沉默PRLR表達(dá)增加胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的耐藥性

張一帆，黃佩琦，孫悅，潘泓，蓋嚴(yán)支，聶惠貞

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarinoma，PDAC）是一種常發(fā)的胰腺腫瘤，其5年生存率長(zhǎng)期低于10%且發(fā)病率有上升趨勢(shì)[1]。PDAC由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，各種免疫細(xì)胞和致密間質(zhì)組成其復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境[2]。致密的腫瘤微環(huán)境能夠促進(jìn)PDAC細(xì)胞對(duì)于機(jī)體免疫系統(tǒng)的逃逸作用，提高腫瘤對(duì)于化法和放射療法的抵抗能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力。此外，PDAC的早期診斷率低，缺乏有效的診斷手段，手術(shù)率低且多數(shù)患者確診時(shí)都伴有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[3-4]。目前，對(duì)于PDAC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚不明確，也沒(méi)有有效的靶向藥物。因此，加強(qiáng)對(duì)PDAC的研究十分必要。

激素是指由內(nèi)分泌腺或內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的，具有微量、高效和專(zhuān)一性特點(diǎn)的生物活性分子，其在靶器官組織中作為信使傳遞信息，發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。除了在生理功能中的作用外，已有多項(xiàng)研究表明激素[如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、表皮生長(zhǎng)因子和雄激素等]在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要的作用[5-6]。研究顯示，催乳素（prolactin，RPL）由垂體前葉分泌，其在體內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)乳腺發(fā)育、刺激泌乳和免疫調(diào)節(jié)等生理功能[7]。催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）是催乳素的專(zhuān)一性受體，同時(shí)也是細(xì)胞因子受體家族的一員。目前研究表明，活化的PRLR能夠激活下游Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）、Src-磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱(chēng)AKT）、Ras-Raf-絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activate protein kinase，MAPK）和NIMA相關(guān)激酶3（NIMA related kinase 3，NEK3）-鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子2（vav guanine nucleotide exchange factor 2，VAV2）-RAC1等通路[8-11]。目前關(guān)于PRLR的研究多存在于婦科腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌等）和前列腺癌中。在PDAC中，有報(bào)道稱(chēng)單核巨噬細(xì)胞來(lái)源的PRL可以與組織中分布于巨噬細(xì)胞和胰腺癌前病變胰腺導(dǎo)管上皮內(nèi)瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）細(xì)胞表面的PRLR結(jié)合，促進(jìn)組織纖維化和PDAC的進(jìn)展[12]。

吉西他濱（gemcitabine）是一種被廣泛應(yīng)用與局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的單藥化療脫氧胞苷類(lèi)化療藥物[13]。吉西他濱在體內(nèi)代謝后會(huì)形成嘧啶的類(lèi)似物，與dCTP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合參與DNA復(fù)制過(guò)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，患者在接受了一定時(shí)間的吉西他濱治療后，會(huì)出現(xiàn)腫瘤耐藥的現(xiàn)象。以往研究多集中在如何增加腫瘤微環(huán)境中的吉西他濱藥物濃度以提高其作用效果，因此本研究旨在尋找吉西他濱的潛在耐藥機(jī)制，尋找關(guān)鍵耐藥分子，為進(jìn)一步解決其耐藥問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DEME培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，RT-qPCR Mix試劑盒購(gòu)自上海圣爾生物科技有限公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。鼠抗人PRLR單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，鼠抗人轉(zhuǎn)酮醇酶（transketolase，TKT）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）和β-actin（內(nèi)參照）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，鼠抗人轉(zhuǎn)酮醇酶（transketolase，TKT）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）和β-actin（內(nèi)參照）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。手術(shù)獲得，并確診為PDAC的癌及癌旁組織由上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院膽胰外科提供，所有患者均知情同意且獲得倫理審批。

多功能酶標(biāo)儀（Infinite M1000 PRO）為瑞士Tecan公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7500）為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡（NI-E）為日本Nikon公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀（LSRFortessa）為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，電泳儀（1658033）為Bio Rad公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PDAC細(xì)胞系PANC-1和SW-1990以及胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPNE均購(gòu)自美國(guó)模式菌種保藏中心，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。所有細(xì)胞培養(yǎng)操作均依照美國(guó)模式菌種保藏中心標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，用含10%FBS以及1%青霉素鏈霉素雙抗的DEME培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代。

1.3 PRLR的篩選

利用基因綜合表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE102238、GSE15471和GSE71729這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選PDAC中表達(dá)差異的基因。將GEO測(cè)序數(shù)據(jù)分為PDAC組織和癌旁正常組織組，利用R語(yǔ)言和GraphPad進(jìn)行表達(dá)差異的分析，之后對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行匯總、分析和篩選。

1.4 患者的生存分析

下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中PDAC患者數(shù)據(jù)，去除數(shù)據(jù)集中的癌旁組織測(cè)序數(shù)據(jù)。之后根據(jù)PRLR表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)行分組，將所有數(shù)據(jù)分為PRLR高表達(dá)組和PRLR低表達(dá)組。將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PDAC患者測(cè)序數(shù)據(jù)與患者臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，利用Graphpad 對(duì)患者進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank Mantel-COX檢驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

收集PDAC細(xì)胞系PANC-1和SW-1990以及胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPNE，采用RNAiso Plus試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)量樣品RNA濃度。每組各取400 ng總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；隨后以cDNA為模板采用RT-qPCR Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；以18 S為內(nèi)參照，以2－ΔΔCt值表示目的基因的表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。PRLR基因上游引物序列 為5’-CAGACCCTCCTTTGGAGCTG-3’，下游引物序列為5’-TCAGCTGCTTTCTCGG GTTT-3’；TKT基因上游引物序列為5’-TCCA CACCATGCGCTACAAG-3’，下游引物序列為5’-CAAGTCGGAGCTGATCTTCCT-3’；G6PD基因上游引物序列為5’-CGAGGCCGTC ACCAAGAAC-3’，下游引物序列為5’-GTAGT GGTCGATGCGGTAGA-3’；18S上游引物序列 為5’-TGCGAGTACTCAACACCAACA-3’，下游引物序列為5’-GCATATCTTCGGCCC AC A-3’。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

收集PDAC細(xì)胞系PANC-1和SW-1990以及胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPNE（各5×106個(gè)），采用RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品）裂解細(xì)胞后提取總蛋白，并利用BCA試劑盒（美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品）檢測(cè)各樣品的蛋白濃度。各組細(xì)胞取適量的蛋白處理后，采用10%SDS-PAGE分離蛋白（80 V恒壓電泳濃縮蛋白樣品，120 V恒壓電泳分離蛋白）。電泳終止后，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上（恒定電壓110 V電轉(zhuǎn)60 min）。電轉(zhuǎn)結(jié)束后將硝酸纖維膜放入含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的封閉液中封閉1 h；隨后將硝酸纖維膜浸泡在一抗工作液中（抗體稀釋比例參閱抗體使用說(shuō)明書(shū)），4 ℃搖床孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用1×TBST清洗膜；之后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（體積稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育1 h后，用電化學(xué)發(fā)光液顯色，拍照并保存結(jié)果。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將PDAC組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。首先，將石蠟切片置入金屬架內(nèi)，放入二甲苯和乙醇溶液中進(jìn)行脫蠟和水化。將水化完成的切片完全沒(méi)入檸檬酸鈉溶液內(nèi)，沸水浴20 min。水浴結(jié)束后將清洗好的切片盡量甩干，滴入0.3%的過(guò)氧化氫-甲醇溶液覆蓋組織，放入濕盒內(nèi)，37 ℃孵育30 min。孵育完成后利用10% BSA溶液覆蓋組織，放入濕盒內(nèi)，室溫孵育60 min。依照抗體說(shuō)明書(shū)利用1% BSA溶液配制PRLR（體積稀釋比例為1∶200）抗體工作液，甩掉組織表面封閉液，滴入抗體覆蓋組織，放入濕盒內(nèi)。4 ℃過(guò)夜孵育。次日，依照抗體說(shuō)明書(shū)利用10% BSA溶液配制HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（體積稀釋比例為1∶200）工作液。小心甩干組織周?chē)?，用二抗工作液覆蓋組織。將切片放入濕盒。室溫孵育1 h。二抗孵育完成后，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制DAB顯色液。小心甩干組織周?chē)郑肈AB顯色液覆蓋組織，待肉眼觀察到明顯黃色后，將切片放入流水中沖洗10 min以終止反應(yīng)。將切片放入蘇木素復(fù)染液內(nèi)30 s，隨后流水終止反應(yīng)。最后，將切片按照脫蠟/水化相反過(guò)程過(guò)缸并利用二甲苯溶液溶解中性樹(shù)脂（1∶1）。將混合液滴在組織上，覆上蓋玻片，輕壓玻片除去氣泡。之后放入通風(fēng)櫥干燥。在光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為200倍）下觀察切片的染色情況，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評(píng)判參閱參考文獻(xiàn)[15]提供的標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 基因集富集分析（Gene Set Enrichment analysis，GSEA）與共表達(dá)分析

下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者的數(shù)據(jù)，去除數(shù)據(jù)集中的癌旁組織測(cè)序數(shù)據(jù)。之后根據(jù)PRLR表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)行分組，將所有患者分為PRLR高表達(dá)組和PRLR低表達(dá)組。利用GSEA軟件中Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因富集分析。之后根據(jù)normalized enrichment score（NES）和False discovery rate（FDR）的q值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇和篩選。

采用linkedomics（http://www.linkedomics.org）進(jìn)行基因共表達(dá)分析[16]。在linkedomics中選擇PDAC患者的測(cè)序數(shù)據(jù)，并根據(jù)PRLR表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.9 采用shRNA干擾技術(shù)沉默PANC-1和SW-1990細(xì)胞中PRLR的表達(dá)

采用shRNA干擾技術(shù)沉默PANC-1和SW-1990細(xì)胞中PRLR的表達(dá)水平。PRLR-shRNA（shPRLR）的序列為5’-AGCAGCTGATTCCAGAACA-3’，陰性對(duì)照（negative control，NC）-shRNA（shNC）的序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（所有shRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建）。利用REV、GAG和VSV進(jìn)行慢病毒包裝后，對(duì)胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染以構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.10 CCK-8法檢測(cè)沉默PRLR表達(dá)對(duì)PANC-1和SW-1900細(xì)胞耐藥性的影響

將PANC-1和SW-1900細(xì)胞（shNC組和shPRLR組）接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞貼壁后除去原有培養(yǎng)液，用PBS進(jìn)行清洗細(xì)胞。之后，依次加入含有0、1 000 000、100 000、10 000、1 000、100、10和1 nmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液。37 ℃培養(yǎng)72 h后，加入CCK-8試劑，具體流程依據(jù)使用說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)結(jié)束后在免疫酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔的D值，并利用GraphPad計(jì)算吉西他濱對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

1.11 細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

將PANC-1和SW-1900細(xì)胞（對(duì)照組和shPRLR組）接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度合適時(shí)，換為無(wú)血清培養(yǎng)葉饑餓腫瘤細(xì)胞24 h。將各組細(xì)胞消化重懸后，用碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Annexin Ⅴ染色細(xì)胞（具體流程依據(jù)凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)），同時(shí)準(zhǔn)備裸細(xì)胞，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism軟件和R語(yǔ)言對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以表示。生存分析利用Kaplan-Meier法，并采用log-rank Mantel-COXtest進(jìn)行檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRLR在PDAC組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況

首先利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者的測(cè)序數(shù) 據(jù)（GSE102238、GSE15417和GSE71729）進(jìn)行表達(dá)差異基因的篩選。GSE102238和GSE15417數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PRLR在PDAC組織中的表達(dá)水平均明顯低于正常癌旁組織（P均＜0.01）；GSE71729數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PRLR在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)水平明顯低于正常肝組織（P＜0.01）（圖1A）。這一結(jié)果提示，PRLR在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

為了進(jìn)一步明確PRLR對(duì)PDAC的影響，通過(guò)下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者的數(shù)據(jù)，對(duì)患者進(jìn)行了生存分析。結(jié)果（圖1B）顯示，PRLR高表達(dá)組患者（88例）的總生存（overall survival，OS）和無(wú)病生存（disease-free survival，DFS）時(shí)間均長(zhǎng)于PRLR低表達(dá)組（86例）患者（P均＜0.01）。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步闡明了，PRLR對(duì)于PDAC發(fā)展可能發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。

為了進(jìn)一步研究PRLR在PDAC中的變化趨勢(shì)，本研究對(duì)來(lái)源于自發(fā)PDAC小鼠模型的腫瘤測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析（GSE33322）。結(jié)果（圖1C）表明，PRLR在從正常組織發(fā)展為PanIN組織過(guò)程中，表達(dá)量的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在從PanIN發(fā)展為PDAC的過(guò)程中其表達(dá)量明顯降低。這種趨勢(shì)提示，PRLR的作用更可能發(fā)生在PDAC的發(fā)展階段而不是發(fā)生階段。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRLR在腫瘤中的表達(dá)情況，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PRLR mRNA和蛋白在胰腺癌PANC-1和SW-1990細(xì)胞以及正常胰腺導(dǎo)管上皮HPNE細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胰腺癌PANC-1和SW-1990細(xì)胞中PRLR mRNA（圖2A）和蛋白（圖2B）的表達(dá)水平均較HPNE細(xì)胞明顯下調(diào)（P均＜0.01）。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果（圖2C）顯示，相對(duì)于癌旁正常胰腺組織，PDAC組織中PRLR（棕黃色部分）的表達(dá)量更低。

以上這些結(jié)果表明，PRLR在PDAC組織中的表達(dá)降低，且PRLR低表達(dá)與患者的不良生存關(guān)系密切。因此，PRLR可能在PDAC中發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

Fig.1 Gene Expression Omnibus (GEO) database and The Cancer Genome Atlas (TCGA) databases analysis showed that prolactin receptor (PRLR) were low expressed in pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC) and correlated with poor prognosis.A:Statistics of PRLR expression in GSE102238 (50 cases),GSE15471 (39 cases) and GSE71729 (25 case) databases.GSE102238 and GSE15417 revealed the changes expression level of PRLR mRNA between PDAC tissues and normal tissues;GSE71729 showed the change expression of PRLR mRNA between pancreatic cancer liver metastasis tissues (Met-liver) and normal tissues (Nor-liver).B:The survival analysis of PRLR expression with TCGA database.The group divided by median of PRLR expression.C:Statistics of PRLR expression in GSE33322 database.PanIN:Pancreatic intraepithelial neoplasia;*P＜0.05;**P＜0.01.圖1 采用GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示PRLR在PDAC組織中低表達(dá)且與患者的不良預(yù)后相關(guān)

Fig.2 The expression level of prolactin receptor (PRLR) mRNA and protein in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells (PANC-1 and SW-1900) or PDAC tissue were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (A),Western blotting (B) and immunohistochemistry (C,DAB staining,bar=100 μm).Normal pancreatic ductal HPNE cells as the control.*P＜0.05;**P＜0.01 (n=3).圖2 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（A）、蛋白質(zhì)印跡法（B）和免疫組織化學(xué)法（C）檢測(cè)PRLR mRNA和蛋白在PDAC細(xì)胞以及腫瘤組織中的表達(dá)水平

2.2 PRLR低表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞耐藥性相關(guān)

為了進(jìn)一步探討PRLR與PDAC發(fā)展之間的關(guān)系，本研究中通過(guò)收集獲得的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PDAC患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行了GSEA分析。將PRLR依據(jù)其表達(dá)中位數(shù)分為低表達(dá)組與高表達(dá)組并利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因富集分析。結(jié)果（圖3A）顯示，PRLR低表達(dá)與PDAC細(xì)胞中JAKSTAT通路、TGF-β通路和Wnt通路的激活相關(guān)。有研究表明，Wnt通路可以通過(guò)誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），提高活化T細(xì)胞核因子2（nuclear factor of activated T cells 2，MFATc2）、微RNA（microRNA，miR）-29a和miR-33a等方式提高胰腺癌對(duì)于吉西他濱的耐藥性[17]。TGF-β通路也被報(bào)道稱(chēng)可以通過(guò)促進(jìn)CYR61的表達(dá)來(lái)提高PDAC細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性[18]。最后JAK-STAT通路的抑制劑目前也正在被開(kāi)發(fā)作為吉西他濱或者紫杉醇輔助藥物以降低胰腺癌的耐藥性[19]。

利用linkedomics數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PRLR進(jìn)行共表達(dá)分析，以找出與PRLR表達(dá)相關(guān)的基因。結(jié)果（圖3B）表明，當(dāng)PRLR表達(dá)量下調(diào)時(shí)，與腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)的基因谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione-S-transferase P1，GSPT1）的表達(dá)量顯著上升[20]，而與降低腫瘤耐藥性相關(guān)的黏附G蛋白偶聯(lián)受體V1（adhesion G-protein coupled receptor V1，GPR98）基因的表達(dá)量明顯下調(diào)[21]。

以上所有結(jié)果均提示，PRLR表達(dá)量的下降可能會(huì)導(dǎo)致PDAC細(xì)胞耐藥性的升高。

2.3 PRLR表達(dá)量的下調(diào)可提高PDAC細(xì)胞的IC50值并抑制其凋亡率

為了驗(yàn)證PRLR的表達(dá)是否與PDAC細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。本研究中首先采用shRNA技術(shù)沉默SW-1990和PANC-1細(xì)胞中PRLR的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖4A和圖4B）顯示，SW-1990和PANC-1細(xì)胞中PRLR mRNA（圖4A）和蛋白（圖4B）的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.01）。

Fig.3 Low expression of prolactin receptor (PRLR) related with chemotherapy resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC).A:Gene set enrichment analysis (GSEA) using Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) gene sets was performed to compare the low level expression and high level expression of PRLR in The Cancer Genome Atlas (TCGA) database.NES:Normalized enrichment score;FDR:False discovery rate.B:The co-expression analysis of PRLR with PDAC RNA-sequence data in linkedomics dataset.Result was analyzed by Z-score.圖3 PRLR低表達(dá)與PDAC細(xì)胞耐藥性相關(guān)

吉西他濱是目前胰腺癌治療的一線化療藥物。采用不同濃度的吉西他濱處理SW-1990和PANC-1細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算IC50值。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖4C）表明，SW-1990細(xì)胞中，對(duì)照組的IC50值為（145.4±12.7）nmol/L，而敲低PRLR表達(dá)后（shPRLR組），IC50值上升為（368.5±33.3）nmol/L；PANC-1細(xì)胞中，對(duì)照組的IC50值為（70.0±16.9）nmol/L，而敲低PRLR表達(dá)后，IC50值上升為（230.6±26.4）nmol/L；與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。這一結(jié)果提示，PRLR表達(dá)下調(diào)能夠提高PDAC細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性。

FCM檢測(cè)結(jié)果（圖4D）顯示，對(duì)照組中PANC-1細(xì)胞的凋亡率為（16.28±1.38）%，SW-1990細(xì)胞為（19.66±0.94）%；而敲低PRLR表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為（9.54±1.54）%，SW-1990細(xì)胞為（14.92±2.05）%。這一結(jié)果提示，沉默PRLR表達(dá)可以顯著降低PDAC細(xì)胞的凋亡水平。

Fig.4 Effect of down-regulation of prolactin receptor (PRLR) expression on half maximal inhibitory concentration (IC50) value and apoptosis rate of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells (PANC-1 and SW-1900).The expression level of PRLR mRNA (A) and protein (B) in PANC-1 and SW-1990 cells infected with lentivirus carrying shPRLR (targating PRLR geng) were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting.The cell survival of PANC-1 and SW-1990 cells treatment with different concentrations gemcitabine were detected by CCK-8 method (C) and the apoptosis rate was detected by FCM (D).*P＜0.05,**P＜0.01 (n=3).圖4 下調(diào)PRLR表達(dá)對(duì)PANC-1和SW-1990細(xì)胞IC50值和凋亡率的影響

上述結(jié)果提示，低表達(dá)PRLR可以通過(guò)提高PDAC的耐藥性和降低胰腺癌細(xì)胞的凋亡水平促進(jìn)PDAC的發(fā)展。

2.4 下調(diào)PRLR表達(dá)提高PDAC細(xì)胞中G6PD和TKT的表達(dá)量

為了探究PRLR對(duì)提高PDAC細(xì)胞系耐藥性的機(jī)制，進(jìn)一步利用胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選分析后發(fā)現(xiàn)，PRLR mRNA水平與G6PD和TKT的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（圖5A）。G6PD和TKT是磷酸戊糖途徑上的2個(gè)重要的酶，戊糖磷酸通路可以生成嘧啶類(lèi)核苷酸從而拮抗吉西他濱，提高腫瘤細(xì)胞的耐藥性[22]。因此，PRLR可能是通過(guò)調(diào)控G6PD和TKT來(lái)提高細(xì)胞對(duì)于吉西他濱的耐藥性的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖4B和4C）均顯示，沉默PRLR表達(dá)后，G6PD和TKT的表達(dá)量均明顯上調(diào)（P均＜0.01）。由此提示，PRLR是通過(guò)提高G6PD和TKT的表達(dá)水平來(lái)提高細(xì)胞耐藥性的。

Fig.5 Correlation analysis of prolactin receptor (PRLR) with transketolase (TKT) and glucose-6-phosphatedehydrogenase (G6PD) mRNA expression level using The Cancer Genome Atlas (TCGA)database (A) and the effect of knockdown of PRLR expression on G6PD and TKT mRNA and protein expression levels in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells (PANC-1and SW-1990) were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting (B).**P＜0.01 (n=3).圖5 采用TCGA數(shù)據(jù)分析PRLR與TKT和G6PD mRNA表達(dá)的相關(guān)相關(guān)性（A）以及敲低PRLR表達(dá)對(duì)PDAC細(xì)胞中G6PD和TKT mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響（B）

3 討論

胰腺癌是一種惡程度非常高的腫瘤，其5年生存率長(zhǎng)期不到10%。導(dǎo)致這種現(xiàn)象主要原因?yàn)橐认侔┰缙谠\斷困難，診斷率低，確診時(shí)患者往往已處于腫瘤中晚期且伴有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[3]。而對(duì)于中晚期患者來(lái)說(shuō)，胰腺癌又對(duì)化學(xué)治療和放射治療有著很好的抵抗性，且缺乏高效的靶向藥物，治療效果一直不理想[2]。在胰腺癌中，PDAC所的比例高達(dá)90%[23]。因此，研究PDAC發(fā)生、發(fā)展和耐藥機(jī)制是十分有必要的。

PRL在體內(nèi)調(diào)控多種生理功能，如調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能和白棕脂肪的轉(zhuǎn)化等調(diào)節(jié)代謝，調(diào)節(jié)壓力與腎上腺功能，調(diào)節(jié)進(jìn)食與泌乳等[24]。PRLR是PRL的專(zhuān)一性受體，不僅能在生理狀態(tài)下作為PRL的專(zhuān)一性受體發(fā)揮功能，同時(shí)也影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在肺癌和前列腺癌中，PRLR都被作為了潛在治療靶點(diǎn)，一些針對(duì)PRLR的治療手段正在開(kāi)發(fā)中[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，PRLR在胰腺癌中表達(dá)量下降，這種下降會(huì)導(dǎo)致磷酸戊糖途徑中耐藥相關(guān)基因的上調(diào)，從而增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)于吉西他濱的耐藥性。同時(shí)，PRLR表達(dá)量的下降也會(huì)降低胰腺癌細(xì)胞的凋亡水平。

磷酸戊糖途徑中磷酸戊糖途徑是細(xì)胞內(nèi)合成核苷酸的重要方式，其產(chǎn)物5-磷酸核是核苷酸從頭合成途徑的唯一來(lái)源，在細(xì)胞DNA合成中發(fā)揮重要作用。本研究提示，PRLR能夠負(fù)調(diào)控磷酸戊糖途徑中G6PD和TKT的表達(dá)水平。胰腺癌細(xì)胞通過(guò)降低PRLR的表達(dá)量，從而提高磷酸戊糖途徑的活性，增加細(xì)胞嘧啶核苷酸的產(chǎn)量，對(duì)吉西他濱這類(lèi)嘧啶核苷酸類(lèi)似物藥物產(chǎn)生拮抗作用，提高細(xì)胞的抗藥性。

綜上所述，PRLR可通過(guò)調(diào)控G6PD和TKT的表達(dá)水平調(diào)節(jié)細(xì)胞磷酸戊糖途徑從而提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性，因此PRLR有望成為胰腺癌分子靶向治療及預(yù)后評(píng)估的一個(gè)潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。