陳紅剛, 趙文龍, 晉 玲, 李 巖, 劉孜瀚, 杜 弢*
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 甘肅 蘭州 730000;2.甘肅百草中藥材種植有限公司, 甘肅 蘭州 730000)
紅花綠絨蒿(MeconopsispuniceaMaxim.)為罌粟科綠絨蒿屬草本植物,藏名“阿柏幾麻魯”,主要分布于青藏高原邊緣的四川西北部、西藏東北部、青海東南部和甘肅西南部海拔2 800~4 300 m的高山灌叢、林緣、山坡草甸[1]。紅花綠絨蒿具有清熱、鎮(zhèn)痛、降壓、止咳、利尿、固澀、解毒、抗菌等功效,作為傳統(tǒng)藏藥材,可治遺精、肺結(jié)核、肺炎、痛經(jīng)、白帶、高血壓等[2]。
紅花綠絨蒿目前基本為野生,其所處的生態(tài)環(huán)境脆弱,資源蘊(yùn)藏量有限。近年來,因生境退化、過度采集等自然環(huán)境和人為因素的影響,紅花綠絨蒿野生資源遭到嚴(yán)重破壞,面臨著枯竭的危險(xiǎn)[3]。1999年我國將紅花綠絨蒿列為國家二級(jí)瀕危保護(hù)植物[4-5]。由于紅花綠絨蒿種子具有休眠現(xiàn)象[6-7],自然萌發(fā)率低,目前尚無人工培育成功的報(bào)道。因此,本試驗(yàn)研究紅花綠絨蒿種子休眠特性,探索打破種子休眠、提高種子萌發(fā)率的方法,旨在為紅花綠絨蒿野生撫育及人工馴化栽培提供依據(jù)。
紅花綠絨蒿種子于2018年8月采自青海省久治縣隆格山野生植株,海拔4 317 m (100°51′12.96″ E,33°17′13.49″ N),由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為紅花綠絨蒿(MeconopsispuniceaMaxim.)種子,陰干后室溫儲(chǔ)存。
油菜(Brassicanapus)種子由蘭州市種子管理局提供。
1.2.1紅花綠絨蒿種子凈度、千粒重測(cè)定 參照GB/T3543對(duì)紅花綠絨蒿種子進(jìn)行凈度[8]、千粒重[9]的測(cè)定。
1.2.2紅花綠絨蒿種子吸水率的測(cè)定 隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子2份,每份1.0 g,1份不做處理(CK),1份用砂紙輕微打磨種皮,以不露出胚乳為宜,分別浸泡于蒸餾水中,在0,2,4,6,8,10,12,14 h取出種子用濾紙吸干種子表面水分,精密稱重(0.0001 g),重復(fù)3次[10-11]。按下列公式計(jì)算種子吸水率。
1.2.3紅花綠絨蒿種子抑制物提出及生物活性測(cè)驗(yàn)[12-14]隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子2份,每份5.0 g,分別用研缽磨碎,裝入100 mL的磨口錐形瓶中,分別加入10倍量的蒸餾水或80%乙醇,蓋瓶塞,置4℃冰箱中恒溫浸提24 h,5 000 r·min-1離心10 min后過濾,將殘?jiān)^續(xù)按相同方法浸提2次,合并3次浸提液,56℃條件下蒸干,加適量水溶解,定容至25 mL,即得0.20 g·mL-1的種子提取液(g·mL-1指每毫升溶液所含提取前紅花綠絨蒿種子的質(zhì)量)。
以0.20 g·mL-1的提取液為母液,配成0(CK),0.05,0.10,0.15,0.20 g·mL-1的提取液各10 mL,依次將各濃度提取液加入培養(yǎng)皿中,每個(gè)濃度處理3皿,每皿1.5 mL,再鋪2層濾紙于培養(yǎng)皿中,完成發(fā)芽床的制備。以油菜種子為生物活性測(cè)驗(yàn)材料,隨機(jī)選取油菜種子1500粒,隨機(jī)分成15份,每份100粒,播種于制備好的發(fā)芽床上,在恒溫20℃、光照12 h·d-1的條件下培養(yǎng),及時(shí)補(bǔ)充水分,24 h統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率,48 h統(tǒng)計(jì)根長。
1.2.4紅花綠絨蒿種子低溫沙藏 隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子2份,每份1.6 g,1份不做沙藏處理(4℃冰箱中保存),1份低溫沙藏。具體沙藏方法如下:將洗凈的河沙篩成粗沙(18目)和細(xì)沙(40目),經(jīng)高溫滅菌(121℃,30 min)后,在容器底部鋪粗沙3~5 cm,再鋪細(xì)沙5~10 cm,將稱好的紅花綠絨蒿種子用蒸餾水浸泡16 h后裝入紗布網(wǎng)袋中,平鋪于細(xì)沙上,再蓋細(xì)沙5~10 cm,沙子濕度為10%~12%,用保鮮膜封住容器,打孔透氣,將容器置于冰箱中。變溫程序?yàn)棰耠A段4~7℃沙藏30 d,Ⅱ階段0~4℃沙藏30 d,Ⅲ階段0℃沙藏30 d,Ⅳ階段-4~0℃沙藏30 d,沙藏結(jié)束后將紗布網(wǎng)袋從沙子中取出,倒出種子,于通風(fēng)處陰干后過篩,獲得干凈待測(cè)種子。
1.2.5紅花綠絨蒿種子結(jié)構(gòu)分析與胚率測(cè)定 隨機(jī)選取沙藏與未沙藏紅花綠絨蒿種子各10粒,蒸餾水浸泡16 h,OCT膠水包埋冷凍5 min(-20℃),Leica-CM1950型恒冷切片機(jī)切片(厚約0.15 mm),LeicaDM500顯微鏡觀察種子結(jié)構(gòu),測(cè)量胚率。計(jì)算公式如下:
1.2.6紅花綠絨蒿種子發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定 隨機(jī)選取沙藏與未沙藏紅花綠絨蒿種子各300粒,用0.1%的升汞消毒10 min,蒸餾水沖洗5次,播于沙床上(細(xì)沙2~3 mm),每皿播種50粒,6次重復(fù),以未沙藏種子為對(duì)照(CK),在10℃全黑暗條件下培養(yǎng),及時(shí)補(bǔ)足水分,計(jì)算發(fā)芽率,第7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)。計(jì)算公式如下:
1.2.7紅花綠絨蒿種子自然層積 隨機(jī)稱取風(fēng)干紅花綠絨蒿種子4份,每份5.0 g,1份于4℃冰箱中保存(CK),另外3份分別均勻鋪裝于孔徑0.8~1.0 mm的尼龍網(wǎng)袋中,埋藏在海拔3 491 m的紅花綠絨蒿野外適生區(qū),土壤濕度20%~40%,埋藏深度為處理Ⅰ(5 cm)、處理Ⅱ(10 cm)、處理Ⅲ(15 cm),埋藏時(shí)間150 d(第一年11月至翌年3月),取出后用蒸餾水將種子清洗干凈,按照1.2.6進(jìn)行種子發(fā)芽率測(cè)定。
1.2.8數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖,SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。
紅花綠絨蒿種子呈腎形,黑色或黃褐色(圖1),長和寬分別為2.02~3.28 mm和1.04~1.90 mm,千粒重0.7919 g,凈度96.84%。
由圖2可知,紅花綠絨蒿種子0~2 h吸水率急劇增大,4 h時(shí)達(dá)到最大吸水率且趨于穩(wěn)定,10 h之后達(dá)到飽和狀態(tài),未處理及磨損種皮的紅花綠絨蒿種子吸水規(guī)律一致,最大吸水率分別為83.25%和91.58%,吸水過程符合種子的一般吸水規(guī)律,表明種皮并不影響水分進(jìn)入紅花綠絨蒿種子內(nèi)部。
圖1 紅花綠絨蒿種子形態(tài)
圖2 紅花綠絨蒿種子吸水率
由圖3、圖4可知,油菜種子發(fā)芽率隨紅花綠絨蒿種子浸提液濃度的增大而降低,根長隨提取液濃度的增大而減小,當(dāng)提取液濃度達(dá)到0.15 g·mL-1時(shí),醇提液對(duì)油菜種子的發(fā)芽抑制率達(dá)到了100.00%,水提液對(duì)油菜種子發(fā)芽抑制率和根長抑制率分別達(dá)到91.33%和83.52%,各濃度水提液和醇提液對(duì)油菜種子發(fā)芽和胚根生長的抑制作用與對(duì)照(CK)均有顯著性差異(P<0.05)。說明紅花綠絨蒿種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì),對(duì)油菜種子發(fā)芽和胚根生長有抑制作用,且醇提物抑制作用強(qiáng)于水提物。
紅花綠絨蒿種子由種皮、胚、胚乳3部分組成,未沙藏種子的胚發(fā)育時(shí)期多處于球形或心形胚時(shí)期(圖5-a,5-b),胚率為23.30%,沙藏處理后種子的胚發(fā)育時(shí)期多處于子葉形胚時(shí)期(圖5-c),胚率為65.80%,與對(duì)照(CK)差異極顯著(P<0.01)。未沙藏的紅花綠絨蒿種子均不能發(fā)芽,沙藏處理后種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)有了顯著提高,分別達(dá)到50.00%和47.67%,與對(duì)照(CK)差異極顯著(P<0.01,圖6)。
圖3 紅花綠絨蒿種子提取物對(duì)油菜種子發(fā)芽的影響
圖4 紅花綠絨蒿種子提取物對(duì)油菜種子胚根生長的影響
由圖7可知,未處理的紅花綠絨蒿種子均不能發(fā)芽,野外自然層積可以提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì),處理Ⅰ(5 cm)、處理Ⅱ(10 cm)、處理Ⅲ(15 cm)較未處理(CK)均差異極顯著(P<0.01),且以埋藏深度為10 cm時(shí)效果最好,種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)分別達(dá)到63.34%和49.67%。
圖5 沙藏前后紅花綠絨蒿種子胚的形態(tài)
圖6 沙藏對(duì)紅花綠絨蒿種子胚率及發(fā)芽情況的影響
圖7 自然層積對(duì)紅花綠絨蒿種子發(fā)芽情況的影響
種子物理休眠是由種皮不透水層引起的一種休眠類型[15]。本研究中未處理及磨損種皮的紅花綠絨蒿種子吸水規(guī)律一致,浸泡4 h種子最大吸水率分別為 83.25%和91.58%,說明種皮對(duì)其萌發(fā)不造成透性障礙。種子內(nèi)部存在抑制物質(zhì)是種子休眠的主要原因之一[16]。紅花綠絨蒿種子水提液和醇提液對(duì)油菜種子發(fā)芽和胚根生長均有顯著抑制作用(P<0.05),說明紅花綠絨蒿種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì),具有生理休眠的特性[17],且醇提物抑制作用強(qiáng)于水提物。但是,內(nèi)源抑制物質(zhì)在休眠性種子中普遍存在,種類繁多[18],紅花綠絨蒿種子中存在的萌發(fā)抑制物質(zhì)類型還有待進(jìn)一步研究。
趙春香等[19]等研究表明低溫沙藏處理有利于銀杏(Ginkgobiloba)種子種胚增長。陳疏影等[20]研究指出,對(duì)深度休眠的滇重樓(Parispolyphyllavaryunnanensis)種子進(jìn)行層積處理,可使種子提前進(jìn)入形態(tài)及生理后熟,快速促進(jìn)胚的發(fā)育,提前解除種子的休眠期。紅花綠絨蒿種子經(jīng)低溫沙藏處理后,種子胚率由未處理時(shí)的23.30%增長到65.80%,種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)由不發(fā)芽上升到50.00%和47.67%,較對(duì)照(CK)顯著提高(P<0.01),說明紅花綠絨蒿具有形態(tài)休眠的特性[21],而低溫沙藏能使紅花綠絨蒿種子完成形態(tài)生理后熟,是打破紅花綠絨蒿種子休眠的有效方法。
休眠的種子可以在不適宜幼苗生長的情況下阻止種子萌發(fā),減少子代在惡劣環(huán)境萌發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),一定程度上保障了種群的延續(xù)[22]。紅花綠絨蒿作為珍稀瀕危的藏藥資源,主要分布于自然環(huán)境惡劣的青藏高原地區(qū),為了適應(yīng)該地區(qū)的自然環(huán)境及延續(xù)種群,種子需完成對(duì)青藏高原地區(qū)環(huán)境因素的響應(yīng)才能萌發(fā)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)在紅花綠絨蒿野外適生區(qū)進(jìn)行自然層積是解決種子休眠的有效方法,閆芳等[24]在黃瑞香(Daphnegiraldii)種子上也有類似發(fā)現(xiàn),而通過模擬紅花綠絨蒿野外適生區(qū)地下10 cm處土壤溫度及濕度條件對(duì)種子進(jìn)行層積處理的方法,也為解決該地區(qū)同類植物種子的休眠問題提供了參考。
紅花綠絨蒿種子由種皮、胚、胚乳3部分組成,種胚未發(fā)育成熟,種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì),種皮對(duì)其萌發(fā)不造成透性障礙。根據(jù)Baskin對(duì)種子休眠的分類,紅花綠絨蒿種子休眠類型為深度復(fù)雜形態(tài)生理休眠(deep complex,MPD)[25]。低溫層積是破除紅花綠絨蒿種子休眠的有效方法。