劉閔豪 李 龍 葉 靖 周軒轅 李周岐 范睿深 徐郡儡

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100)

杜仲(Eucommiaulmoides)是我國特有的以藥用為主且具有其他多種用途的植物。杜仲樹皮為傳統(tǒng)中藥材，其主要藥用成分為環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯基丙烷、多糖、氨基酸、其他萜類和脂肪族(張京京等， 2014)。此外，杜仲樹皮、樹葉及果實中含有杜仲膠(反式聚異戊二烯)，能夠廣泛應(yīng)用于電器工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和電訊器材工業(yè)中，擁有巨大的潛力。杜仲具有極高的開發(fā)利用價值，基因功能研究是其資源開發(fā)中一項十分重要的基礎(chǔ)性工作，以往人們對于藥用成分與杜仲膠合成途徑的基因研究具有高度的熱情，這使得杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因的研究受到了忽視。2018年，杜仲首個全基因測序完成(Wuyunetal.， 2018)，標(biāo)志著杜仲基因研究進(jìn)入了一個新的階段。利用杜仲全基因組測序數(shù)據(jù)，研究杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因家族，能夠彌補杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因研究的不足，為杜仲的基因挖掘與物種特性研究奠定基礎(chǔ)。

生長素(auxin, Aux)在植物中最主要的成分為吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)，是發(fā)現(xiàn)的第1種促進(jìn)植物生長的植物激素。生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制著植物各器官和組織對生長素的反應(yīng)，在生長素對植物生長的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

生長素響應(yīng)因子(auxin response factors, ARF)是生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其能夠特異地結(jié)合生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的生長素響應(yīng)原件(auxin response element, AuxRE)TGTCTC序列，調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，從而能夠與多種途徑的激素信號協(xié)同作用(Hagenetal.， 2002)。ARF蛋白一般由3部分組成： N端B3型DNA結(jié)合區(qū)域(DNA-binding domain，DBD)、響應(yīng)生長素應(yīng)答的中間區(qū)域(middle region，MR)和C末端二聚化結(jié)構(gòu)區(qū)域(C-terminal domain，CTD)(Tiwari， 2003)。ARF基因家族成員眾多，表達(dá)模式復(fù)雜。目前的研究表明，大多數(shù)ARF基因?qū)Νh(huán)境因子的反應(yīng)較弱，其表達(dá)受microRNAs和反式作用siRNA(ta-siRNA)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(Liuetal.， 2011a)；并且發(fā)現(xiàn)了擬南芥(Arabidopsisthaliana)中microRNA167(miR167)靶向ARF6和ARF8(Wangetal.， 2015)， microRNA160(miR160)靶向ARF10、ARF16和ARF17(Linetal.， 2015)， TAS3 ta-siRNAs靶向ARF2、ARF3和ARF4(Williamsetal.， 2005)。

近年來，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄信息的不斷完善，越來越多的植物物種進(jìn)行了ARF的相關(guān)研究，在模式植物和作物中的研究比較深入，包括擬南芥(Okushimaetal.， 2005)、水稻(Oryzasativa)(Wangetal.， 2007)、玉米(Zeamays)(Xingetal.， 2011)、大麥(Hordeumvulgare)(Huseyin， 2018)和番茄(Solanumlycopersicum)(Wuetal.， 2011)等。由于木本植物基因組比較復(fù)雜，只有部分果樹和用材樹種鑒定過ARF基因，主要有蘋果(Malusdomestica)(Luoetal.， 2014)、甜橙(Citrussinensis)(Lietal.， 2015)、葡萄(Vitisvinifera)(Wanetal.， 2014)、毛果楊(Populustrichocarpa)(Kallurietal.， 2007)和巨桉(Eucalyptusgrandis)(Hongetal.， 2014)等。

本研究從杜仲全基因組測序數(shù)據(jù)中鑒定杜仲ARF基因家族全體成員，并從杜仲microRNA測序數(shù)據(jù)中獲取杜仲的miR160與miR167序列，利用生物信息學(xué)方法對杜仲ARF基因家族成員進(jìn)行分析，了解其基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和miR160/167的調(diào)控預(yù)測等。同時利用杜仲轉(zhuǎn)錄本全長數(shù)據(jù)測序結(jié)果，分析杜仲ARF基因家族成員在葉片各生長發(fā)育時期的表達(dá)水平，再通過實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法分析杜仲ARF基因家族成員與miR160/167在杜仲不同發(fā)育時期的根、莖、葉中的表達(dá)量，分析ARF基因家族成員的時空表達(dá)模式和miR160/167的調(diào)控模式，初步預(yù)測其功能。本研究為EuARF基因的進(jìn)一步功能研究奠定了基礎(chǔ)，彌補了杜仲生長發(fā)育相關(guān)基因研究的不足。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試的植物材料為西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院實驗苗圃(108.4°E，34.2°N)種植的杜仲優(yōu)良品種雜交后代。于6月選取4年生同一親本的雜交后代，混合采集其幼嫩葉片、成熟葉片、幼嫩莖段、成熟莖段、幼嫩根及成熟根，采摘后立即凍存到液氮中，隨后帶回實驗室，并轉(zhuǎn)存到-80 ℃冰箱中備用。所有樣品均為3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 杜仲ARF基因家族的鑒定 從基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站Genome Warehouse下載發(fā)布的杜仲基因組測序數(shù)據(jù)(http:∥bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/13/show)，構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫。以ARF結(jié)構(gòu)域(PF06507)蛋白序列、擬南芥的AtARF蛋白序列以及水稻的OsARF蛋白序列為模板對基因組測序數(shù)據(jù)的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地BlastP比對搜索，初步篩選出E≤10-5的蛋白序列為假定的EuARF蛋白。對這些假定的EuARF蛋白，使用SMART (http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線分析工具鑒定蛋白的保守序列，刪除不含ARF蛋白特征結(jié)構(gòu)域和特征結(jié)構(gòu)域置信度低的基因。

1.3 杜仲ARF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 使用ClustalX軟件對篩選出來的杜仲ARF基因家族蛋白與下載的擬南芥的AtARF蛋白序列、水稻的OsARF蛋白序列、歐美楊(Populus×euramericana)的PeARF蛋白序列進(jìn)行多序列比對，蛋白序列均下載自PlantTFDB。比對結(jié)果使用 MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，構(gòu)建采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)，自展值(bootstrap)設(shè)定為1 000。根據(jù)最后的進(jìn)化樹，將鑒定出的杜仲ARF基因家族按照與擬南芥AtARF基因家族比對結(jié)果的相似性進(jìn)行命名。

1.4 杜仲ARF基因家族的生物信息學(xué)分析 使用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(GSDS2.0)網(wǎng)站(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)比較每個EuARF基因的cDNA序列與基因組序列，生成其外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。使用ProtParam在線軟件(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析鑒定出的EuARF蛋白的理化性質(zhì)。利用MEME工具5.0.3版(http:∥meme-suite.org/tools/meme)分析EuARF蛋白的保守基序，預(yù)測的基序長度設(shè)為6～200個氨基酸，基序數(shù)量設(shè)為20，分布設(shè)為每個序列出現(xiàn)1次。

1.5 miRNA靶基因結(jié)合位點預(yù)測 使用本地Blastn對前期研究獲得的杜仲miRNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，篩選杜仲miR160/167。使用RNAhybrid在線工具(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)對eu-miR160/167和EuARFs的cDNA序列進(jìn)行分析，預(yù)測可能的靶基因以及結(jié)合位點。

1.6EuARFs基因表達(dá)分析 利用前期研究獲得的杜仲轉(zhuǎn)錄本全長數(shù)據(jù)庫(測序使用4組生長時期葉片樣本，分別為葉芽、3 cm長的生長葉、新的完全展開的幼葉和完全展開后30天的成熟葉，每組3個生物學(xué)重復(fù))檢索EuARFs的FPKM(fragments per kilobase million)值，使用HemI 1.0軟件分析EuARFs在葉片生長過程中的表達(dá)譜。采用qRT-PCR方法分析EuARFs與eu-miR160s/miR167s在不同發(fā)育階段(幼嫩和成熟)不同器官(根、莖、葉)中的表達(dá)量，從而驗證EuARFs在葉片中的表達(dá)模式，初步分析EuARFs在根與莖中的表達(dá)模式，預(yù)測eu-miR160s/miR167s對EuARFs的調(diào)控作用。

1.7 RNA的提取與qRT-PCR的具體方法 使用Trizol法(Ambion, https:∥www.thermofisher.com/)提取樣品中的總RNA，并使用TAKARA(TaKaRa, http:∥www.takara-bio.com/)的RNase-free DNase處理去掉殘留的DNA。

對各樣品的RNA使用TAKARA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，其中eu-miR160s/miR167s的反轉(zhuǎn)錄使用莖環(huán)法，莖環(huán)引物見表1。使用TAKARA的熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR試驗，內(nèi)參基因選擇為EuUBC(基因登錄號為： MH890470)(Yeetal.， 2018)，采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。從EuARFs的保守區(qū)域設(shè)計用于qRT-PCR的引物，使用稀釋了1、5、25、125和625倍的幼嫩葉片cDNA溶液進(jìn)行每個引物的qRT-PCR試驗，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)擴(kuò)增效率對引物進(jìn)行篩選，最后獲得的引物見表2。eu-miR160/167的qRT-PCR使用的反向引物為通用引物，正向引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 EuARF蛋白的鑒定及理化性質(zhì) 經(jīng)過轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)本地BlastP比對和SMART保守結(jié)構(gòu)域分析后，共鑒定出18個杜仲ARF蛋白序列，通過生物信息學(xué)進(jìn)一步驗證獲得的EuARF蛋白的基本信息和理化性質(zhì)(表3)。所有EuARF蛋白均含有DBD與ARF結(jié)構(gòu)域，為真正的ARF蛋白，大部分EuARF蛋白含有CTD結(jié)構(gòu)域，不含CTD結(jié)構(gòu)域的EuARF蛋白為EuARF3.1、EuARF3.2、EuARF8.2、EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16 和EuARF17； EuARF蛋白的長度為273(EuARF8.2)～1 062個(EuARF19.1)氨基酸，預(yù)測的分子質(zhì)量為30.64～117.90 kDa； 理論等電點(pI)為5.36(EuARF10.2)～9.68(EuARF8.2)，其中16個EuARF蛋白的等電點都小于7，呈弱酸性，在酸性細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用，僅有EuARF2.1和EuARF8.2的等電點大于7，呈堿性。

表1 eu-miR160s/eu-miR167s的序列與引物

表2 EuARFs基因的引物

2.2 EuARF蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化 利用鄰接法(NJ)構(gòu)建了擬南芥、水稻、歐美楊和杜仲ARF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖1)，可以將18個EuARFs分到5個亞族。EuARF3.1、EuARF3.2和EuARF4屬于Ⅰ亞族(AtARF3/4同源)，EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17屬于Ⅱ亞族(AtARF10/16/17同源)，EuARF1、EuARF2.1、EuARF2.2、EuARF9和EuARF18屬于Ⅲ亞族(AtARF1/2同源)，EuARF6.1、EuARF6.2、EuARF8.1和EuARF8.2屬于Ⅴ亞族(AtARF6/8同源)，EuARF19.1和EuARF19.2為Ⅵ亞族(AtARF7/19同源)，EuARF蛋白中沒有Ⅳ亞族蛋白(AtARF5同源)。

從進(jìn)化樹的分支上來看，在Ⅰ亞族和Ⅵ亞族中，EuARFs蛋白與PeARFs的親緣關(guān)系較近； 在Ⅱ亞族和Ⅴ亞族中，EuARFs蛋白與OsARFs和AtARFs的親緣關(guān)系更近； 而在Ⅲ亞族中，EuARF2.1蛋白與AtARF2親緣關(guān)系較近，EuARF9、EuARF18與PeARF9、PeARF18親緣關(guān)系更接近。

2.3 EuARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和基序 SMART分析的EuARF蛋白保守結(jié)構(gòu)域以及meme分析的保守基序結(jié)果如圖2所示，圖2a是根據(jù)多重序列比較構(gòu)建的18個EuARF蛋白的進(jìn)化樹，以方便比較各ARF亞族的保守結(jié)構(gòu)域和基序特征。保守結(jié)構(gòu)域分析(表3，圖2b)表明大多數(shù)EuARF蛋白都包含3個結(jié)構(gòu)域(DBD、ARF和CTD)，而EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16、EuARF17、EuARF3.1、EuARF3.2和EuARF8.2不含CTD結(jié)構(gòu)域，其中EuARF3.1、EuARF3.2屬于Ⅰ亞族，EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17屬于Ⅱ亞族。比較其基序(圖2c)發(fā)現(xiàn)，DBD結(jié)構(gòu)域由Motif 1、2、9和11組成，ARF結(jié)構(gòu)域由Motif 5、6和13或Motif 5、6和19組成，而CTD結(jié)構(gòu)域由Motif 7和10組成，每個基序的氨基酸組成如圖2d所示。

表3 杜仲ARF基因家族基本信息①

圖1 ARF基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖2 EuARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與基序

2.4EuARF基因結(jié)構(gòu) 通過比較EuARF基因的cDNA序列和基因組序列，可以獲得EuARF基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖3)，其中圖3a是根據(jù)多重序列比較構(gòu)建的18個EuARF蛋白的進(jìn)化樹，以方便將基因結(jié)構(gòu)分為亞族比較。從基因結(jié)構(gòu)中可以看出EuARF基因均含有2個或2個以上的外顯子，同一亞族的EuARF基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)比較相似，例如第Ⅱ亞族的EuARF基因只有2或3個外顯子，而其他亞族EuARF基因的外顯子更多。

圖3 EuARF基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

2.5EuARF基因受miR160/167調(diào)控的靶位點 在前期研究獲得的杜仲miRNA測序數(shù)據(jù)中共鑒定到4條miR160/167，命名為eu-miRNA160d、eu-miRNA160f、eu-miRNA167a和eu-miRNA167d，eu-miR160/167的序列見表1。RNAhybrid靶位點預(yù)測的結(jié)果(圖4)顯示EuARF基因家族中有7個基因受到eu-miR160/eu-miR167的調(diào)控，其中eu-miR160s調(diào)控Ⅱ亞族的EuARFs(EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17)，eu-miR167s調(diào)控Ⅴ亞族的EuARFs(EuARF6.1、EuARF6.2和EuARF8.1)，該結(jié)果與擬南芥中miRNA對AtARFs的調(diào)控情況相同(Wangetal.， 2015； Linetal.， 2015)。

2.6EuARFs和eu-miR160s/167s的表達(dá)模式 在前期研究中，本課題組通過單分子測序獲得了杜仲葉片不同生長時期的轉(zhuǎn)錄本全長數(shù)據(jù)。4個不同生長時期的葉片分別為葉芽(L1)、生長葉(3 cm長，L2)、幼葉(新的完全展開的葉，L3)和老葉(完全展開后30天，L4)。在轉(zhuǎn)錄本全長序列數(shù)據(jù)中共檢索到17個EuARF基因的FPKM(EuARF17沒有檢索到)，通過HemI 1.0構(gòu)建的基因表達(dá)譜如圖5所示，可以看出： 在葉片的所有生長發(fā)育時期，Ⅵ亞族的EuARF19.2的表達(dá)明顯高于其他EuARFs； 在幼葉(L3)中，Ⅴ亞族的EuARFs的表達(dá)量較高；EuARF1、EuARF2.1、EuARF2.2、EuARF10.1在葉芽(L1)和老葉(L4)中表達(dá)較高； Ⅴ亞族的EuARFs除EuARF8.2外均在生長葉(L2)中表達(dá)較高。此外，Ⅰ亞族EuARFs和Ⅲ亞族的EuARF9在葉片不同生長時期的表達(dá)均較低。EuARFs在葉片不同生長時期的表達(dá)熱圖(圖5)可以初步反映其在葉片生長過程中存在調(diào)控作用。

圖5 EuARF基因在不同生長時期葉片中的表達(dá)譜

為了驗證EuARF基因在葉片中的表達(dá)模式，初步分析EuARF基因在其他器官中的表達(dá)模式，采用qRT-PCR方法，比較了正常生長條件下不同發(fā)育階段(幼、熟)器官(葉、根、莖)中EuARF基因的表達(dá)水平。結(jié)果(圖6a、b)表明，在正常生長條件下不同發(fā)育階段(幼嫩和成熟)的器官(根、莖和葉)中EuARFs均有表達(dá)，不過表達(dá)量有一定差異。在根中，EuARFs的表達(dá)量最高，并且在成熟根中的表達(dá)量普遍高于幼嫩根，而在葉和莖段中卻相反，表現(xiàn)為在幼嫩的器官中表達(dá)量更高。在表達(dá)水平上，EuARFs之間存在較大區(qū)別。EuARFs在葉片中的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄本測序數(shù)據(jù)的表達(dá)譜相似，其中EuARF19.2在幼葉中的表達(dá)量最高； V亞族的EuARFs(EuARF6.1、EuARF6.2和EuARF8.1)在葉和莖中的表達(dá)水平較高，并表現(xiàn)為在幼嫩和成熟期均有表達(dá)； Ⅱ亞族的EuARFs(EuARF10.1、EuARF10.2、EuARF16和EuARF17)和Ⅴ亞族的EuARF8.2相較于其他EuARFs在所有器官中表達(dá)水平都較低。

eu-miR160s/eu-miR167s在不同發(fā)育階段器官中的表達(dá)模式(圖6c)顯示，eu-miR160s在幼根中的表達(dá)較高，其靶基因Ⅱ亞族的EuARFs在根中均有一定表達(dá)，但與其他亞族的EuARFs相比，這些靶基因在根中的表達(dá)量屬于中等偏低水平，這可能說明這些基因在根中的表達(dá)受到了eu-miR160s的負(fù)調(diào)控。eu-miR167s也存在相同的結(jié)果，eu-miR167s在成熟根和莖中幾乎不表達(dá)，其靶基因EuARF6.1、EuARF6.2和EuARF8.1在成熟根和莖中表達(dá)水平最高，這表明eu-miR167s可能也起到負(fù)調(diào)控作用。

圖6 EuARFs基因和eu-miR160s/eu-miR167s在不同發(fā)育階段不同器官的表達(dá)

3 討論

ARF轉(zhuǎn)錄因子在植物中以家族的形式存在，一般情況下被分為6個亞族(Xingetal.， 2011； Tangetal.， 2018； Huseyin， 2018)，在有的研究中也被分為5個亞族(Lietal.， 2015； 董晨等， 2017)。本研究共鑒定出18個EuARFs，根據(jù)6個亞族的分類可以分到其中5個亞族中(圖1)，只有IV亞族中沒有EuARF基因，同亞族的EuARF基因都具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖3)，同亞族的EuARF蛋白也具有相似的保守結(jié)構(gòu)域和基序(圖2)，這些結(jié)果驗證了基于多序列比對后構(gòu)建的進(jìn)化樹的可靠性。

在家族成員數(shù)量上，EuARFs小于AtARFs，主要原因是Ⅲ亞族的EuARFs數(shù)量(3個)遠(yuǎn)小于AtARFs(12個)，這種現(xiàn)象也存在于其他植物種，包括大麥 (Huseyin， 2018)、番茄(Wuetal.， 2011)、蘋果(Luoetal.， 2014)、甜橙(Lietal.， 2015)、巨桉(Hongetal.， 2014)和荔枝(Litchichinensis)(董晨等， 2017)等。在早期的研究中，這些多出來的AtARFs被單獨分為一組(Xingetal.， 2011； Wuetal.， 2011； Wanetal.， 2014； Yangetal.， 2014)。這表明，杜仲可能與這些植物一樣，在進(jìn)化過程中丟失了一小部分的ARF基因。

在大部分植物的ARF基因家族中都存在不含CTD結(jié)構(gòu)域的ARF蛋白，杜仲的ARF基因家族中也同樣如此。SMART結(jié)果顯示，Ⅰ亞族和Ⅱ亞族的EuARF蛋白以及Ⅴ亞族的EuARF8.2不含CTD結(jié)構(gòu)域。在擬南芥和其他物種也有相似的情況，與Ⅰ亞族EuARF3.1、EuARF3.2同源的AtARF3也不含CTD結(jié)構(gòu)域，并與EuARF3.1、EuARF3.2一樣表現(xiàn)為完全缺失CTD結(jié)構(gòu)域； Ⅱ亞族的AtARFs(AtARF10、16和17)也不含CTD結(jié)構(gòu)域，并且與Ⅱ亞族的EuARFs一樣表現(xiàn)為CTD結(jié)構(gòu)域不完整。這些不含CTD結(jié)構(gòu)域的ARF蛋白可能不參與生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而行使獨立的功能(Liuetal.， 2011b)，在本研究中則發(fā)現(xiàn)這些不含CTD結(jié)構(gòu)域的EuARFs表達(dá)水平相對較低，尤其是Ⅱ亞族的EuARFs，這可能與受到eu-miR160s的負(fù)調(diào)控有關(guān)，表明這類EuARFs可能在eu-miR160s的負(fù)調(diào)控下參與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，通過比較基序(圖2c)可以發(fā)現(xiàn)EuARF8.2蛋白相比于其他Ⅴ亞族的EuARF蛋白除了缺少CTD結(jié)構(gòu)域外，還缺少了Motif 3、4、8、12、15和17，這些基序位于DBD與ARF結(jié)構(gòu)域兩側(cè)，其丟失可能使EuARF8.2喪失了部分功能。

本研究中發(fā)現(xiàn)EuARF基因家族中有7個基因受到eu-miR160s/eu-miR167s的調(diào)控，其中eu-miR160s調(diào)控Ⅱ亞族的EuARFs，eu-miR167s調(diào)控除了EuARF8.2的V亞族的EuARFs，這與擬南芥中的調(diào)控情況相同(Wangetal.， 2015； Linetal.， 2015)。通過表達(dá)模式分析(圖6c)可以看出eu-miR160s在幼嫩的根中表達(dá)水平極高并且在其他不同發(fā)育階段的器官中也有表達(dá)，而Ⅱ亞族的EuARFs在根中均有一定表達(dá)，但與其他亞族的EuARFs相比，其在根中的表達(dá)量屬于中等偏低水平，這表明eu-miR160s在根的生長發(fā)育中對Ⅱ亞族EuARFs可能有負(fù)調(diào)控作用，從而調(diào)控根的生長； 在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)Ⅱ亞族的AtARFs中，AtARF10和AtARF16對根冠以及根部分生組織的發(fā)育起到調(diào)控作用(Wangetal.， 2005)，杜仲的Ⅱ亞族EuARFs可能擁有相似的功能。eu-miR167s則是主要在葉片中表達(dá)，尤其是在成熟的葉片中，其調(diào)控的Ⅴ亞族EuARFs在根、莖、葉中的表達(dá)水平均較高(圖6a)，不過對比其他EuARFs基因在根、莖、葉的相對表達(dá)水平(圖6b)可以發(fā)現(xiàn)，Ⅴ亞族EuARFs在葉片中的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于根和莖，推測Ⅴ亞族的EuARFs在葉片中的表達(dá)受到了負(fù)調(diào)控，這表明Ⅴ亞族EuARFs可能在eu-miR167s的負(fù)調(diào)控下在葉片發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。

進(jìn)一步比較EuARFs的表達(dá)水平與其同源ARFs的功能研究結(jié)果可以對EuARFs的具體功能進(jìn)行預(yù)測，這為進(jìn)一步研究這些基因的功能奠定了基礎(chǔ)。例如，研究已經(jīng)證實AtARF8通過調(diào)節(jié)GH3基因的表達(dá)對幼苗生長產(chǎn)生影響(Wuetal.， 2006)，本研究中也發(fā)現(xiàn)與AtARF8同源的EuARF8.1在幼嫩的莖中表達(dá)水平極高，并且在葉片發(fā)育中受到eu-miR167s的負(fù)調(diào)控； Zhang等(2015)發(fā)現(xiàn)OsARF19控制著水稻葉夾角和側(cè)根發(fā)育，并且AtARF7/AtARF19被證實可激活LBD/ASLS基因從而促進(jìn)葉片的增大(Okushimaetal.， 2007)，本研究則發(fā)現(xiàn)與OsARF19和AtARF7/AtARF19同源的EuARF19.2在葉和根中有很高的表達(dá)水平； 先前的研究表明，AtARF2除了參與花器官的發(fā)育，還對擬南芥葉和根的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用(Okushimaetal.， 2005)，與AtARF2同源的EuARF2.1在葉和根中也有很高的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

杜仲是重要的葉用經(jīng)濟(jì)樹種，研究杜仲葉片的生長發(fā)育對杜仲育種研究有重要意義。本研究在杜仲全基因組測序數(shù)據(jù)庫中共鑒定出18個杜仲ARF基因，這些EuARFs可以分到5個亞族中，基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)分析說明同亞族的EuARFs具有相似的結(jié)構(gòu)與功能，其中Ⅱ亞族的EuARFs受eu-miR160s調(diào)控，V亞族的EuARFs除了EuARF8.2均受eu-miR167s調(diào)控。EuARFs的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)表達(dá)譜顯示，在幼葉(L3)和生長葉(L2)中，V亞族的EuARFs的表達(dá)量較高，此外，EuARF19.2的表達(dá)明顯高于其他EuARFs。qRT-PCR試驗結(jié)果顯示，EuARFs在正常生長條件下不同發(fā)育階段(幼嫩和成熟)的器官(根、莖和葉)中均有表達(dá)，在根中表現(xiàn)為在成熟階段上調(diào)表達(dá)，葉和莖段中表現(xiàn)為在成熟的器官中下調(diào)表達(dá)。eu-miR160s主要在幼嫩的根中表達(dá)，eu-miR167s則是主要在成熟的葉片中表達(dá)。綜合來看，V亞族中EuARFs對幼苗的生長發(fā)育具有調(diào)控作用，在幼嫩的莖中表達(dá)水平極高，在葉片中受到eu-miR167s的負(fù)調(diào)控從而對其生長發(fā)育產(chǎn)生影響； 此外，EuARF19.2在葉片中的表達(dá)顯著高于其他EuARFs，可以推測其對杜仲葉片生長具有重要的調(diào)控作用，具有極高的研究價值。本研究初步揭示了大部分EuARFs在植物生長發(fā)育中發(fā)揮的作用，為杜仲EuARFs基因功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。