■田 超 王雪瑩 邵 琦 李元曉 楊自軍 張 才 劉宗平

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；2.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471023；3.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，河南鄭州451450；4.河南省動物福利與健康養(yǎng)殖國際聯(lián)合實驗室，河南洛陽471023）

近年來，中國奶牛養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，奶牛飼養(yǎng)規(guī)模迅速壯大且奶牛單產(chǎn)水平不斷提高，但管理技術相對滯后，跟不上行業(yè)的發(fā)展，導致奶牛疾病多發(fā)。圍產(chǎn)期是奶牛疾病的高發(fā)時期，其中酮病是圍產(chǎn)期奶牛最常見的營養(yǎng)代謝病之一。據(jù)統(tǒng)計，奶牛在產(chǎn)后第一個月奶牛亞臨床酮病癥（subclinical ketosis，SCK）的發(fā)病率為10%～60%，臨床酮?。╟linical ketosis，CK）的發(fā)病率為2%～15%[1]。2018年中國主要養(yǎng)殖區(qū)奶牛臨床酮病的發(fā)病率為20%～30%，且同區(qū)域有逐年升高的趨勢[2-3]。酮病的危害在于不僅降低奶牛的生產(chǎn)性能和繁殖效率，還會增加真胃移位、子宮炎、脂肪肝病等疾病的風險，給養(yǎng)殖場帶來巨大的經(jīng)濟損失。Gohary等[4]建立模型評估亞臨床酮病奶牛每年造成的損失約為203美元/頭。徐碩爍等[5]統(tǒng)計中國一例酮病奶牛的損失，一年約為3 200元。孫照磊[6]綜合分析了中國奶牛酮病的發(fā)病情況后認為，中國奶牛養(yǎng)殖業(yè)每年因酮病造成的損失約為11億元。而亞臨床酮病因缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，常被養(yǎng)殖者所忽略，因此牛場應多關注酮病，減少酮病尤其是亞臨床酮病帶來的損失。本試驗通過研究亞臨床酮病奶牛的體況、產(chǎn)奶量、乳成分以及血液生化指標β-羥基丁酸(β-hydroxy butyric acid，BHBA)、非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)、葡萄糖(glucose，GLU)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、總膽固醇(cholesterol，CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)的改變，進一步了解奶牛亞臨床酮病給奶牛生產(chǎn)帶來的危害和發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗在河南鄭州某大型集約化牛場進行，采用自由臥欄、TMR飼喂，選擇產(chǎn)奶量相近、胎次為2～4胎的健康荷斯坦奶牛40 頭；采集奶牛相對產(chǎn)犢日期產(chǎn)前21、14、7 d，產(chǎn)后1、3、5、7、14、21 d 的尾靜脈血液樣品。血液樣本在晨飼前于尾靜脈根處使用肝素抗凝真空采血管采集，3 000 r/min 離心，15 min 分離血漿。同時跟蹤記錄奶牛產(chǎn)后8 周的泌乳量和產(chǎn)后第60 d 的乳成分，以及產(chǎn)前3 周～產(chǎn)后3 周的體況評分（body condition score，BCS）變化。

1.2 樣品檢測

β-羥基丁酸（BHBA）、非酯化脂肪酸（NEFA）、胰高血糖素（GC）、胰島素（INS）試劑盒，購于鈺博生物有限公司；血液中葡萄糖（GLU）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平，采用全自動生化分析儀進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

跟蹤奶牛任何采集時間點的血漿BHBA 濃度≥21.92 μmol/L[試劑盒健康奶牛參考值（8.21±2.75）μmol/L]為亞臨床酮病組（SCK組），各時間點血漿BHBA 濃度＜21.92 μmol/L 的奶牛為健康對照組。試驗開始時選取了40頭奶牛，其中4頭奶牛產(chǎn)前樣本量不足舍棄，最終樣本量為36 頭（SCK 組16 頭，C 組20頭）。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件預處理，SPSS 20.0軟件進行分析，結果以“平均值±標準差（X±S）”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 奶牛血液中BHBA濃度特征

對試驗所選奶牛進行統(tǒng)計，其中患有SCK的奶牛16 頭，占總數(shù)的44.4%。如表1 所示，在產(chǎn)前，高血酮水平的奶牛較少僅有4 頭，在產(chǎn)后5、7、14、21 d 分別有8、10、11、10 頭。不同組奶牛血液中BHBA 的特征如圖1所示，與C組相比，SCK組奶牛血液BHBA水平在產(chǎn)前一周開始逐漸升高，產(chǎn)后第3 d和第5 d顯著高于C 組（P＜0.05），產(chǎn)后7、14、21 d，SCK 組奶牛BHBA水平極顯著高于C 組（P＜0.01），表明了產(chǎn)后1～3 周是亞臨床酮病的高發(fā)時期。

表1 跟蹤牛群SCK發(fā)病特征

圖1 圍產(chǎn)期奶牛血液中BHBA的水平特征

2.2 奶牛體況評分的特征

跟蹤統(tǒng)計奶牛在產(chǎn)前3 周～產(chǎn)后3 周體況評分的變化特征如圖2 所示，SCK 組奶牛BCS 在產(chǎn)前高于C組，在產(chǎn)后低于C 組，差異不顯著（P＞0.05）。其中，C組奶牛在產(chǎn)前7 d～產(chǎn)后7 d 體況變化較大，SCK 組奶牛BCS 在產(chǎn)前7 d～產(chǎn)后14 d 下降迅速且產(chǎn)后體況評分≤2.5分牛的數(shù)量比C組多。

2.3 奶牛泌乳量和乳成分的特征

跟蹤統(tǒng)計牛群產(chǎn)后8周奶牛泌乳量的變化，如圖3 所示。奶牛在產(chǎn)后前4 周泌乳量增加較快，產(chǎn)后5～8 周泌乳量增加較慢，逐漸穩(wěn)定；與C 組相比，SCK 組奶牛產(chǎn)后5～8周的泌乳量雖然低于C 組，但沒有顯著性差異（P＞0.05）。奶牛產(chǎn)后第60 d 乳成分測定結果如表2所示，與C組相比，SCK組奶牛乳成分中乳脂率顯著高于C 組（P＜0.05），SCK 組乳脂和乳蛋白比值極顯著高于C組（P＜0.01），乳蛋白率低于C組（P＞0.05），體細胞數(shù)、尿素氮含量高于C 組，但兩組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 跟蹤牛群圍產(chǎn)期間體況評分變化

圖3 奶牛產(chǎn)后8周泌乳量特征

2.4 奶牛糖脂代謝相關血液生化指標特征

本試驗記錄了SCK 組和C 組奶牛產(chǎn)前產(chǎn)后血液中NEFA 的變化特征如圖4a 所示，結果發(fā)現(xiàn)：試驗牛在產(chǎn)前2～3 周血液中NEFA 升高緩慢，且SCK 組奶牛血液中NEFA 水平和C 組之間無顯著性差異（P＞0.05）；其中C 組奶牛在前7 d～產(chǎn)后3 d 上升迅速，產(chǎn)后5 d 逐漸恢復正常水平；SCK 組奶牛在產(chǎn)前7 d～產(chǎn)后7 d都處于上升的狀態(tài)，產(chǎn)后7 d開始下降，至產(chǎn)后21 d仍處于較高水平，其中在產(chǎn)后7 d、14 d，與C組相比，SCK組奶牛血液中NEFA顯著高于C組（P＜0.05）。

圖4 牛群糖脂代謝相關生化指標的特征跟蹤

奶牛血液中葡萄糖的水平如圖4b 所示，奶牛血液中葡萄糖的水平在產(chǎn)前2～3周無明顯變化，在產(chǎn)前7 d迅速升高，在產(chǎn)犢后又迅速下降。其中在產(chǎn)前，與C 組相比，SCK 組奶牛血糖水平和C 組之間無顯著差異（P＞0.05）；跟蹤發(fā)現(xiàn)SCK組奶牛在產(chǎn)后血糖水平下降比健康奶牛下降快，至產(chǎn)后7 d開始穩(wěn)定，產(chǎn)后14、21 d 開始逐漸恢復；與C 組相比，SCK 組奶牛血糖在產(chǎn)后下降較快，其中在產(chǎn)后3、5、7、21 d都顯著低于C組（P＜0.05）。

三酰甘油（TG）常用來反映血液中脂質水平，結果如圖4c所示，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：奶牛血液中TG的水平，在產(chǎn)前2～3周無明顯變化，產(chǎn)前1周至產(chǎn)犢當天迅速下降，在產(chǎn)后7 d開始逐漸升高，但仍處于較低水平，與C組相比，SCK組和對照組奶牛之間差異不顯著（P＞0.05）。

如圖4d～f 所示，在本研究中，SCK 組和C 組奶牛血液中CHO、HDL-C、LDL-C 的水平?jīng)]有顯著性差異（P＞0.05）；SCK 組奶牛CHO、HDL-C 的水平整體低于C組，LDL-C的水平低于C組，其中CHO、LDL-C的水平從產(chǎn)前開始到產(chǎn)犢，逐漸降低，產(chǎn)犢之后開始逐漸恢復。HDL-C的水平產(chǎn)后第5 d開始逐漸升高，產(chǎn)后第14 d趨于穩(wěn)定。

2.5 奶牛血液中胰高血糖素和胰島素的特征

跟蹤牛群圍產(chǎn)期血清中胰高血糖素（GC）的變化如圖5a所示，C組奶牛血清中GC的水平在產(chǎn)前1周迅速升高，產(chǎn)后1 d逐漸下降，產(chǎn)后5 d逐漸恢復至產(chǎn)前21 d水平。與C組相比，SCK組奶牛血清中GC的水平整體高于C組，但兩者之間差異不顯著（P＞0.05）。

奶牛血清中胰島素（INS）的水平如圖5b所示，與C 組相比，SCK 組奶牛血清中INS 的水平整體高于C組，但兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。其中，C組奶牛血清中INS在產(chǎn)后3 d迅速下降，產(chǎn)后第7 d恢復至產(chǎn)前水平；SCK 組在產(chǎn)前7 d 開始逐漸下降，產(chǎn)后第3 d下降至最低水平，第5 d之后逐漸恢復至產(chǎn)前水平。

圖5 牛群血液中胰高血糖素和胰島素的特征跟蹤

3 討論

酮病是圍產(chǎn)期奶牛高發(fā)的一種營養(yǎng)代謝性疾病，在奶牛妊娠后期至奶牛泌乳初期高發(fā)。患有酮病的奶牛泌乳性能和繁殖性能降低，真胃移位、脂肪肝病、胎衣不下、乳房炎等疾病的發(fā)病率會增加，增加了奶牛的淘汰率，縮短奶牛使用年限，給養(yǎng)殖場帶來巨大的經(jīng)濟損失。

3.1 SCK對圍產(chǎn)期奶牛生產(chǎn)性能的影響

體況評分是評估奶牛能量代謝和脂肪沉積狀況的一種常用方法，有研究表明，奶牛進入干奶期的體況最佳BCS 評分為3.00～3.25，圍產(chǎn)期奶牛維持在3.25～3.50，如果BCS過高就會增加產(chǎn)后癱瘓和酮病的發(fā)病率[7]。本試驗中，奶牛在產(chǎn)前21 d，SCK組BCS大于3.5 的奶牛有11 頭，占SCK 組的68.75%；C 組有7頭，占C組奶牛的33.33%。奶牛在產(chǎn)后1～2周體況評分下降的最快，同時在產(chǎn)后21 d，SCK 組奶牛的整體評分反而要低于C 組。說明產(chǎn)前21 d 奶牛BCS 評分高于3.5，產(chǎn)后發(fā)生酮病的風險就越大。有研究表明患有酮病的奶牛泌乳量降低，泌乳周期延長，配種次數(shù)、配種天數(shù)、產(chǎn)犢間隔都會延長[8]。本試驗跟蹤記錄奶牛產(chǎn)后1～8 周的泌乳量發(fā)現(xiàn)，SCK 組奶牛與C 組奶牛相比差異并不顯著。但是，奶牛在產(chǎn)后第1～2 周，SCK 組奶牛泌乳量升高速度低于C 組奶牛，結合NE?FA 的水平，可能是由于SCK 組奶牛此時仍處于能量負平衡狀態(tài)（NEB），葡萄糖的生成不足以滿足機體需求，導致泌乳量的恢復滯后于C 組；還發(fā)現(xiàn)SCK 組奶牛，在產(chǎn)后5～8周泌乳量的水平低于C組，隨著酮病的持續(xù)發(fā)展，會繼續(xù)降低奶牛的產(chǎn)奶量。NEFA是脂肪分解的產(chǎn)物，檢測奶牛血液中NEFA的水平可以在一定程度上反映奶牛脂肪動員的情況。圍產(chǎn)期奶牛處于能量負平衡狀態(tài)時會促進體內脂肪的分解，血液中NEFA升高，會導致乳脂含量增加和乳蛋白含量降低[9-10]。本研究檢測乳成分發(fā)現(xiàn)，SCK 組奶牛乳脂率顯著高于C 組，SCK 組奶牛脂蛋比＞1.4，極顯著高于C 組，結果與Buckley 等[11]研究中結果基本一致，且較高的脂蛋比被認為是高風險牛酮病的特征之一。兩組奶牛乳樣中乳蛋白率、體細胞數(shù)、尿素氮的含量沒有顯著性差異，但是SCK 組尿素氮、體細胞數(shù)高于C 組，與Yang等[12]的試驗結果基本一致。孫先枝等[13]在研究酮病對荷斯坦奶牛泌乳性能的影響時發(fā)現(xiàn)，在奶牛胎次為1～2胎時，酮病高風險組奶牛乳中體細胞數(shù)比中、低風險酮病組顯著或極顯著升高。表明酮病會導致奶牛乳品質的下降，如果不及時治療或預防會降低產(chǎn)奶量。

3.2 酮病對圍產(chǎn)期奶牛血液中糖脂代謝相關指標的影響

奶牛在圍產(chǎn)后期胎兒生長發(fā)育迅速及產(chǎn)后泌乳需要大量的葡萄糖提供機體所需要的能量，反芻動物體內葡萄糖的來源主要依靠糖異生作用。圍產(chǎn)期奶牛體內激素水平變化劇烈且面臨著分娩應激、氧化應激等應激，食欲下降導致攝入的能量不足以滿足奶牛日常消耗。為了彌補能量的不足，機體就會促進體內脂肪的動員，脂肪被分解為甘油和脂肪酸，甘油通過糖異生途徑形成葡萄糖為機體提供能量，脂肪酸在肝臟內通過β氧化形成乙酰輔酶A，進入檸檬酸循環(huán)，最終產(chǎn)生能量。當過多的脂肪酸超過肝臟的代謝能力時，會被不完全氧化為酮體，酮體在血液中積累引發(fā)酮病。本試驗中，SCK 組奶牛產(chǎn)后血液中GLU 降低，NEFA、BHBA 的濃度迅速升高且顯著高于C 組，表明SCK組奶牛處于比較嚴重的NEB狀態(tài)，體內脂肪動員程度較大，引起體況評分在這一段時間急劇下降。脂肪動員產(chǎn)生大量的游離脂肪酸在血液中以不同脂質類別的形式運輸[例如中性脂質（-NL-），磷脂（PL-），NEFA][14]。NL包括三酰甘油（TG）、二酰甘油等，NL和PL都是通過脂蛋白運輸?shù)摹Ｖ鞍装O低密度脂蛋白、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），其功能是將這些脂質保持在水溶液中[15]。HDL由肝臟合成，在生理上可與肝外組織多余的膽固醇結合為HDL-C并把沉積于血管壁的LDL-C、TG等有害物質轉運到肝臟進行分解排泄、抗氧化等功能，能夠促進膽固醇逆向轉運，即將外周組織中多余的膽固醇運輸?shù)礁闻K合成膽汁酸、脂蛋白等。LDL是運輸內源性膽固醇的主要載體，將膽固醇從肝臟運輸?shù)襟w內其余組織?？偰懝檀迹–HO）作為細胞膜的成分，能夠維持細胞的形態(tài)和功能，是類固醇激素和膽汁酸的前體，主要由肝臟合成，其次在小腸、卵巢等組織。對脂肪代謝異常和某些肝膽疾病的診斷具有一定意義。本研究中發(fā)現(xiàn)SCK組奶牛血液中TG 的水平與C 組奶牛并無明顯變化；CHO、HDL-C 的水平低于C 組，可能是由于SCK 奶牛肝功能受損，進而導致肝臟合成CHO、HDL 的能力受到抑制所導致，與林根祥[16]研究結果一致。但是楊威等[17]研究中發(fā)現(xiàn)，酮病組血液中的HDL-C顯著高于對照組，認為是由于能量負平衡或者膽汁酸分泌不足，促進小腸和肝臟中HDL 的合成增加所致。本試驗中SCK組奶牛LDL-C的水平低于C組，可能由于患有亞臨床酮病的奶牛。采食量下降，導致營養(yǎng)物質攝取不足和肝臟功能不全引起的。

葡萄糖是機體能量代謝的重要物質，也是用來衡量機體能量代謝狀態(tài)的常用指標之一。血糖水平受到肝臟、激素和神經(jīng)系統(tǒng)的共同調節(jié)，肝臟主要通過糖異生、糖原轉化、糖轉脂肪等方式調節(jié)機體對糖的需求。神經(jīng)系統(tǒng)主要通過調節(jié)胰島素、胰高血糖素、腎上腺素等激素來實現(xiàn)對血糖的調控。胰島素在維持血糖平衡和抗脂解中發(fā)揮重要作用[18]。胰高血糖素是由A胰島細胞分泌的一種多肽激素，主要作用于肝臟，促進糖肝原的分解，抑制糖原合成，促進葡萄糖異生，還能促進脂肪分解，使酮體生成增多，并使氨基酸加速進入肝細胞，脫去氨基，經(jīng)葡萄糖異生途徑轉化為糖[19]。在本研究中，C 組奶牛血液中的胰島素水平在產(chǎn)前7 d～產(chǎn)后3 d 上升，說明外周組織對胰島素的敏感性降低，出現(xiàn)了胰島素抵抗現(xiàn)象，適度的胰島素抵抗能促進體內脂肪的代謝，緩解能量負平衡，在產(chǎn)后第5 d下降到正常水平，表明機體的NEB狀態(tài)得到緩解。SCK組奶牛血液中胰島素的水平在試驗期間整體高于C組，但是血液中葡萄糖的水平低于C組，表明SCK 組奶牛一直處于NEB。試驗期間，C 組奶牛血液中胰高血糖素的水平，與產(chǎn)前7 d相比，產(chǎn)后1 d迅速升高，也說明了奶牛在這一段時間內處于NEB，需要機體動員脂肪分解產(chǎn)生能量。SCK組奶牛血液中胰高血糖素的水平整體高于C 組，表明SCK 組奶牛長期處于NEB狀態(tài)，攝入的能量不足以滿足機體需要，需要消耗大量的脂肪來產(chǎn)生葡萄糖，同時脂肪的分解也導致了酮體的產(chǎn)生，進而導致酮病的發(fā)生。

4 結論

本試驗證明在產(chǎn)后5～21 d 內，酮病發(fā)病率較高。SCK能夠在一定程度上降低奶牛的產(chǎn)奶量，使乳汁中乳脂率、體細胞數(shù)升高，乳蛋白率降低，影響奶品質；SCK奶牛血液中BHBA、NEFA、LDL-C、GC、INS的水平會升高，GLU、HDL-C、CHO 的水平降低，危害奶牛的健康。以上結果為揭示SCK 奶牛血液生理生化指標的變化、指導預防和治療奶牛酮病，減少酮病給奶牛帶來的危害和經(jīng)濟損失都有參考作用。