吳 棒， 胡習(xí)樂， 陳國榮

（華東理工大學(xué)結(jié)構(gòu)可控先進(jìn)功能材料及其制備教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，費(fèi)林加諾貝爾獎(jiǎng)科學(xué)家聯(lián)合研究中心，上海 200237）

細(xì)菌耐藥性如今已呈現(xiàn)出愈發(fā)多樣化和頑固化的趨勢，這為細(xì)菌的臨床治療帶來了大量新的威脅和挑戰(zhàn)[1-3]。近年來，具有抗菌藥物載體性能和功能性抗菌活性的新一代材料實(shí)現(xiàn)了光動力/光熱效應(yīng)協(xié)同傳統(tǒng)抗生素的協(xié)同抗菌效果[4-6]。光動力治療（Photodynamic Therapy, PDT）中的光敏劑分子與抗生素藥物一樣具有共軛化學(xué)結(jié)構(gòu)，能負(fù)載在自組裝體系表面，通過特定波長光的敏化作用激活周邊環(huán)境中的氧，激活后的高能態(tài)氧通常被稱為活性氧簇（Reactive Oxygen Species, ROS），由于其強(qiáng)氧化性和高能態(tài)毒性，能有效殺傷細(xì)菌。相比于傳統(tǒng)藥物治療方法，PDT 往往不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，也大大減少了對宿主組織的損傷[7-9]。然而，單獨(dú)使用光敏劑進(jìn)行PDT 的劣勢在于ROS 半衰期較短，導(dǎo)致ROS易在環(huán)境中耗散，因而達(dá)不到很好的抗菌效果。出于這一原因，在構(gòu)建光敏治療載體時(shí)常常需要將光敏劑負(fù)載在材料體系表面并與少量的抗生素類藥物協(xié)同作用[10-11]。功能化的石墨烯納米材料作為藥物載體已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用[12]，負(fù)載小分子的材料能夠控釋或緩釋光敏藥物以及傳統(tǒng)的抗生素藥物，從而使得所有治療分子靶向簇集在患處。

二維片層二硫化鉬（MoS2）是一種具有易制備、易分散、穩(wěn)定性好、負(fù)載載體能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的材料[13-14]。熒光團(tuán)苝酰亞胺（Perylenediimide, PDI）是常用的光敏劑，PDI 在光輻射下可顯著產(chǎn)生ROS 從而實(shí)現(xiàn)PDT，且該化合物的熒光特性也可進(jìn)一步被應(yīng)用于疾病的光學(xué)診斷[15-16]。然而，外源性的光敏劑及功能材料往往對于人體組織有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性和促炎作用。因此，提升材料的生物相容性十分重要。糖基是能夠顯著改善材料親水性的基團(tuán)，還是生物體自身具有的不可或缺的生物分子。糖基的引入能降低細(xì)胞毒性和提高材料的生物相容性。更為特異的是，糖基同時(shí)還能夠作為常見的生物靶向識別基團(tuán)以此來識別特定凝集素。有些細(xì)菌也和細(xì)胞同樣，能夠特異性分泌某種凝集素或蛋白而被特定糖所靶向識別[17-18]。例如，半乳糖基能夠特異性結(jié)合綠膿桿菌表面凝集素從而識別綠膿桿菌。此外研究還發(fā)現(xiàn)，小分子的糖基自身對細(xì)菌的識別能力較弱，往往需要聚集起來形成糖簇結(jié)構(gòu)，才能提高糖對細(xì)菌的識別效果[19]。

本文探究兩種分別修飾了半乳糖基以及甘露糖基的不同糖型PDI 糖綴合物，通過π-π 堆疊作用，兩種PDI 糖綴合物被負(fù)載在片層MoS2上構(gòu)建了糖簇自組裝體系，以此構(gòu)建靶向綠膿桿菌的半乳糖光動力抗菌體系，同時(shí)甘露糖的體系作為參照被證明無明顯的綠膿桿菌靶向性。二硫化鉬材料表面還能夠進(jìn)一步負(fù)載少量抗生素分子，在PDI 實(shí)現(xiàn)靶向光動力抗菌的同時(shí)實(shí)現(xiàn)協(xié)同釋藥。該載藥光動力抗菌自組裝體系的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了光動力治療協(xié)同抗生素的抗菌效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

綠膿桿菌（ATCC27853）購自北京中原公司，半乳糖基苝酰亞胺化合物（PDI-Gal4）和甘露糖基苝酰亞胺化合物（PDI-Man6）為已知化合物[20]。二硫化鉬粉末（純度99%）購于上海百靈威有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺購于無錫凈化設(shè)備廠；Centrifuge5415D臺式離心機(jī)購于Eppendorf 公司；電子天平購于上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器購于上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱購于OLYMPUS公司；超低溫冰箱購于SANYO 公司；恒溫?fù)u床購于Forma Scentific 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 二硫化鉬分散溶液的制備 實(shí)驗(yàn)中使用二硫化鉬的粉末作為原料，通過超聲、凍干等步驟制備得到單層或少層的二硫化鉬材料：向25 mL 的棕色玻璃瓶中加入20 mL 的乙醇和超純水混合溶液（體積比為1∶1），然后加入100 mg 的二硫化鉬粉末，攪拌均勻后放入超聲清洗儀中，冰浴條件下（控制溫度在20 °C左右）超聲12 h（功率為100 Hz），得到混合的懸浮液。使用離心機(jī)對懸浮液進(jìn)行離心12 min，使用移液槍吸取離心后的上層溶液，凍干機(jī)凍干過夜，最終得到10 mg 粉末狀的二硫化鉬（產(chǎn)率為10%），將其溶于去離子水中，超聲30 min 得到二硫化鉬分散液。

1.3.2 化合物PDI-Gal4/PDI-Man6與二硫化鉬的自組裝 糖基苝酰亞胺PDI-Gal4/PDI-Man6化合物的結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

負(fù)載頭孢他啶體系的構(gòu)建步驟：取1 mL40μmol/L的PDI-Gal4或PDI-Man6與1 mL100μg/mL 的 二 硫化鉬分散溶液分別置入5 mL 的棕色瓶中，放入超聲清洗儀中超聲30 min，得到二硫化鉬與糖基化合物的自組裝體系PDI-Gal4@MoS2或PDI-Man6@MoS2。進(jìn)一步向自組裝體系中加入256 μg/mL 頭孢他啶（Ceftazidime, CAZ）溶液，攪拌12 h 后，離心除去未負(fù)載的藥物，將底部離心物重新溶于緩沖液中，得到負(fù)載頭孢他啶的抗菌體系PDI-Gal4@MoS2@CAZ 或PDI-Man6@MoS2@CAZ。采用動態(tài)光散射分析（DLS）和紫外-可見光譜分析（UV-Vis）驗(yàn)證苝酰亞胺分子與二硫化鉬之間是否實(shí)現(xiàn)成功自組裝。

1.3.3 細(xì)菌培養(yǎng) 將LB（Luria Bertani）固相培養(yǎng)基培養(yǎng)的綠膿桿菌（ATCC27853）單菌落挑出，接種到1 mL LB 液體培養(yǎng)基中，設(shè)定搖床溫度為37 °C 并搖晃12 h 過夜待菌液完全渾濁。將菌液用LB 液體培養(yǎng)基稀釋至每毫升106個(gè)細(xì)胞的濃度。

圖1PDI-Gal4 和PDI-Man6 的結(jié)構(gòu)Fig.1Structures of compound PDI-Gal4 and PDI-Man6

1.3.4 自由基的檢測 糖基PDI 分子中的PDI 母核是有效的光敏劑，在白光的光照下能釋放ROS 以此殺滅細(xì)菌。二氫羅丹明123（DHR123）是一種自由基捕獲劑，其本身沒有顯著的熒光，但卻能夠在ROS 存在下被氧化產(chǎn)生熒光性羅丹明分子，從而顯示出熒光，利用這種特性檢測了在梯度時(shí)間光照下不同體系溶液中的ROS 釋放，以此驗(yàn)證不同體系的光敏化作用。

1.3.5 抗菌活性的測試 抗菌活性測試的組別共有：空白組、CAZ 組、PDI-Man6@CAZ 組、PDI-Man6@MoS2@CAZ 組、PDI-Gal4@CAZ 組、PDI-Gal4@MoS2@CAZ組?？瞻捉M是在96 孔板的一排8 個(gè)孔中加入LB 培養(yǎng)基中的綠膿桿菌菌液（濃度為每毫升菌液有106個(gè)細(xì)胞，下同）。CAZ 組是在LB 菌液的1 排8 個(gè)孔中分別加入質(zhì)量濃度為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL 的CAZ，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。PDI-Man6@CAZ組是在LB 菌液的1 排8 個(gè)孔中各自加入20 μmol/L的PDI-Man6和質(zhì)量濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL 的CAZ，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。PDI-Man6@MoS2@CAZ 組是在含有LB 菌液的1 排8 個(gè)孔中先加入PDI-Man6@MoS2自組裝體系，其中PDI-Man6濃度為20 μmol/L，MoS2質(zhì)量濃度為50 μg/mL，然后分別加入質(zhì)量濃度為128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL的CAZ，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍以驗(yàn)證準(zhǔn)確性。對于半乳糖體系的PDI-Gal4@CAZ 組和PDI-Gal4@MoS2@CAZ 組，實(shí)驗(yàn)方法與用量分別與PDI-Man6@CAZ 組和PDI-Man6@MoS2@CAZ 組相同。

材料制備完成后，若需光照則在白光下光照40 min，若不需要光照則置于暗處，之后將孔板置于培養(yǎng)箱中，37 °C 下培養(yǎng)18 h 過夜，最后觀察最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。

圖2片層MoS2 和PDI-Gal4（a）與PDI-Man6（b）自組裝前后的粒徑變化Fig.2Particle size change before and after self-assemblies of MoS2 complex with PDI-Gal4（a）and PDI-Man6（b）

1.3.6 抗菌性能的表征 通過π-π 堆疊作用，分別將PDI-Gal4和PDI-Man6與二硫化鉬片層自組裝構(gòu)成PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2，然后將CAZ 進(jìn)一步負(fù)載到材料表面構(gòu)成PDI-Gal4@MoS2@CAZ 與PDI-Man6@MoS2@CAZ。利用白光光照條件下基于PDI 母核的抗菌材料體系在載入MoS2前后的自由基釋放性能驗(yàn)證了材料的光動力殺菌活性。利用PDIGal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2對于CAZ 的負(fù)載率驗(yàn)證了材料負(fù)載藥物的能力；最后為驗(yàn)證本文所構(gòu)建的所有體系的抗菌效果，利用綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、單獨(dú)的抗生素及自組裝體系作為抗菌對照組，檢驗(yàn)了白光光照下PDI-Gal4@MoS2@CAZ 及PDI-Man6@MoS2@CAZ 體系的MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系的構(gòu)建

由DLS 實(shí)驗(yàn)分析可以看出，由于π-π 堆疊作用，PDI-Gal4和PDI-Man6與二硫化鉬自組裝構(gòu)建為PDIGal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2后，相較于單獨(dú)的二硫化鉬材料，自組裝后體系的粒徑增大（圖2）。同時(shí)在UV-Vis 光譜分析中，化合物PDI-Gal4和PDI-Man6的紫外吸收信號在組裝成為PDI-Gal4@MoS2和PDIMan6@MoS2體系之后，紫外吸收峰分別在594 nm 和596 nm 處發(fā)生了4～5 nm 左右的紅移，并伴隨有微小的紫外吸收強(qiáng)度提升（圖3），說明苝酰亞胺糖綴合物與二硫化鉬材料之間通過π-π 堆疊發(fā)生了自組裝[21]。

2.2 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系的ROS釋放

圖3PDI-Gal4（a）和PDI-Man6（b）與MoS2 組裝前后的紫外-可見吸收光譜變化Fig.3Ultraviolet-visible absorption spectroscopy analysis of MoS2 complex with PDI-Gal4（a）and PDI-Man6（b）

圖4空白PBS（a），PDI-Gal4（b）和PDI-Gal4@MoS2（c）在白光光照下ROS 釋放以及ROS 釋放量與光照時(shí)間的線性關(guān)系（d）Fig.4ROS release of PBS blank (a), PDI-Gal4 (b), PDI-Gal4 @ MoS2 (c) under white light illumination and linear relationship between ROS release and light time (d)

組裝體系的ROS 釋放的結(jié)果如圖4 和圖5 所示。根據(jù)梯度光照下的熒光信號變化能夠發(fā)現(xiàn)，空白的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）不會釋放ROS，而單獨(dú)的PDI-Gal4、PDI-Man6以及自組裝后的PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2體系則都具有顯著而穩(wěn)定的光敏化產(chǎn)生ROS 的效應(yīng)（圖4 和圖5）。值得注意的是，根據(jù)熒光譜圖變化對比和定量計(jì)算觀察到，當(dāng)PDI-Gal4和PDI-Man6與片層二硫化鉬自組裝之后，PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2的ROS 釋 放 量比起單獨(dú)游離的PDI-Gal4和PDI-Man6分子有所提高，表明了二維材料的負(fù)載也能夠一定程度提升苝酰亞胺的PDT 釋放ROS 的效果（圖4(d)，圖5(d)）。

2.3 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系對于頭孢他啶的負(fù)載能力

實(shí)驗(yàn)中CAZ 藥物被載入PDI-Gal4@MoS2和PDIMan6@MoS2體系后，分別測定了其藥物負(fù)載能力。未負(fù)載藥物總量可以通過測定PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2上清液中游離藥物的UV-Vis 吸收值和單體MoS2載藥體系的空白對照計(jì)算得到。自組裝體系的載藥率=（藥物總量?未負(fù)載藥量）/藥物總量×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自組裝體系PDI-Gal4@MoS2和PDI-Man6@MoS2具有優(yōu)良的負(fù)載抗生素頭孢他啶的性能（圖6）。

圖5空白PBS 體系（a），PDI-Man6 體系（b）和PDI-Man6@MoS2 體系（c）的白光光照下ROS 釋放以及ROS 釋放量與光照時(shí)間之間的線性關(guān)系（d）Fig.5ROS release of PBS blank (a), PDI-Man6 (b) and PDI-Man6@MoS2 (c) under white light illumination and linear relationship between ROS release and light time (d)

圖6MoS2、PDI-Gal4@MoS2 和PDI-Man6@MoS2 對于藥物CAZ 的負(fù)載率（a）和負(fù)載量（b）Fig.6Loading rates (a) and loading quantification (b) of MoS2, PDI-Gal4 @ MoS2 and PDI-Man6 @ MoS2 to drug CAZ

2.4 糖基苝酰亞胺與二硫化鉬自組裝體系的抗菌活性

PDI-Gal4@MoS2@CAZ 和PDI-Man6@MoS2@CAZ 對于綠膿桿菌的抗菌活性被進(jìn)一步評價(jià)，結(jié)果表明，甘露糖體系作為參照組，半乳糖體系對綠膿桿菌具有靶向性。利用綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，實(shí)驗(yàn)中分別測定了單獨(dú)抗生素藥物CAZ 和負(fù)載抗生素的PDI-Gal4@MoS2@CAZ 和 PDI-Man6@MoS2@CAZ 抗菌體系在有無白光照射條件下的抗綠膿桿菌的活性（MIC），以驗(yàn)證載藥體系的光動力協(xié)同藥物抗菌活性的強(qiáng)化效果，結(jié)果如表1 所示。從抗菌活性MIC 結(jié)果可以看出，單獨(dú)的CAZ 作為傳統(tǒng)抗生素藥物對于細(xì)菌有穩(wěn)定抑制效果，并且藥物的作用是不受到外界光源的影響的。在CAZ 與PDI-Man6組裝形成載藥體系后，在非光照條件下，載藥體系并未產(chǎn)生對細(xì)菌的增效殺傷效果，在白光光照下，PDI 化合物產(chǎn)生的ROS 能夠協(xié)同負(fù)載的藥物增強(qiáng)治療效果，卻并未有明顯靶向增效性；在引入二硫化鉬材料構(gòu)建形成的抗菌體系PDI-Man6@MoS2@CAZ 中，藥物在二硫化鉬表面的裝載起到了藥物遞送的作用，在非光照條件下表現(xiàn)出抗菌增效效果，在白光光照下，PDIMan6@MoS2@CAZ 體系將CAZ 原先對于綠膿桿菌的MIC 從32 μg/mL 降低到8 μg/mL，抗菌能力提升了3 倍?；诎肴樘腔w系中的半乳糖基能夠靶向綠膿桿菌表面分泌的蛋白LecA，實(shí)驗(yàn)中觀察到在非光照條件下，CAZ 與PDI-Gal4自組裝載藥體系對于綠膿桿菌的靶向效果便已經(jīng)初步體現(xiàn)。在白光光照下，即便未與二硫化鉬材料自組裝，PDI-Gal4與CAZ的復(fù)合體系借助半乳糖基的靶向性將體系中CAZ 對于綠膿桿菌的MIC 顯著降低到2 μg/mL，該結(jié)果明顯區(qū)別于沒有靶向性的PDI-Man6@CAZ 體系。負(fù)載抗生素的PDI-Gal4@MoS2@CAZ 體系在非光照條件下的靶向效果與游離態(tài)PDI-Gal4@CAZ 相似，在白光光照下，半乳糖基對綠膿桿菌的靶向作用促使藥物的高選擇性低損耗的裝載，完成敏化ROS 和藥物的全方位菌內(nèi)釋放，使得PDI-Gal4@MoS2@CAZ體系將CAZ 原先對于綠膿桿菌的MIC 從32 μg/mL 降低到1 μg/mL（表1）。我們通過自組裝體系攜帶抗生素，大幅度提高了抗生素 CAZ 殺滅綠膿桿菌的效果，將其抗菌能力提升了31 倍，表現(xiàn)出明顯的增效效果。

表1CAZ 聯(lián)合自組裝體系對于綠膿桿菌（ATCC27853）的MICTable1Determination of MIC of CAZ combined self-assembly system treatment for P. aeruginosa (ATCC27853)

3 結(jié) 論

為有效治療綠膿桿菌并且減少細(xì)菌的抗生素耐藥性，利用菲酰亞胺熒光母核及二維材料的光動力性質(zhì)，將兩種分別帶有半乳糖糖基或甘露糖殘基的菲酰亞胺分子通過π-π 堆疊作用負(fù)載在具有優(yōu)異物理性能的二維片層二硫化鉬材料表面，并同時(shí)負(fù)載抗生素CAZ，構(gòu)建了具有優(yōu)良抗菌活性的載藥光動力抗菌體系PDI-Gal4@MoS2@CAZ 和PDI-Man6@MoS2@CAZ。進(jìn)一步在分子水平綜合評價(jià)了抗菌體系光照下的活性氧簇釋放性能和自組裝體系的載藥性能。最后，使用綠膿桿菌的菌液，采用最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)評價(jià)了構(gòu)建體系的抗菌性能，發(fā)現(xiàn) PDIGal4@MoS2@CAZ 在白光照射下對于綠膿桿菌的高效靶向抗菌活性非常顯著。半乳糖基的引入，不僅為抗菌材料提供了靶向基團(tuán)，使之能夠靶向表面具有特異性凝集素的綠膿桿菌，也進(jìn)一步提升了基于二維材料體系的生物相容性。本文工作為開發(fā)一類具有生物靶向性、高生物相容性等優(yōu)勢的抗菌材料提供了新的方向，也為能夠避免抗生素的使用，完全借助材料的光學(xué)性能來實(shí)現(xiàn)抗菌效果的自組裝體系的構(gòu)建提供研究基礎(chǔ)。

致 謝：本研究得到了法國里昂第一大學(xué)Sébastien Vidal 教授的大力支持與幫助!