姚郅璆，李海玲，康鐵柱，司文宇，葉 菁，張興旺，方富貴

初情期山羊胸腺microRNAs的篩選

姚郅璆，李海玲，康鐵柱，司文宇，葉 菁，張興旺，方富貴*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

為分析初情期前和初情期雌性山羊胸腺中MicroRNA 的差異表達(dá)情況，并探討其在山羊初情期啟動(dòng)過程中所起的作用。對初情期前（n = 3）和初情期（n = 3）山羊的胸腺組織進(jìn)行了 Solexa 測序，采用 GO 富集和 KEGG 分析評估差異 miRNA 靶基因。在初情期前和初情期的山羊胸腺組織中檢測到 538 個(gè) miRNA，其中64 個(gè) miRNA 顯著差異表達(dá)。與初情期前的山羊胸腺樣本相比，初情期胸腺樣本中存在 19 個(gè)上調(diào)基因和 45 個(gè)下調(diào)基因。KEGG 通路富集分析顯示，差異 miRNA 靶基因主要富集在苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成，丁螺菌素和新霉素的生物合成等通路以及膽堿能突觸和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）等與初情期啟動(dòng)相關(guān)信號途徑。結(jié)果提示胸腺中 miRNA 參與山羊初情期啟動(dòng)。

山羊；MicroRNA；初情期；胸腺

MicroRNA（miRNA）是一種長約21～24 nt的非編碼RNA，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后翻譯的過程。miRNA最初由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為細(xì)胞核中的初級miRNA（pri-miRNA）[1]。隨后miRNA前體輸出到細(xì)胞質(zhì)中，成為成熟的22 nt雙鏈體。成熟的miRNA進(jìn)入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，并通過3'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合靶基因[2]。成熟的miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和分化中起重要作用。

胸腺是重要的免疫器官，參與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸。研究表明，小鼠幼兒期胸腺切除會(huì)導(dǎo)致成年小鼠卵巢發(fā)育不全，并引起初情期啟動(dòng)的延遲，以及性類固醇濃度降低和黃體缺失[3]。這些變化與自身免疫性卵巢發(fā)育不良相關(guān)的免疫活性無關(guān)[4]。胸腺肽作為胸腺分泌的一種生物活性分子也影響著生殖功能。胸腺肽注射入下丘腦內(nèi)側(cè)核引起排卵并降低了全部卵泡中閉鎖卵泡的百分比，可能是由于下丘腦內(nèi)側(cè)促性腺激素釋放激素（gonadotropin- releasing hormone，GnRH）釋放引起的。腦室內(nèi)注射胸腺素β4增加了血清中黃體生成素（luteinizing hormone，LH）的水平。在大鼠垂體培養(yǎng)物中胸腺素的添加也刺激LH的釋放[5-7]。

初情期是雌性動(dòng)物發(fā)育的重要階段，標(biāo)志著首次排卵的發(fā)生和生殖能力的開始[8]。影響初情期啟動(dòng)的因素很多，包括遺傳因素，神經(jīng)內(nèi)分泌因素，環(huán)境因素等。隨著初情期相關(guān)研究的深入，已經(jīng)確定了影響GnRH產(chǎn)生和釋放的幾個(gè)關(guān)鍵因素，但調(diào)控初情期啟動(dòng)過程的具體機(jī)制仍未明確。最近的研究表明，初情期的啟動(dòng)受miRNA的調(diào)控。在小鼠GnRH神經(jīng)元中選擇性敲除Dicer（沒有miRNA生物合成），實(shí)驗(yàn)鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞性腺功能減退癥[9]。在幼兒期，GnRH神經(jīng)元中miR-200和miR-155的表達(dá)水平升高，通過抑制GnRH的抑制信號增加了GnRH表達(dá)[10]。大鼠下丘腦中l(wèi)et-7a和let-7b miRNA的表達(dá)在初情期達(dá)到最高，并且在初情期延遲/缺失的動(dòng)物模型中，Lin28 / let-7比率顯著增加。在出生后的下丘腦中也檢測到miR-132和miR-145表達(dá)增加[11]。這些研究表明，miRNA在哺乳動(dòng)物初情期啟動(dòng)中起著重要作用。然而，miRNA在初情期山羊胸腺中的表達(dá)模式仍然未知。因此，通過Solexa測序技術(shù)在初情期前和初情期山羊胸腺組織中檢測miRNA的表達(dá)水平，探討miRNA在初情期和初情期前山羊胸腺組織的表達(dá)差異及其可能參與的生物學(xué)過程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用3只年齡為2.5～3.0個(gè)月，體重為（9.9±0.39）kg的健康初情期前安懷雌山羊和3只年齡為4.5～5.0個(gè)月，體重為（18.9±0.43）kg的初情期山羊。通過陰道和卵巢生理變化以及公羊試情方法確定初情期。屠宰取胸腺，在液氮下快速冷凍，并保存在–80 ℃環(huán)境中。

1.2 總RNA提取及質(zhì)量檢測

使用TRIzol試劑盒（Invitrogen，CA，USA）提取胸腺總RNA，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。該研究得到安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的認(rèn)可。

使用1％瓊脂糖凝膠檢測RNA降解和污染情況。 RNA顯示3個(gè)條帶，分別為28、18 和5 s。使用NanoPhotometer分光光度（IMPLEN, CA, USA）和Qubit?Quat?RNA分析試劑盒測量RNA的純度和濃度。使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)（Agilent Technologies，CA，USA）的RNA Nano 6000分析試劑盒確定RNA完整性。

1.3 Illumina Solexa 測序

1.3.1 Small RNA測序文庫構(gòu)建 按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟生成測序文庫。主要步驟為：將NEB 3'接頭和5'末端接頭分別連接到miRNA，小干擾RNA和Piwi互作RNA的3'末端和5'末端。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并PCR擴(kuò)增合成為cDNA。隨后，使用8％聚丙烯酰胺凝膠（100 V，80 min）對140～160 bp的PCR產(chǎn)物切膠回收，純化后用于后續(xù)序列測定。

1.3.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控 根據(jù)制造商的說明，將文庫制備物在Illumina Hiseq 2500/2000（Illumina，USA）平臺(tái)上測序，并產(chǎn)生50 bp單端讀數(shù)。去除原始序列中的低質(zhì)量，5＇接頭污染以及含有polyA/T/G/C和N的比例大于10%的序列，得到過濾后序列（clean reads）用于后續(xù)分析。

1.3.3 Small RNA分類注釋 對各樣品的clean reads，篩選一定長度范圍內(nèi)的小RNA（small RNA）進(jìn)行后續(xù)分析。將clean reads與已知的sRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比注釋。由于存在一個(gè)sRNA同時(shí)比對上幾種不同的注釋信息情況，為了將每個(gè)小RNA標(biāo)簽僅映射到唯一注釋上，遵循以下優(yōu)先原則：已知miRNA＞核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）＞轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）＞核小RNA（small nuclearRNA，snRNA）＞核仁小 RNA（small nucleolar RNA，snoRNAs）＞重復(fù)基因＞天然反義轉(zhuǎn)錄干擾小RNA（natural antisense transcript-derived siRNA，NAT-siRNA）＞新miRNA＞反式作用的干擾小RNA （trans-acting siRNA，ta-siRNA）[12]。

1.3.4 已知miRNA的檢測和新miRNA的預(yù)測 已注釋的小RNA與miRBase數(shù)據(jù)庫中指定范圍序列進(jìn)行比對，得到各樣品匹配上的sRNA的詳細(xì)情況，包括已知miRNA的二級結(jié)構(gòu)、序列、長度和出現(xiàn)的次數(shù)等信息。通過截取一定長度sRNA比對上的參考序列，使用軟件miREvo和mirdeep2探尋sRNA二級結(jié)構(gòu)及Dicer酶切位點(diǎn)信息及能量等特征進(jìn)行新miRNA的預(yù)測。

1.3.5 miRNA差異及聚類分析 對初情期和初情期前山羊胸腺文庫中已知和新的miRNA的表達(dá)進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析，并用每百萬條序列轉(zhuǎn)錄本（transcripts per million，TPM）進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理獲得差異倍數(shù)（fold-change）變化和值[13]。使用火山圖推斷差異miRNA的整體分布情況，從差異倍數(shù)和校正后的顯著水平（padj/qvalue）兩個(gè)水平進(jìn)行評估，對差異miRNA進(jìn)行篩選。差異miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)為：qvalue＜0.01且log2(foldchange)＞ 1。將各組比較得到的差異miRNA個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以維恩圖的方式表示。為了判斷差異miRNA在不同試驗(yàn)條件下的表達(dá)模式，將所有差異miRNA并集在TPM值中，使用軟件pheatmap進(jìn)行層次聚類分析，將表達(dá)模式相同或相近的miRNA聚集成類，進(jìn)而識別未知miRNA的功能或已知miRNA的未知功能。

1.3.6 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測及功能注釋 miRNA靶基因預(yù)測通過預(yù)測軟件進(jìn)行，對分析得到的已知和新miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，得到miRNA和靶基因間的對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)miRNA與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，對每組差異表達(dá)miRNA的靶基因的集合分別進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和基因與基因組京都百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。GO富集分析用于分析差異表達(dá)的miRNA的候選靶基因并確定miRNA靶基因的作用。KEGG途徑分析用于鑒定顯著富集的代謝途徑或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 KOBAS（CBI, China）軟件用于KEGG通路的富集統(tǒng)計(jì)[14]。富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量及長度分布

初情期和初情期前山羊胸腺RNA提取質(zhì)量如圖1所示，28 s和18 s 均清晰可見。表明RNA質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)檢測。隨后構(gòu)建初情期和初情期前山羊的胸腺文庫，總共產(chǎn)生了15 739 867和11 635 964個(gè)原始序列，錯(cuò)誤率為0.01％以內(nèi)。在過濾低質(zhì)量的序列后，兩個(gè)RNA-Seq文庫在每個(gè)文庫中仍產(chǎn)生超過96％的clean reads（表1）。這表明這2個(gè)高質(zhì)量文庫構(gòu)建成功。大多數(shù)sRNA的長度在21～24 nt之間（圖2）。長度為21～24 nt的序列分別占初情期前和初情期山羊的胸腺總序列的74.85％和70.20％。

表1 初情期和初情期前山羊胸腺文庫的構(gòu)建和質(zhì)控結(jié)果

M. DNA Marker；1-3.初情期前山羊4-6.初情期山羊。

Figure 1 Agarose gel electrophoresis of prepubertal and pubertal goat thymus RNA

2.2 已知和新miRNA分析鑒定

將所有sRNA與各類RNA的比對、注釋情況進(jìn)行總結(jié)，對樣品中對比到的sRNA進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖3所示。初情期和初情期前山羊胸腺中總序列中分別存在39.96％和39.80％的已知miRNA序列，0.19 %和0.12 %的新miRNA序列，1.46％和0.87％的snoRNAs序列，其余RNA種類包括tRNA、rRNA、胞質(zhì)小RNA、外顯子和內(nèi)含子等。將上述序列與miRBase中指定范圍序列進(jìn)行比對，通過軟件檢測到總共136個(gè)新miRNA成熟體，146個(gè)新miRNA前體。在已知miRNA的檢測中，總共檢測到402個(gè)成熟體miRNA，257個(gè)miRNA前體（表2）。

圖2 初情期和初情期前山羊sRNA長度

Figure 2 Frequency distribution of sRNA sequence lengths

2.3 miRNA差異表達(dá)

將各組比較得到的差異miRNA個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，畫成維恩圖，在初情期和初情期前這2組中共檢測出538個(gè)差異miRNA（圖4）。初情期前和初情期山羊的胸腺中分別檢測到37和 16個(gè)差異miRNA。在2組之間共有485個(gè)差異miRNA。如圖5所示，在2個(gè)樣品之間共有64個(gè)顯著差異表達(dá)miRNA，其中 19個(gè)差異miRNA顯著下調(diào)，45個(gè)差異miRNA顯著上調(diào)。

表2 已知miRNA和新的miRNA的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖3 測序得出的sRNA類別

Figure 3 Composition of small RNA classes from Solexa sequencing

圖4 差異表達(dá)miRNA維恩圖

Figure 4 Differentially expressed miRNAs in the two goat thymus libraries

2.4 miRNA靶基因GO富集和KEGG通路富集分析

GO富集分析表明差異miRNA的靶基因涉及細(xì)胞組分，分子功能和生物學(xué)過程這3種基因功能類別中的一種或多種。差異miRNA靶基因共顯著富集在34種生物學(xué)過程中，包括初級代謝過程，大分子代謝過程的調(diào)控等方面。靶基因富集在共15種分子功能（表3）。KEGG通路分析表明，在初情期前和初情期胸腺中，miRNA靶基因共涉及26條通路。這些通路包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，丁二酸和新霉素生物合成，糖胺聚糖生物合成硫酸角蛋白，糖胺聚糖降解和光轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于沒有信號通路被顯著富集，表4中僅展示值前5低以及通路下相關(guān)靶基因數(shù)最多的5條通路。在這些這些通路中，超過200個(gè)靶基因的富集在Rap1信號通路上，但不存在顯著差異。

紅色，顯著上調(diào)的差異miRNA；綠色，顯著下調(diào)的差異miRNA；藍(lán)色，無顯著差異的miRNA。

Figure 5 Differential expression analysis of thymus miRNAs between pubertal and prepubertal goats

3 討論與結(jié)論

在本研究中，使用Solexa技術(shù)對初情期前和初情期山羊的胸腺組織中的sRNA進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，sRNA文庫中的sRNA序列長度集中在20到24 nt之間。與以前的研究相似的是，在總sRNA序列中，22 nt長度的sRNA豐度最高，這是也山羊miRNA最典型的長度[15]。通過將sRNA定位到已知的miRbase，發(fā)現(xiàn)了402個(gè)已知的成熟體miRNA。根據(jù)miRNA前體結(jié)構(gòu)，預(yù)測了136種新的miRNA。這極大地豐富了對山羊miRNA轉(zhuǎn)錄的理解，并為進(jìn)一步研究在山羊中miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用奠定了基礎(chǔ)。初情期前和初情期山羊的胸腺文庫分別產(chǎn)生了15 739 867和11 635 964個(gè)原始序列，2個(gè)文庫的clean reads數(shù)仍存在差異。通過圖2的sRNA長度分析顯示，初情期山羊胸腺中長度在21～24 nt之間的sRNA相較于初情期前數(shù)量降低。初情期前山羊胸腺中長度在21～24 nt的sRNA共檢測到11 038 796個(gè)，初情期時(shí)為7 542 108個(gè)。考慮到miRNA長度位于21～24 nt之間，初情期山羊胸腺原始序列的降低可能由于miRNA下調(diào)引起。另外，在初情期山羊卵巢和人類青春期胸腺中也出現(xiàn)這種miRNA減少，原始序列降低的現(xiàn)象[16-17]。具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

表3 樣品中候選靶基因的Gene Ontology富集列表

表4 候選靶基因KEGG顯著性富集列表

初情期啟動(dòng)的早晚關(guān)系到雌性動(dòng)物的繁殖性能。研究表明，在哺乳動(dòng)物中，內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間的存在著直接聯(lián)系。性激素和糖皮質(zhì)激素參與免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能，并在免疫耐受機(jī)制中起作用[17-18]。在初情期啟動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用的G蛋白偶聯(lián)受體54 (G Protein-Coupled Receptors 54, GPR54) 同樣具有免疫調(diào)節(jié)功能。GPR54缺乏導(dǎo)致胸腺增大，胸腺細(xì)胞增多，初情期前后胸腺微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[19]。內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的具體作用機(jī)制還沒有得到很好的研究。胸腺退化是內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間存在直接聯(lián)系的證據(jù)之一。胸腺是第一個(gè)成熟的淋巴器官，在幼年期動(dòng)物中最大，但隨著年齡增長而退化。胸腺退化的時(shí)間因物種而異，但在哺乳動(dòng)物中通常與初情期一致[20]。在雌性白山羊中胸腺從幼年時(shí)期到初情期逐漸增大，在初情期達(dá)到最大，此后呈現(xiàn)增齡性退化現(xiàn)象[21]。

在初情期前和初情期的山羊胸腺組織中，一共鑒定了538 個(gè)差異 miRNA，其中chi-miR-493-5p和 chi-miR-30f-5p在初情期時(shí)的胸腺組織中顯著下調(diào)，在安懷白山羊的垂體以及濟(jì)寧灰山羊卵巢中同樣也發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA差異表達(dá)，但在生理或生殖上的功能仍然未知[15,22]。chi-miR-99a-5p在初情期山羊胸腺中同樣顯著下調(diào)，miR-99a是在哺乳動(dòng)物卵巢中最重要的miRNA群體之一[23]，胰島素樣生長因子1受體（Insulin-like growth factor 1, IGF-1R）是miR-99a的直接靶標(biāo)。miR-99a可通過直接下調(diào)IGF-1R抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。由于IGF-1R與初情期的啟動(dòng)密切相關(guān)[24]，因此mir-99a可能參與初情期的調(diào)控。

chi-miR-10b-5p、chi-miR-199a-3p和chi-miR- 199a-5p在初情期胸腺組織中極顯著下調(diào)，這些miRNA參與細(xì)胞增殖，凋亡和差異化的過程。其中chi-miR-10b-5p與細(xì)胞增殖和肌肉發(fā)育相關(guān)，chi-miR-10b-5p在初情期山羊胸腺中的顯著下調(diào)，表明細(xì)胞增殖活性受到抑制，為研究初情期山羊胸腺退化提供了重要信息[25]。其他顯著下調(diào)的miRNA，chi-miR-199a-3p和chi-miR-199a-5p同樣參與細(xì)胞增殖和凋亡的過程。由于下丘腦-垂體-性腺軸的正常功能依賴于胸腺對內(nèi)分泌的影響[26]。胸腺素作為胸腺分泌的一種生物活性分子，對初情期的啟動(dòng)起著積極作用。幼兒期小鼠注射胸腺素引起初情期提前[3]。胸腺素能調(diào)節(jié)腺垂體激素的釋放，胸腺切除會(huì)導(dǎo)致腺垂體發(fā)育異常[27-28]，新生小鼠胸腺素基因治療可以防止循環(huán)促性腺激素水平的降低[29]。

體外研究表明，胸腺素可以直接作用于GnRH神經(jīng)元，并提高垂體促性腺激素水平[30]。胸腺素-4同樣在體外培養(yǎng)下丘腦和垂體組織產(chǎn)生GnRH和LH的刺激作用[26]。除直接作用以外，胸腺產(chǎn)生的胸腺素還合成參與生殖內(nèi)分泌的其他激素，例如褪黑素、神經(jīng)肽和胰島素等[31]。胸腺激素的抑制一般由衰老引起，因此miRNA參與的胸腺退化過程對初情期的調(diào)控同樣有著重要意義。

在KEGG功能富集中，候選靶基因雖然沒有顯著富集到某一通路，但這些差異靶基因同樣涉及一些與初情期相關(guān)的途徑，例如膽堿能突觸[32]和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR）信號途徑[33]。值得注意的是PPAR信號同樣在初情期婆羅門母牛卵巢中顯著富集[34]，提示其參與卵巢生物學(xué)功能。這些靶基因通路的富集可為該領(lǐng)域的未來研究提供參考。

本試驗(yàn)檢測了 miRNA 在初情期前和初情期山羊胸腺組織的表達(dá)情況，并對其進(jìn)行了靶基因預(yù)測和功能分析，結(jié)果表明山羊胸腺miRNA可能在山羊初情期啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果為探明山羊初情期啟動(dòng)的潛在調(diào)控機(jī)制提供了重要參考，并有助于闡明miRNA參與生長和繁殖的過程。

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Screening of microRNAs in the thymus of pubertal goats

YAO Zhiqiu, LI Hailing, KANG Tiezhu, SI Wenyu, YE Jing, ZHANG Xingwang, FANG Fugui

(School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

The objective of the paper aimed to screen the differential expression of MicroRNA in the thymus between prepubertal and pubertal goats. Thymus tissue from prepubertal (=3) and pubertal (=3) goats were analyzed by Solexa sequencing. The target genes of these miRNAs were evaluated using GO enrichment and KEGG pathway analysis to identify critical pathways regulating the onset of puberty in goats. 538 miRNAs were detected in goat thymus tissue. 64 miRNAs were differentially expressed between the two groups. 19 up-regulated and 45 down-regulated genes in the pubertal samples compared with the prepubertal samples. KEGG pathway enrichment analysis revealed that these differentially expressed miRNA target genes were mainly focused on phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, butirosin and neomycin biosynthesis and the cholinergic synapse and peroxisome proliferators-activated receptor signaling pathway related to the onset of puberty. The results suggested that miRNA in the thymus may be involved in the onset of puberty of the goat.

goat; MicroRNA; puberty; thymus

S827

A

1672-352X (2021)01-0066-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.004

2021-3-23 10:05:55

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210319.1503.008.html

2020-03-05

國家自然科學(xué)基金（31972629）資助。

姚郅璆，碩士研究生。E-mail：695025620@qq.com

方富貴，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：fgfang@163.com