CBX8基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能分析

任冠樺，張朝鈞，梅凡彪，蔡冬梅，黃天壬，鄧 偉

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占肝癌的85%～90%，是中國最常見的惡性腫瘤之一[1]。國家癌癥中心的最新監(jiān)測結(jié)果表明，我國肝癌發(fā)病率居全國惡性腫瘤第4位，病死率居第2位[2]。因此，探索有效的治療方法，提高肝癌患者的生存率對于保障國民生命健康具有重要意義。近年來隨著高通量測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，肝癌發(fā)病的分子機(jī)制研究成果斐然，發(fā)現(xiàn)了大量的關(guān)鍵基因，為肝癌靶向治療的發(fā)展奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。但是，目前已有的肝癌靶向藥物，如索拉菲尼、卡博替尼、雷莫蘆單抗等，仍有其局限性[3～5]。因此尋找新的與肝癌相關(guān)的基因和分子標(biāo)志物具有重要意義。色素框同源蛋白8(chromobox 8,CBX8)又名人多梳蛋白3(Polycomb 3,PC3)，由位于人類染色體17q25.3上的CBX8基因編碼產(chǎn)生，全長共9 552 bp[6]。CBX8是PcG蛋白家族的重要組成部分，與細(xì)胞周期、分化、修復(fù)和衰老的調(diào)節(jié)關(guān)系密切[7，8]。CBX8在許多腫瘤組織中呈高表達(dá)，例如乳腺癌[9]、食管癌[10]和結(jié)直腸癌[11]等。有研究[12]表明，CBX8在HCC組織中過表達(dá)，并與HCC的不良預(yù)后關(guān)系密切，細(xì)胞學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)CBX8可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，對HCC的預(yù)后和療效判斷具有一定的意義。本文結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，利用GEPIA、COSMIC、String、UALCAN、HPA等數(shù)據(jù)庫對CBX8進(jìn)行深入挖掘，旨在分析CBX8在HCC中的表達(dá)和潛在的臨床意義，為探究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的線索。

1 資料與方法

1.1資料收集 在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)、COSMIC數(shù)據(jù)庫(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)、UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)、HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org)中收集人HCC的研究數(shù)據(jù)，并篩選出在HCC組織中CBX8的表達(dá)數(shù)據(jù)及其相關(guān)資料。

1.2分析方法

1.2.1 CBX8基因mRNA表達(dá)水平分析 通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫對TCGA和GTEx項目中CBX8基因進(jìn)行檢索，設(shè)置篩選條件：(1)Expression Analysis：Expression DIY。(2)fold change：1；p-value Cutoff：0.01。(3)Cancer name：LIHC。共獲得369例HCC組織和160例正常肝組織的mRNA表達(dá)信息。應(yīng)用“Box Plot”和“Stage Plot”模塊分析CBX8基因在HCC中的表達(dá)水平及其與癌癥分期的關(guān)系。

1.2.2 CBX8基因突變的情況分析 通過COSMIC數(shù)據(jù)庫分析CBX8基因突變的情況，其中滿足點(diǎn)突變情況分析的HCC樣本177例，滿足基因突變情況分析的HCC樣本259例。應(yīng)用“Overview”和“Mutation distribution”選項分析CBX8的三維結(jié)構(gòu)和突變分布情況。

1.2.3 CBX基因的表達(dá)水平與人口學(xué)特征、病理特征的關(guān)聯(lián)性分析 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫檢索CBX8在HCC組織和正常組織中的表達(dá)情況。根據(jù)不同特征將其分成不同亞組，分析CBX8基因表達(dá)水平與不同亞組的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用“Expression”選項查看不同亞組下表達(dá)情況的結(jié)果圖。

1.2.4 CBX8基因表達(dá)水平與HCC患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析 通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫對TCGA和GTEx項目中CBX8基因進(jìn)行檢索，設(shè)置篩選條件：(1)Expression Analysis：Survival Analysis。(2)Group Cutoff=Median；Hazards Ratio(HR)=Yes；95% Confidence Interval=Yes；Cutoff-High(%)=50，Cutoff-Low(%)=50。(3)Cancer name：LIHC。經(jīng)篩選后，共有364例HCC樣本滿足條件，以表達(dá)水平的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)將HCC樣本劃分為高表達(dá)組(182例)和低表達(dá)組(182例)。應(yīng)用“Overall Survival”和“Disease Free Survival”分析CBX8基因表達(dá)水平與患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1.2.5 CBX8基因蛋白表達(dá)水平分析 通過HPA數(shù)據(jù)庫從RNA和蛋白水平研究人類不同組織和器官中的蛋白表達(dá)情況，用Tissue Atlas和Pathology Atlas分別查看CBX8在正常肝組織和HCC組織中的免疫組化圖像。

1.2.6 CBX8相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及通路分析

應(yīng)用String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)對CBX8蛋白及其互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行檢索，分析與CBX8蛋白相互作用的所有蛋白構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控關(guān)系。對CBX8進(jìn)行富集通路分析，以P<0.05作為功能和通路富集顯著的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，預(yù)測與CBX8影響HCC發(fā)生發(fā)展的通路。

2 結(jié)果

2.1HCC組織和正常肝組織CBX8 mRNA表達(dá)水平比較 GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，HCC組織的CBX8 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常肝組織(P<0.05)。進(jìn)一步對HCC組織CBX8 mRNA的表達(dá)水平與癌癥分期的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CBX8 mRNA在Ⅰ期表達(dá)較離散，在Ⅳ期表達(dá)較集中，但Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期間CBX8 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.920，P=0.126)。見圖1。

?HCC組織和正常肝組織CBX8 mRNA表達(dá)水平比較；?HCC組織CBX8 mRNA表達(dá)水平與癌癥分期的關(guān)系

2.2CBX8基因在HCC組織中的突變情況 COSMIC數(shù)據(jù)庫檢索CBX8的三維結(jié)構(gòu)及其基因突變情況，結(jié)果顯示，CBX8基因的點(diǎn)突變類型主要為C>T突變(34.46%)、G>A突變(27.12%)和G>T突變(12.43%)；CBX基因的密碼子改變主要為錯義突變(50.58%)和同義突變(16.60%)。見圖2。

?CBX8的三維結(jié)構(gòu)圖；?CBX8基因點(diǎn)突變分布情況；?CBX8基因突變類型分布情況

2.3CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者人口學(xué)特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫探究CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者人口學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果表明，CBX8 mRNA在不同性別、年齡和種族的HCC患者中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者體重呈負(fù)相關(guān)，正常體重組CBX8 mRNA表達(dá)水平顯著高于肥胖組和極度肥胖組(P<0.05)，但其余組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

?CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者性別的關(guān)聯(lián)分析；?CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者種族的關(guān)聯(lián)分析；?CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者年齡的關(guān)聯(lián)分析；?CBX8 mRNA表達(dá)水平與患者體重的關(guān)聯(lián)分析

2.4CBX8 mRNA表達(dá)水平與HCC病理特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CBX8 mRNA表達(dá)水平與HCC病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明，TP53突變組的CBX8 mRNA表達(dá)水平顯著高于非TP53突變組(P<0.05)；HCC組的CBX8 mRNA表達(dá)水平顯著低于纖維板層型HCC組(P<0.05)，但肝膽管混合型HCC組的CBX8 mRNA表達(dá)水平與HCC組和纖維板層型HCC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CBX8 mRNA表達(dá)水平在N0期與N1期中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤1級組和3級組CBX8 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但腫瘤1級組、2級組、3級組和4級組的其他兩兩比較中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

?CBX8 mRNA表達(dá)水平與TP53突變的關(guān)聯(lián)分析；?CBX8 mRNA表達(dá)水平與N分期的關(guān)聯(lián)分析；?CBX8 mRNA表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分類關(guān)聯(lián)分析；?CBX8 mRNA表達(dá)水平與腫瘤分級的關(guān)聯(lián)分析

2.5CBX8 mRNA表達(dá)水平與HCC患者的生存預(yù)后分析結(jié)果 通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫生存分析模塊對CBX8 mRNA表達(dá)水平與HCC患者的生存預(yù)后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CBX8 mRNA高表達(dá)組在無病生存期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.200)，但CBX8 mRNA高表達(dá)組的總生存期低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)。見圖5。

?無病生存期；?總體生存期

2.6CBX8蛋白在正常肝組織與HCC組織中的表達(dá)情況 應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫中的組織病理表達(dá)模塊對CBX8特異性抗體(HPA031462)在HCC和正常肝組織中的免疫組化染色強(qiáng)度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在3例正常肝組織中，CBX8蛋白在肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中均未見染色；在7例HCC組織中，CBX8未染色1例，弱染色3例，中染色3例，CBX8蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中。表明CBX8蛋白在HCC組織中的表達(dá)較正常組織上調(diào)。見圖6。

2.7CBX8相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)通路 應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫分析獲得與CBX8相關(guān)蛋白作用的互作網(wǎng)絡(luò)(最高置信區(qū)間為0.7，數(shù)量<10)，P=0.000，節(jié)點(diǎn)數(shù)為11。與CBX8蛋白互相作用的主要相關(guān)蛋白分別為BMI1、PHC1、PHC2、PHC3、RING1、PCGF1、PCGF2、EZH2、RNF2、ENSG00000269897，見圖7。進(jìn)一步的富集分析結(jié)果顯示，這些蛋白主要參與了細(xì)胞周期、組蛋白的調(diào)控、鋅指蛋白結(jié)合、PcG蛋白調(diào)控等生理過程，信號通路主要富集在干細(xì)胞多能性的信號調(diào)控通路和癌癥關(guān)聯(lián)的microRNA網(wǎng)絡(luò)。見表1。

?正常肝組織(ID3222)；?HCC組織(ID2177)

圖7 CBX8相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

表1 CBX8相關(guān)蛋白參與的生理過程和富集通路

3 討論

3.1HCC是常見和病死率較高的惡性腫瘤之一，如何提高HCC患者的生存率仍是世界性的難題[13]。肝臟腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素影響的復(fù)雜過程，由許多癌癥相關(guān)基因、蛋白與信號通路參與完成[14]。癌基因的過度表達(dá)和抑癌基因的沉默會影響腫瘤的進(jìn)程。不少文獻(xiàn)[15，16]報道，CBX8基因在多種腫瘤中異常表達(dá)，且與患者預(yù)后具有相關(guān)性。目前對CBX8基因雖有初步了解，但其與肝癌的關(guān)系尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

3.2本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，探討腫瘤數(shù)據(jù)庫中CBX8基因表達(dá)與HCC的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC組織中的CBX8 mRNA水平和蛋白水平均高于正常肝組織，且CBX8基因的表達(dá)越高，患者總生存期越低。2015年Gao等[17]對PcG蛋白研究發(fā)現(xiàn)，CBX8蛋白作為PcG1的重要核心蛋白在HCC組織中表達(dá)水平顯著增加，且CBX8蛋白高表達(dá)患者的無病生存期和總存活期均顯著低于低表達(dá)患者，提示CBX8可作為預(yù)測HCC預(yù)后的因子。本研究進(jìn)一步對CBX8的表達(dá)水平與人口學(xué)特征的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示CBX8在HCC患者中的表達(dá)與性別、種族、年齡無顯著關(guān)聯(lián)性(P>0.05)，與體重顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。對CBX8在不同病理特征HCC患者中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBX8的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況關(guān)聯(lián)不顯著(P>0.05)，與TP53突變情況、腫瘤組織學(xué)分類、腫瘤分級顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。提示CBX8具有應(yīng)用于HCC的臨床診斷、病情進(jìn)展和療效監(jiān)測的潛在價值。

3.3通過對CBX8的突變情況分析，本研究發(fā)現(xiàn)CBX8在HCC中的主要堿基突變類型依次為C>T突變、G>A突變、G>T突變；其引起的密碼子改變主要為錯義突變，提示CBX8的這些突變可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

3.4本研究進(jìn)一步通過String數(shù)據(jù)庫對CBX8及其互作蛋白進(jìn)行挖掘，結(jié)果表明CBX8參與了細(xì)胞周期、組蛋白的調(diào)控、鋅指蛋白結(jié)合、PcG蛋白調(diào)控等生理過程。富集分析結(jié)果顯示，CBX8相關(guān)信號通路為干細(xì)胞多能性的信號調(diào)控通路和癌癥關(guān)聯(lián)的microRNA網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞周期通路的調(diào)控在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。DNA損傷和損傷后修復(fù)可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和失調(diào)，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生。Oza等[18]發(fā)現(xiàn)CBX8可通過PARP激活在DNA損傷修復(fù)中起作用。因此CBX8可能在DNA損傷反應(yīng)的表觀遺傳調(diào)控中起一定作用，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生、發(fā)展。另外，Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)CBX8可以通過激活A(yù)KT/β連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)HCC的生長和轉(zhuǎn)移。Xiao等[20]通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CBX8可能通過與YBX1結(jié)合而激活CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，以推進(jìn)肝癌惡化機(jī)制進(jìn)程。以上研究提示，CBX8可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期相關(guān)的基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而在肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。近期有研究[21]表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞中的CBX8表達(dá)下降可導(dǎo)致miRNA表達(dá)上調(diào)，且CBX8可充當(dāng)CBX7的同源蛋白發(fā)揮RNA結(jié)合功能，CBX8/miR-378a-3p/PDIA4途徑與結(jié)直腸癌惡化相關(guān)，提示該途徑具有成為治療靶標(biāo)的潛在價值。據(jù)此推測CBX8在HCC的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要的角色。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)分析的方法探討了CBX8在HCC組織中的表達(dá)水平及其與HCC預(yù)后的關(guān)系，預(yù)測了與CBX8相關(guān)的互作蛋白和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示CBX8可影響HCC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，并與預(yù)后相關(guān)。CBX8有望成為HCC新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為HCC的預(yù)防、診治和預(yù)后提供新思路和方向。