，待細胞貼壁。ADM組分別按照1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml和25 μg/ml的ADM藥物終濃度對細胞進行干預處理，PEITC組分別按照2 μM/ml、4 μM/ml、8 μM/ml、16 μM/ml、32 μM/ml和64 μM/ml的PEITC藥物終濃度對細胞進行干預處理。繪制細胞增殖曲線并分別計算ADM和PEITC的半抑制濃度(IC50)。另外，應用MTT法檢測ADM聯(lián)合PEITC對細胞增殖的影響，選取呈現(xiàn)對數(shù)生長的U2-OS細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104cells/ml，每孔加入100 μl。分組及干預方法如下：ADM 1組(2 μg/ml ADM)、ADM 2組(3 μg/ml ADM)、ADM 3組(10 μg/ml ADM)；PEITC 1組(1 μM/ml PEITC)、PEITC 2組(2 μM/ml PEITC)、PEITC 3組(5 μM/ml PEITC)；A+P 1組(2 μg/ml ADM+1 μM/ml PEITC)、A+P 2組(3 μg/ml ADM+2 μM/ml PEITC)、A+P 3組(10 μg/ml ADM+5 μM/ml PEITC)、空白對照組(未添加藥)。每孔終體積100 μl，每個濃度設3個重復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μl MTT溶液，使用ST360酶標儀(上海科華公司)進行檢測，在570 nm波長下檢測并記錄其OD值。抑制率=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/空白孔OD值×100%。Q值的計算公式如下:Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。Ea和Eb分別表示單獨使用ADM和PEITC的抑制率;Ea+b為ADM與PEITC聯(lián)合抑制率。Q值>1.15表示協(xié)同效應;0.85≤Q值≤1.15為相加效應，Q值<0.85為拮抗效應。

1.4TUNEL法測定U2-OS細胞凋亡 使用熒光素碎片DNA片段檢測試劑盒(DeadEnd,美國)進行TUNEL檢測。經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗去U2-OS細胞培養(yǎng)液，4 ℃條件下使用4%甲醛溶液固定25 min，PBS液洗滌5 min×2次。加入0.2% TritonX-100室溫孵育5 min,PBS液洗滌5 min×2次。加入100 μl平衡緩沖液室溫平衡10 min。加入50 μl末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶工作液，37 ℃濕盒內(nèi)避光孵育60 min。加入預先配置好的SSC溶液洗滌15 min。再次加PBS溶液室溫洗滌5 min×3次。在4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚染液室溫濕盒避光孵育10 min。然后加去離子水室溫洗滌5 min×3次。熒光抗淬滅劑封片，使用熒光顯微鏡(U-REL-T，OLYMPUS)鏡檢。細胞凋亡率=陽性染色細胞(即凋亡細胞)/總細胞×100%。

1.5Caspase-3活性檢測 按試劑盒提供的對硝基苯胺(p-nitroaniline，pNA；10 mmol/L)用標準品稀釋液稀釋，測定其405 nm處吸光度(A405值),并作出pNA濃度相當于A405值的pNA標準曲線,依據(jù)pNA標準曲線定量檢測Caspase-3。取藥物處理好的細胞加入裂解液，重懸后冰浴裂解15 min,使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。按照檢測緩沖液50 μl+待測樣本40 μl+10 μl Caspase-3顯色底物(2 mmol/L)配置反應體系，37 ℃孵育120 min后應用酶標儀(DNM-9602A)測定其A405值。樣品中Caspase-3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度值=樣品孔A405值-空白對照孔A405值。

1.6Western blot檢測Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達 使用含有60 g/ml苯甲基磺酰氟的裂解緩沖液提取U2-OS細胞的總蛋白。使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)100 ℃水浴變性5 min，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白從膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。將膜浸在封閉液中4 ℃封閉過夜。將膜取出放入一抗液中，4 ℃封閉過夜。PBST洗膜，5 min×4次。將膜轉(zhuǎn)入二抗液中，37 ℃孵育1 h，用洗脫液洗滌3次，前兩次5 min，第三次10 min，然后用鑷子輕輕地將PVDF膜放置于曝光盒里，于暗室內(nèi)壓片并沖印成像。應用膠片用凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP Imaging System，美國BIO-RAD公司)進行掃描及數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié)果

2.1PEITC和ADM對U2-OS細胞增殖能力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，PEITC和ADM濃度對U2-OS細胞的IC50分別為4.37 μM/ml和6.61 μg/ml。見圖1。與單獨使用PEITC或ADM處理相比，聯(lián)合使用兩種藥物對U2-OS細胞的增殖抑制率更高(P<0.05)。低劑量的PEITC聯(lián)合ADM產(chǎn)生協(xié)同效應，而高劑量的兩種藥物聯(lián)合產(chǎn)生相加效應，見表1。

2.2不同處理組U2-OS細胞的凋亡情況比較 熒光顯微鏡觀察見較高濃度PEITC、ADM處理組的U2-OS細胞凋亡數(shù)多于較低濃度組，且低濃度PEITC聯(lián)合ADM處理組的U2-OS細胞凋亡數(shù)比單獨使用PEITC或ADM的高濃度處理組更多。見圖2。除ADM(6.61 μg/ml)組與PEITC(4.37 μM/ml)組的U2-OS細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余不同處理組間U2-OS細胞的凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

?ADM干預處理；?PEITC干預處理

表1 不同處理組U2-OS細胞增殖抑制率及Q值比較

藍色熒光表示正常U2-OS細胞，綠色熒光表示凋亡細胞

表2 不同處理組U2-OS細胞的凋亡率比較

2.3不同處理組Caspase-3活性比較 單因素方差分析結(jié)果顯示，ADM(6.61 μg/ml)組和PEITC(4.37 μM/ml)組的U2-OS細胞Caspase-3活性顯著高于空白對照組，ADM(6.61 μg/ml)聯(lián)合PEITC(4.37 μM/ml)處理后，U2-OS細胞Caspase-3活性較單藥處理組上升。見表3。

表3 不同處理組Caspase-3活性比較

2.4不同處理組Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達水平比較 Western blot檢測結(jié)果顯示,ADM(6.61 μg/ml)+PEITC(4.37 μM/ml)組的Caspase-3蛋白表達水平顯著高于ADM(6.61 μg/ml)組和PEITC(4.37 μM/ml)處理組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。另外，ADM(6.61 μg/ml)+PEITC(4.37 μM/ml)組的Fas蛋白表達水平顯著低于PEITC(4.37 μM/ml)處理組(P<0.05)，F(xiàn)asL蛋白表達水平顯著高于ADM(6.61 μg/ml)組(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 Western blot檢測結(jié)果圖

表4 不同處理組Caspase-3、Fas、FasL蛋白表達水平比較灰度值]

3 討論

3.1骨肉瘤是一種好發(fā)于10～20歲的青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤,常發(fā)生于長骨干骺端。目前對于骨肉瘤的療法主要是采用手術切除腫瘤聯(lián)合化療的方式進行治療。然而，骨肉瘤的早期肺轉(zhuǎn)移以及較高的復發(fā)率也導致了骨肉瘤患者的高病死率和致殘率。根據(jù)《骨肉瘤臨床循證診療指南》[17]的建議，ADM被推薦作為一線化療藥物，盡管其大大地提高了患者的5年生存率及保肢率，但是ADM的耐藥問題依然嚴峻，給臨床治療增加了一定的難度。PEITC是常用的人工合成的抗腫瘤單體,具有良好的抗腫瘤作用。目前，PEITC在肝癌、乳腺癌及骨髓瘤等惡性腫瘤的體外試驗中顯示出顯著的抗腫瘤效果，誘導細胞凋亡作用明顯[18]。高劑量的ADM可能會導致腫瘤耐藥或是對機體產(chǎn)生較大的毒副作用，并最終導致治療失敗。本研究結(jié)果顯示，當ADM聯(lián)合PEITC作用于骨肉瘤細胞系時，ADM能夠在一個相對較低的濃度獲得一個令人滿意的癌細胞增殖的抑制效果，這對指導臨床研究的開展有實際意義。

3.2在本研究中，經(jīng)MTT實驗確定了PEITC和ADM處理U2-OS細胞系時的IC50分別為4.37 μM/ml和6.61 μg/ml。并且在藥物濃度較低時，兩種藥物聯(lián)合表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用，而當藥物濃度上升，協(xié)同作用變?nèi)?，則表現(xiàn)出相加作用。但無論如何，PEITC都能增強ADM對U2-OS細胞增殖的抑制作用。ADM可誘導多種類型癌細胞凋亡[19]，PEITC也對腫瘤細胞具有相似的功能效果[20]。本研究結(jié)果顯示，PEITC聯(lián)合ADM處理U2-OS細胞可獲得比單藥處理更高的凋亡率，考慮可能為PEITC提高了U2-OS細胞對ADM凋亡作用的敏感性。

3.3ADM誘導癌細胞凋亡可能是多個信號通路共同作用的結(jié)果[21]。例如，ADM通過Fas介導的凋亡通路而誘導甲狀腺癌細胞凋亡[22]。然而也有研究[23,24]認為，ADM誘導的細胞凋亡主要依賴腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體-TRAIL受體信號，而并不是通過FasL、穿孔素、自然殺傷細胞受體D或血小板和T細胞活化抗原1進行。經(jīng)PEITC和ADM處理的U2-OS細胞沒有觀察到FasL表達增加，且PEITC和ADM聯(lián)合處理的U2-OS細胞觀察到Fas表達下降，提示Fas/FasL信號通路未參與其凋亡過程。Caspase-3蛋白被稱為死亡蛋白酶,是Caspases家族中最重要的細胞凋亡執(zhí)行者之一。在蛋白酶級聯(lián)切割過程中，Caspase-3蛋白發(fā)揮著重要的作用,一旦Caspase-3蛋白被激活就會導致細胞死亡[25]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)PEITC和ADM處理后，U2-OS細胞的Caspase-3蛋白活性和表達水平顯著增強。活化的Caspase-3蛋白可引起與細胞結(jié)構(gòu)、細胞周期及DNA修復相關基因或蛋白失活,誘發(fā)腫瘤細胞凋亡而抑制癌癥的發(fā)生[26]。PEITC和ADM的協(xié)同作用(或是相加作用)可在較低藥物濃度條件下達到上調(diào)Caspase-3蛋白表達的效果，并導致腫瘤細胞凋亡，實驗結(jié)果對PEITC的臨床應用提供了一定依據(jù)。

綜上所述，PEITC聯(lián)合ADM可在較低藥物濃度條件下有效抑制U2-OS細胞增殖，提高細胞凋亡率，其作用可能與Caspase-3蛋白活性升高和表達量上調(diào)有關，這為PEITC聯(lián)合ADM的臨床應用提供了參考依據(jù)。