吳翔宇，羅麗梅，丁 銳，郭牡丹，鄭一敏

（1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054；2.重慶化工職業(yè)學院，重慶 401220）

非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）屬于肺癌的一種，其病例數(shù)占肺癌總病例數(shù)的85%以上［1］。常年來，非小細胞肺癌有著高病發(fā)率與致死率［2-5］，且藥物的療效都不盡如人意，患者迫切需要更為安全有效的治療藥物提高生存率。

齊墩果酸（oleanolic acid，OA）為一種五環(huán)三萜類化合物［6］，它存在于青葉膽、女貞子、批把葉等傳 統(tǒng) 中 藥 中，具 有 抗 病 毒［7-8］、抗 炎［9］、保肝［10］、降糖［11-12］、降血脂［13］、抗骨質(zhì)疏松［14］等作用。夏榮木等［15］介紹了OA抗腫瘤作用，但活性欠佳。孟艷秋等［16］以齊墩果酸為原料，對C-3位羥基、C-12位雙鍵、C-28位羧基進行結(jié)構(gòu)修飾，合成出一系列新型齊墩果酸衍生物，對A549表現(xiàn)出極強的活性，高于陽性藥物吉非替尼，但細胞毒性大。

為提高齊墩果酸抗肺癌有效性和安全性，本研究對合成的齊墩果酸氮雜環(huán)新衍生物及其抗非小細胞肺癌A549的作用進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 實驗部分

1.1 儀器

85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JA1003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；核磁（NMR）-600 MHz（瑞士Bruker）；Finnigan-LCQDECA（ESI-MS）（美國熱電公司）；3111型恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；Infinite 200 PRO酶標儀（美國賽默飛公司）；XDS-4B型倒置生物顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）；SW-CJ-1F節(jié)凈工作臺（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）；800離心機（常州國華電器有限公司）；FACSVantage SE流式細胞分析儀（上海碧迪醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 材料

（3，5，6-三甲基吡嗪-2-基）甲醇購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；齊墩果酸，氯鉻酸吡啶嗡鹽（PCC），氰基硼氫化鈉（NaBH3CN），N’N-羰基二咪唑（CDI），4-二甲氨基吡啶（DMAP）皆購于Adamas公司；乙酸銨（H3CCOONH4），乙酸乙酯（分析純）（EA），石油醚（分析純）（PE），甲醇（分析純）（MeOH），四氫呋喃（分析純）（THF），二氯甲烷（分析純）（DCM），高錳酸鉀（KMnO4，），無水硫酸鈉（Na2SO4），碘皆購于成都市科龍化工試劑廠；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM（高糖）培養(yǎng)基，胰酶，胎牛血清均購于美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒購于碧云天。

1.3 方法

1.3.1 齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物的合成

以齊墩果酸（1）為原料，通過氧化、還原胺化、縮合反應(yīng)制備齊墩果酸氮雜環(huán)新衍生物（圖1）。

圖1 齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物的合成路線示意圖

1）3-氧代-12-烯-28-齊墩果酸（2）的合成

氬氣保護下，在250 mL三頸瓶中將1（13.701 g，30 mmol）溶于100 mL無水THF，接著以3 mL／min的速度滴加60 mL PCC（12.934 g，60 mmol）的無水THF溶液，室溫攪拌反應(yīng)24 h，薄層色譜（TLC）監(jiān)控［V（DCM）∶V（EA）＝50∶1為展開劑］。減壓旋除THF，得到黑色固體，并以20 mL EA溶解后進行抽濾，再用80 mL EA沖洗硅膠。收集濾液，以水（120 mL×3）萃取，合并有機相，以無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，濃縮液通過硅膠層析柱（V（DCM）∶V（EA）＝70∶1為洗脫劑）分離純化。得到10.634 g白色固體粉末2，-18℃密封保存。收率：78.0%。

2）3-氨基-12-烯-28-齊墩果酸（3）的合成

氬氣保護下，在100 mL雙頸瓶中將2（0.908 g，2 mmol）溶于40 mL無水MeOH，加熱至50℃攪拌溶解后，停止加熱，冷至室溫。加入乙酸銨（1.542 g，20 mmol），室溫攪拌60～120 min，接著以3 mL／min的速度滴加20 mL氰基硼氫化鈉（0.129 g，2 mmol）的無水MeOH溶液，室溫攪拌24 h，TLC監(jiān)控［V（DCM）∶V（MeOH）＝20∶1為展開劑］。減壓濃縮反應(yīng)液，加入稀NaOH水溶液，調(diào)pH值至8，以DCM（50 mL×3）萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，濃縮液通過硅膠層析柱［V（DCM）∶V（MeOH）＝40∶1為洗脫劑］分離純化。得到0.648 g黃色固體粉末3，-18℃密封保存。收率：71.2%。

3）（3，5，6-三甲基吡嗪-2-基）甲酸（5）的合成

在250 mL的三頸瓶中將4（3.000 g，20 mmol）溶于60 mL水，再以3 mL／min的速度滴加60 mL高錳酸鉀（4.822 g，30 mmol）水溶液，室溫攪拌24 h，TLC監(jiān)控［V（DCM）∶V（MeOH）＝20∶1為展開劑］。反應(yīng)液以稀鹽酸（6 mol／L）調(diào)pH至2，再以EA（100 mL×3）萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，濃縮液通過硅膠層析柱（V（DCM）∶V（MeOH）＝30∶1為洗脫劑）分離純化。得到2.872 g淡紅色固體粉末5，-18℃密封保存。收率：87.7%。

4）齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物（6）的合成

氬氣保護下，在50 mL雙頸瓶中將5（0.340 g，2 mmol）溶于25 mL無水DCM，加入CDI（0.332 g，2 mmol），室溫攪拌60 min。再依次加入3（0.463 g，1 mmol）和DMAP（0.244 g，2 mmol），室溫攪拌24 h，TLC監(jiān)控（V（DCM）∶V（MeOH）＝50∶1為展開劑）。反應(yīng)液以水（50 mL×3）萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，濃縮液通過硅膠層析柱［V（DCM）∶V（MeOH）＝80∶1為洗脫劑］分離純化。得到0.437 g白色固體粉末6，-18℃密封保存。收率：71.3%；

1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.03（d，J＝10.1 Hz，1H），5.31（s，1H），3.81（td，J＝10.3，5.6 Hz，1H），2.93（s，3H），2.85（dd，J＝13.6，3.6 Hz，1H），2.55（d，J＝22.3 Hz，6H），2.01（dd，J＝13.4，10.2 Hz，1H），1.96～1.87（m，2H），1.84～1.71（m，2H），1.72～1.56（m，8H），1.52（t，J＝12.7 Hz，1H），1.39（ddd，J＝34.5，28.1，12.5 Hz，3H），1.30～1.02（m，8H），1.01～0.90（m，15H），0.80（s，3H）；13CNMR（151 MHz，CDCl3）δ183.60，164.48，153.83，151.36，147.47，143.70，139.24，122.52，56.60，56.06，47.64，46.59，45.93，41.66，41.01，39.28，38.97，37.96，37.04，33.86，33.08，32.62，32.47，30.68，28.68，27.70，25.91，25.42，23.61，23.40，23.00，22.86，21.90，21.56，18.63，17.15，16.61，15.31；ES-MSof［C38H57N3O3］+：theoretical m／z of［M+H］+＝605.44，measured m／z of［M+H］+＝604.90；ES-MSof［C38H57N3O3］-：theoretical m／z of［M+H］-＝603.44，measured m／z of［M+H］-＝602.84。確證該齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物為3-N-（3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲酰基）-齊墩果酸，命名為QDGS-6。

黨的十八大以來，中國鐵路昆明局集團主動適應(yīng)經(jīng)濟發(fā)展新常態(tài)，深入推進鐵路運輸供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，發(fā)揮云南省首家5A級綜合型物流企業(yè)優(yōu)勢，累計完成貨物發(fā)送2.92億噸，其中出省物資外運1.4億噸。

1.3.2 CCK-8法評價化合物QDGS-6對A549、16HBE細胞的細胞增殖抑制作用

配成1×105個／mL處于對數(shù)生長期的A549細胞懸液，參照文獻［17］的方法評價QDGS-6對A549細胞的活性進行評價。QDGS-6作用濃度分別為：6.25、12.5、25、50、100、200μm；齊墩果酸作用濃度分別為25、50、100、175、200、350μm；5-氟尿嘧啶作用濃度分別為25，50、100、200、300、400 μm，每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。匯總數(shù)據(jù)，計算其抑制率與IC50。

配成5×104個／mL處于對數(shù)生長期的16HBE細胞懸液后，按同樣的方法評價QDGS-6對其的毒性。QDGS-6作用濃度分別為：6.25、12.5、25、50、100、200μm；齊墩果酸作用濃度分別為50、100、175、200、300μm；5-氟尿嘧啶作用濃度分別為25、50、100、200、300、400μm，每組設(shè)3個復孔，實驗重復3次。匯總數(shù)據(jù)，計算其抑制率與CC50。

1.3.3 Annexin V-FITC／PI雙染色法檢測細胞凋亡

參照文獻［17］的方法檢測QDGS-6對A549細胞的誘導凋亡作用。設(shè)立：對照組（不含任何藥物的RPMI 1640完全培養(yǎng)基），實驗藥物組（QDGS-6作用濃度分別為：50、100、200μm，對應(yīng)高中低3種濃度組），陽性藥組（5-氟尿嘧啶作用濃度為400μm）。

1.3.4 Caspase-3試劑盒檢測A549細胞中Caspase-3活性

參照文獻［17］的方法檢測QDGS-6對A549細胞中Caspase-3活性影響。設(shè)立：對照組（不含任何藥物的RPMI 1640完全培養(yǎng)基），實驗藥物組（QDGS-6作用濃度分別為：50、100、200μm，對應(yīng)高中低3種濃度組），陽性藥組（5-氟尿嘧啶作用濃度為400μm）。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸氮雜環(huán)衍生物對A549細胞與16HBE細胞的增殖抑制作用

表1 QDGS-6對A549細胞的增殖抑制率（，n＝3）

表1 QDGS-6對A549細胞的增殖抑制率（，n＝3）

組別／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 6.25 0.08±0.03 1.48±0.53 4.07±1.26 12.5 1.09±0.67 8.52±3.17 12.71±2.43 25 2.10±0.34 15.15±2.96 20.12±4.34 50 13.76±4.61 32.68±4.78 42.82±5.62 100 39.97±7.54 75.12±3.66 92.26±2.91 200 83.17±2.27 97.35±1.43 98.96±1.16

表2 齊墩果酸對A549細胞的增殖抑制率（，n＝3）

表2 齊墩果酸對A549細胞的增殖抑制率（，n＝3）

組別／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 25 5.54±1.41 11.48±3.12 22.46±2.22 50 16.67±1.78 21.63±1.84 27.72±2.89 100 28.32±1.38 38.31±3.07 41.02±5.14 175 40.12±3.52 42.34±3.89 56.82±1.03 200 51.75±3.86 57.29±1.85 77.26±3.96 350 73.28±1.37 92.35±2.63 97.87±1.86

表3 5-氟尿嘧啶對A549細胞的增殖抑制率（，n＝3）

表3 5-氟尿嘧啶對A549細胞的增殖抑制率（，n＝3）

組別／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 25 4.68±1.98 6.59±2.83 20.16±3.77 50 13.37±3.64 17.63±3.62 28.53±2.24 100 21.26±2.61 23.34±1.16 34.77±1.87 200 41.32±2.36 53.79±1.24 60.91±3.74 300 52.38±4.64 71.26±2.59 84.52±2.09 400 59.24±2.02 79.35±3.36 91.32±2.44

不同濃度的QDGS-6、齊墩果酸和5-氟尿嘧啶分別作用于16HBE細胞不同24、48、72 h后的增殖抑制率分別如表4、5、6所示。隨著藥物濃度的增大以及作用時間的延長，QDGS-6、齊墩果酸和5-氟尿嘧啶的抑制作用都有不同程度地變強。其中QDGS-6作用于16HBE細胞24、48、72 h的CC50分別為146、98、62μm；齊墩果酸作用于16HBE細胞24、48、72 h的CC50分別為107、89、71μm；5-氟尿嘧啶作用于16HBE細胞24、48、72 h的CC50分別為5 505、74、48μm。

表4 QDGS-6對16HBE細胞的增殖抑制率（，n＝3）

表4 QDGS-6對16HBE細胞的增殖抑制率（，n＝3）

組別／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 6.25 6.21±1.14 11.75±3.33 13.77±5.44 12.5 7.82±3.07 17.95±3.46 19.29±2.82 25 19.14±3.83 28.64±6.22 34.77±4.05 50 33.62±2.67 46.83±1.69 68.29±3.87 100 41.96±6.01 49.36±5.19 79.87±2.59 200 76.91±5.96 92.53±2.94 99.83±0.52

表5 齊墩果酸對16HBE細胞的增殖抑制率（，n＝3）

表5 齊墩果酸對16HBE細胞的增殖抑制率（，n＝3）

組別／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 50 23.04±6.21 34.79±4.95 37.84±3.08 100 35.71±7.10 43.38±3.58 55.06±6.47 175 49.50±3.11 56.52±4.21 88.71±3.35 200 97.75±2.04 96.58±1.56 99.78±1.86 350 98.17±2.48 96.49±1.24 99.32±0.73

表6 5-氟尿嘧啶對16HBE細胞的增殖抑制率（，n＝3）

表6 5-氟尿嘧啶對16HBE細胞的增殖抑制率（，n＝3）

組別／μm抑制率／%24 h 48 h 72 h 25 12.96±2.33 31.21±2.13 38.03±2.54 50 15.67±0.34 42.64±1.48 44.78±3.63 100 18.67±3.28 52.37±2.88 67.47±2.42 200 23.09±2.19 69.54±2.73 91.25±1.10 300 27.07±2.56 79.13±3.81 94.69±1.76 400 29.21±1.28 83.3±1.07 95.39±1.35

綜上可得到表7，隨著藥物濃度的增大以及作用時間的延長，QDGS-6對非小細胞肺癌A549的增殖抑制作用也增強，表明QDGS-6對A549存在劑量和時間的依賴性。通過比較QDGS-6、齊墩果酸和5-氟尿嘧啶的IC50，可知QDGS-6具有更強的抗非小細胞肺癌A549的活性。通過比較選擇系數(shù)（selection index，SI）可知QDGS-6在細胞水平上較齊墩果酸與5-氟尿嘧啶更為安全。

表7 3種化合物對A549、16HBE細胞的增殖抑制影響

2.2.3 QDGS-6對A549細胞的誘導凋亡作用

如圖2所示，QDGS-6作用于A549細胞24 h后，隨著QDGS-6濃度的增加，A549細胞的凋亡率也增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。高濃度組的凋亡率為67.0%（63.5%早期凋亡+3.5%晚期凋亡），中濃度組的凋亡率為25.84%（19.0%早期凋亡+6.84%晚期凋亡），低濃度組的凋亡率為15.78%（9.23%早期凋亡+6.55%晚期凋亡），陽性藥組的凋亡率為20.36%（18.9%早期凋亡+1.46%晚期凋亡），對照組凋亡率為12.55%。提示QDGS-6對A549細胞有著顯著的促凋亡作用。

圖2 不同劑量QDGS-6對A549細胞凋亡的影響圖

2.2 QDGS-6對A549細胞中Caspase-3活性的影響

通過以陽性藥和不同濃度的QDGS-6處理A549細胞24 h后，再以caspase-3檢測試劑盒和Bradford試劑盒測定得到caspase-3的相對酶活力值，考察caspase-3是否參與了A549細胞的凋亡過程。Bradford標準曲線如圖3所示，R2＝0.99，說明蛋白濃度范圍為0～1.5 mg／mL時，BSA濃度與OD值的線性關(guān)系良好，公式為y＝0.540 3x+0.529 8。pNA標準曲線如圖4所示，R2＝0.999 3，說明pNA濃度范圍為0～200μm時，pNA濃度與OD值的線性關(guān)系良好，公式為y＝0.0026x+0.005。

Caspase-3的相對酶活力單位結(jié)果如圖5所示。隨著藥物濃度的增加，caspase-3的相對酶活力單位也相應(yīng)增加。提示QDGS-6可以增強A549細胞中Caspase-3的活性，這可能是QDGS-6誘導A549細胞凋亡的機制之一。

圖3 牛血清白蛋白標準曲線

圖4 pNA標準曲線

圖5 不同劑量QDGS-6對A549細胞Caspase 3活性的影響直方圖

3 討論

以齊墩果酸為先導化合物，通過氧化、鮑奇還原胺化、縮合等反應(yīng)得到了齊墩果酸衍生物QDGS-6，通過質(zhì)譜、核磁共振的方法確證了該結(jié)構(gòu)為3-N-（3，5，6-三甲基吡嗪-2-甲?；?齊墩果酸，同時通過文獻檢索、Reaxys和Scifinder等數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)比對，確定了QDGS-6為齊墩果酸新型衍生物。體外活性評價實驗數(shù)據(jù)表明，QDGS-6活性相對原料藥和陽性藥有了明顯提高，在細胞水平上的安全性更強，提示齊墩果酸類衍生物在可抑制癌細胞增殖的同時，毒性更低。且QDGS-6可誘導A549細胞株凋亡，增強Caspase-3的酶活性可能是其機制。Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游中最重要的凋亡執(zhí)行者，Bcl-2與Bax蛋白既可作為上級調(diào)控機制，又可作為Caspase-3的下游直接底物。為了進一步探尋QDGS-6誘導A549細胞凋亡的機制，可檢測Bcl-2與Bax蛋白的表達情況。

首次將齊墩果酸與川芎嗪以酰胺鍵拼合在一起，在體外活性評價實驗中發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸衍生物QDGS-6的抗非小細胞肺癌的活性相對于齊墩果酸提升的幅度不大，同時其溶解性未得到明顯改善，提示該類結(jié)構(gòu)口服體內(nèi)生物利用度可能較低。湯義等［18］通過在齊墩果酸C-3位連接單糖基，使齊墩果酸衍生物的親水性基團得到了增加，改善了化合物的溶解性與活性，提示齊墩果酸可以通過連接糖苷類化合物，引入如羧基等親水性基團，從而得到溶解性更好的化合物。