黃芪-莪術(shù)對人乳腺癌的抑制作用及其機制

鄧 櫻,唐潤偉,衛(wèi) 菊,樂 楓,劉云龍,錢耀明

(上海市第一人民醫(yī)院中醫(yī)外科,上海 200080)

乳腺癌(breast cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在逐年上升[1,2]。目前中醫(yī)藥是治療乳腺癌的有效輔助手段,對于無法從常規(guī)腫瘤放化療的治療手段中獲益的病人,中醫(yī)藥保守治療是重要選擇。中醫(yī)認為乳腺癌的病因是內(nèi)傷清志、痰瘀互結(jié)、正氣虧虛,治療以疏肝解郁、化痰散淤、調(diào)補氣血為主[3]。黃芪、莪術(shù)是傳統(tǒng)中醫(yī)治療乳腺癌的對癥藥物,中藥黃芪有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌的作用,莪術(shù)主治氣血凝滯、心腹脹痛等疾病[4,5]。近年研究報道,黃芪與莪術(shù)通過參與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移,以及抗血管生成等多種代謝機制影響腫瘤的生存與進展[6-8]。因此,本研究通過建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,選用補氣活血中藥黃芪、莪術(shù)對乳腺癌移植瘤裸鼠進行治療,觀察治療效果;且由于在前期研究當中我們發(fā)現(xiàn)黃芪注射液及其有效成分對乳腺癌細胞增殖和Akt磷酸化有一定的影響[9],猜測其對于乳腺癌細胞增殖抑制與PI3K-Akt信號通路密切相關(guān),因此在本研究中我們重點關(guān)注黃芪、莪術(shù)對PI3K-Akt信號通路的影響,從而希望通過分子生物學角度探索黃芪、莪術(shù)聯(lián)合治療乳腺癌的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及動物

人乳腺癌MDA-MB-231細胞,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。MDA-MB-231細胞使用L15培養(yǎng)基(Leibovitz’s L-15 Medium,Thermo Fisher Scientific,USA)和10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,Thermo Fisher Scientific,USA)培養(yǎng),每隔2 d傳代一次。雌性SPF級裸鼠共18只,每組3只,周齡6-8周,購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

蘇木素(上海展云化工有限公司),伊紅(上海展云化工有限公司),4%多聚甲醛(無錫菩禾有限公司),PBS(無錫菩禾有限公司),中性樹膠(中國上海懿洋儀器有限公司),TUNEL檢測試劑盒(上海凱基有限公司KGA7033),0.25%胰蛋白酶(上海碧云天有限公司),Trizol(賽默飛世爾科技),DEPC處理水(無錫菩禾有限公司),SYBR Green PCR試劑盒(Thermo F-415XL),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技#K1622),BCA蛋白定量試劑盒(BIOSHARP生物科技公司),30%丙烯酰胺(29 ∶1)(上海國藥集團化學試劑有限公司),1.5 mol/L Tris-HCl pH=8.8電泳緩沖液(上海國藥集團化學試劑有限公司),1.0 mol/L Tris-HCl pH=6.8電泳緩沖液(上海國藥集團化學試劑有限公司),10% SDS(上海國藥集團化學試劑有限公司),10%過硫酸銨(SIGMA,美國),TEMED(SIGMA,美國),4×蛋白上樣緩沖液(寶日生物技術(shù)有限公司),蛋白預染Marker(賽默飛世爾科技),5% BSA(BIOSHARP生物科技公司),Tween-20(Amresco Ltd,美國),發(fā)光液(Millipore,美國)。

1.3 實驗儀器

游標卡尺,超凈工作臺(蘇州安泰科技有限公司),光學顯微鏡(OLYMPUS,IX71,日本),低溫冷凍離心機(Sigma Ltd,3K15,美國),ABI 7500 Fast Real-Time PCR system PCR儀(安捷倫有限公司,美國),PVDF膜(Millipore,美國),電泳儀(mini protean 3 cell,美國BIO-RAD有限公司),電轉(zhuǎn)儀(PS-9,大連競邁科技有限公司),酶標儀(賽默飛世爾科技,MK3),移液器(賽默飛世爾科技),一體式化學發(fā)光成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司,Chemi Scope 5300 Pro)。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥物制備 中藥材均購買于中國中藥有限公司。其中黃芪為豆科植物蒙古黃芪的根,產(chǎn)地為我國黑龍江省依蘭縣;莪術(shù)為姜科植物莪術(shù)的根莖,產(chǎn)地為我國廣西壯族自治區(qū)。中藥黃芪、莪術(shù)經(jīng)過浸泡,用傳統(tǒng)水煎法提取其中的有效成分,黃芪、莪術(shù)提取物濃度均為0.4 g/ml,根據(jù)動物公斤體質(zhì)量劑量換算系數(shù)換算法:以臨床實際用藥劑量作為參考量,即黃芪、莪術(shù)均30 g,以成人標準體質(zhì)量70 kg計算,根據(jù)鼠劑量=人劑量×9.01,即裸鼠劑量約為3 900 mg/kg,每只裸鼠按照20 g標準體質(zhì)量計算,即單只小鼠的應用量為78 mg,取整80 mg,灌胃量定為0.2 ml。

1.4.2 模型建立及分組給藥 在SPF環(huán)境下觀察裸鼠1周,狀況良好,準備接種細胞;75%酒精消毒裸鼠注射部位皮膚,在裸鼠右側(cè)腋下注射含1.8×106個MDA-MB-231細胞的細胞懸液;刺入點距注射點約1 cm,形成一隆起皮丘,防止液體漏出。消毒皮膚,觀察成瘤情況。數(shù)日后,當成瘤80 mm3左右開始灌胃給藥,每只裸鼠每日1次,每組給藥4周。之后將裸鼠稱重,處死,取出移植瘤,稱瘤重;計算抑瘤率。根據(jù)不同給藥情況將試驗裸鼠分為6組,比較黃芪、莪術(shù)單用和聯(lián)用的抑制作用,并分析二者不同比例下抑制效應差異,為保證應用劑量的安全性,本研究以基礎劑量(80 mg)的2倍進行不同比例的對照分析,故研究分組設計為:模型組、黃芪組、莪術(shù)組、黃芪莪術(shù)2 ∶1組(黃芪 ∶莪術(shù)濃度為0.8 g/ml ∶0.4 g/ml)、黃芪莪術(shù)1 ∶1組(黃芪 ∶莪術(shù)濃度為0.4 g/ml ∶0.4 g/ml)、黃芪莪術(shù)1 ∶2組(黃芪 ∶莪術(shù)濃度為0.4 g/ml ∶0.8 g/ml)。模型組給予等量的0.9%生理鹽水。以黃芪莪術(shù)2 ∶1組為例,其中黃芪、莪術(shù)提取物濃度分別為0.8 g/ml和0.4 g/ml,其余組別以此類推。

1.4.3 HE染色檢測黃芪-莪術(shù)對腫瘤組織形態(tài)學影響 取出裸鼠身上的人乳腺腫瘤,用病理切片機切片。用蒸餾水沖洗切片;滴加蘇木素染色,染色5 min左右。蒸餾水洗至組織呈藍紫色;滴加1%鹽酸乙醇分化2 s,待組織變紅;蒸餾水洗至組織呈藍紫色;伊紅染色,染色6 s;用蒸餾水沖洗切片;用無水乙醇脫水;滴加中性樹膠,封片;鏡下觀察并拍照(×200)。

1.4.4 TUNEL檢測黃芪-莪術(shù)對人乳腺癌細胞凋亡的影響 對石蠟包埋的乳腺腫瘤病理組織切片進行PBS沖洗。在切片上滴上100 μl含2 000 U的蛋白酶K反應液,在37 ℃室溫放置20 min。滴加3% H2O2封閉,室溫放置20 min。配制TdT酶反應液,即配即用;樣本周圍用吸水紙吸干,每個樣本上滴加50 μl TdT酶反應液,放入濕盒中,37 ℃避光反應60 min;每個樣本上滴加50 μl反應終止液,室溫放置20 min;配制Streptavidin-HRP工作液,即配即用,避光保存;1×PBS漂洗切片3次;樣本周圍用吸水紙吸干,每個樣本滴加50 μl DAB顯色液,室溫放置5 min;蘇木素復染5 min,蒸餾水沖洗后浸入1%的鹽酸甲醇分化5 s,立即用蒸餾水沖洗,分別用70%,85%,95%的酒精脫水,用二甲苯浸2次,每次10 min,晾干后封片。在光學顯微鏡下觀察、拍照。每組隨機選擇并統(tǒng)計3個視野下凋亡細胞數(shù)量,進行計量分析。

1.4.5 RT-PCR檢測PI3K-Akt通路以及抑癌基因PTEN mRNA水平 將乳腺腫瘤組織剪碎,Trizol裂解液法提取RNA。配置反轉(zhuǎn)錄反應體系:5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μl,RNA酶抑制劑1 μl,下游通用引物1 μl,dNTPs 1 μl,逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μl,DEPC處理水8 μl,RNA模板4 μl,總體積20 μl。利用以上反應體系在反應條件為42℃ 40 min;85 ℃ 5 min逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA。將制備好的cDNA進行PCR擴增,擴增體系如下:SYBR Green Mix 10 μl,上游引物0.4 μl,下游引物0.4 μl,ddH2O 7.2 μl,cDNA模板2 μl,總體積20 μl。擴增條件:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s)40個循環(huán)。用ABI Prism 7500 SDS Software軟件進行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.4.6 Western blot檢測PI3K-Akt通路以及抑癌基因PTEN蛋白水平 將乳腺腫瘤組織剪碎后加入適量的RIPA裂解液,加入適量的PMSF,置于冰上裂解25 min;12 000 r/min,4 ℃,離心10 min。制備蛋白樣品,進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,孵育一抗4 ℃孵育過夜。一抗為:p-AKT(1 ∶5 000,anti-mouse,Proteintech),PTEN(1 ∶1 000,anti-rabbit,Proteintech),GAPDH(1 ∶5 000,anti-mouse,Proteintech)。孵育一抗后的膜用TBST洗滌,按1 ∶5 000稀釋二抗并在37 ℃孵育膜1 h。用TBST洗滌。二抗為:山羊抗小鼠(中杉金橋)和山羊抗兔(中杉金橋)。發(fā)光液(A液、B液)1 ∶1配置,用移液器吸取合適量的發(fā)光液至PVDF膜,在ECL發(fā)光儀上曝光并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。每個試驗重復3次,最終數(shù)值以平均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-莪術(shù)對裸鼠乳腺腫瘤生長的抑制作用

裸鼠成瘤結(jié)果顯示,黃芪和莪術(shù)介入后瘤塊體積顯著小于模型組(P<0.05,見表2),黃芪組腫瘤體積小于莪術(shù)組,兩種藥物以不同比例混合給藥后,瘤塊體積進一步縮小(P<0.05,見表2,圖1,2),其中黃芪莪術(shù)2 ∶1組的腫瘤體積最小,抑瘤率最大,為82.7%。6個組的腫瘤體積都呈上升趨勢,腫瘤體積增長最多,從植入乳腺癌MDA-MB-231細胞第7天到第49天,腫瘤體積從零增加到(3 140.33±149.9)mm3。6個組的腫瘤增長由快到慢的順序是:模型組>莪術(shù)組>黃芪組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)2 ∶1組。

表2 各組裸鼠成瘤抑制率

2.2 黃芪-莪術(shù)對乳腺腫瘤細胞凋亡的影響

HE染色可見各組細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體呈藍紫色,而細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分呈紅色。HE結(jié)果顯示,黃芪組和莪術(shù)組腫瘤細胞排列松散,收縮成圓形;兩種藥物混合組瘤塊細胞排列更疏松,壞死更嚴重。其中黃芪莪術(shù)2 ∶1組乳腺腫瘤細胞排列最松散(見圖3)。黃芪組的腫瘤細胞排列比莪術(shù)組松散。6組腫瘤細胞排列松散程度由高到低的順序是:黃芪莪術(shù)2 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>莪術(shù)組>黃芪組>模型組。

與模型組比較,*P<0.05;與莪術(shù)組相比,#P<0.05;與黃芪莪術(shù)1 ∶1組比較,&P<0.05圖2 黃芪-莪術(shù)對裸鼠乳腺癌成瘤體積的影響Figure 2 The effect of Huangqi and Ezhu on tumor volume in breast cancer nude mice

圖3 黃芪莪術(shù)組對乳腺癌腫瘤組織的形態(tài)學影響 (HE×200,bar=20 μm)Figure 3 The morphology of Huangqi and Ezhu in breast tumor tissue (HE×200,bar=20 μm)

TUNEL檢測試劑盒能對處在凋亡期具有斷裂DNA的細胞進行染色。從TUNEL結(jié)果來看,黃芪組和莪術(shù)組腫瘤細胞凋亡個數(shù)顯著高于模型組;兩種藥物混合給藥組腫瘤細胞凋亡個數(shù)進一步增加,其中黃芪莪術(shù)2 ∶1組的乳腺腫瘤細胞凋亡個數(shù)最多,而莪術(shù)組腫瘤細胞凋亡個數(shù)略小于黃芪組(見圖4和表3)。6組細胞凋亡個數(shù)由多到少的順序是:黃芪莪術(shù)2 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>黃芪組>莪術(shù)組。

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與莪術(shù)組相比,#P<0.05;與黃芪莪術(shù)1 ∶1組比較,&P<0.05圖4 黃芪莪術(shù)對乳腺腫瘤細胞凋亡的影響 (TUNEL,×100)Figure 4 Effect of Huangqi and Ezhu on breast tumor cell apoptosis (TUNEL,×100)

表3 各組乳腺癌腫瘤細胞凋亡情況

2.3 黃芪-莪術(shù)對PI3K-Akt通路和PTEN基因表達水平的影響

RT-PCR實驗結(jié)果顯示,與模型組相比,黃芪組、莪術(shù)組PI3K、Akt1、Akt2表達量顯著降低,PTEN表達量顯著升高;黃芪莪術(shù)混合組的PI3K、Akt1、Akt2表達量降低更為顯著,PTEN表達量升高也更為顯著。其中,黃芪莪術(shù)2 ∶1組PI3K、Akt1和Akt2基因表達水平相對于模型組降低的最多,PTEN基因表達水平相對于模型組升高的最多。6組乳腺腫瘤基因PI3K、Akt1、Akt2的表達水平由高到低的順序是:模型組>莪術(shù)組>黃芪組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)2 ∶1組(見圖5,表4)。而PTEN基因的表達水平由高到低的順序是:黃芪莪術(shù)2 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>黃芪組>莪術(shù)組>模型組(見圖5,表4)。

Western blot結(jié)果顯示,黃芪莪術(shù)2 ∶1組的p-Akt基因的表達水平相對于模型組降低的最多,PTEN基因的表達水平相對于模型組升高的最多(見圖6)。6組p-Akt的表達水平由高到低的順序是:模型組>莪術(shù)組>黃芪組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)2 ∶1組。6組PTEN的表達水平由高到低的順序是:黃芪莪術(shù)2 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶1組>黃芪莪術(shù)1 ∶2組>黃芪組>莪術(shù)組>模型組(見圖6,表5)。

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 RT-PCR檢測乳腺癌腫瘤細胞中PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因的表達水平Figure 5 The expression levels of PI3K,Akt1,Akt2 and PTEN in breast cancer cell by RT-PCR assay

表4 RT-PCR檢測各組乳腺腫瘤細胞中PI3K、Akt1、Akt2和PTEN基因的mRNA表達水平

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 Western Blot檢測乳腺癌腫瘤細胞中p-Akt和PTEN的蛋白表達水平Figure 6 Protein levels of p-Akt and PTEN in breast cancer cells by Western Blot

表5 Western Blot檢測乳腺腫瘤細胞中p-Akt和PTEN的蛋白表達水平

3 討論

隨著科技和社會的發(fā)展,人們生活和工作壓力的增加,乳腺癌的發(fā)病率逐漸升高,現(xiàn)在已成為僅次于宮頸癌的女性第二大癌癥。乳腺癌是乳腺上皮細胞在多種致癌因子的作用下,發(fā)生增殖失控的現(xiàn)象[10]。早期乳腺癌常表現(xiàn)為乳房腫塊、乳頭溢液、腋窩淋巴結(jié)腫大等癥狀。晚期乳腺癌可發(fā)生癌細胞遠處轉(zhuǎn)移,出現(xiàn)多器官病變,威脅患者生命[11]。中醫(yī)對乳房腫塊的診斷是局部氣血淤積,通路不暢[12]。早期乳腺癌的初步治療是心情、生活方式調(diào)整治療,配合化學藥物治療、靶向藥物治療、內(nèi)分泌藥物治療;如果得不到緩解或就診時經(jīng)專家會診建議手術(shù)治療,則應手術(shù)治療,術(shù)后輔助藥物治療或放射治療[13,14]。

黃芪、莪術(shù)是治療乳腺癌的中藥復方癌復康的關(guān)鍵配伍藥物,具有益氣補血、消腫化瘀、抗癌解毒的功效,能顯著改善乳腺癌患者術(shù)后化療的生存質(zhì)量[15]。宋魏等[16]對黃芪解毒方對胃癌SGC-7901細胞的作用進行了研究,得出黃芪解毒方能有效抑制胃癌SGC-7901細胞增殖,促進其凋亡,并能下調(diào)C-myc基因的表達。臧文華等[17]對黃芪、莪術(shù)聯(lián)合順鉑治療人肝癌裸鼠模型進行了研究,得到黃芪、莪術(shù)配伍能下調(diào)TF、HGF、FVII基因的表達,對腫瘤新生血管生成有抑制作用。姚遠等[18]對黃芪、莪術(shù)不同提取物治療肝癌進行研究,得出黃芪-莪術(shù)95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、傳統(tǒng)水煎4種提取物均能抑制小鼠H22荷瘤生長。

我們前期研究發(fā)現(xiàn),黃芪注射液及其有效成分可能通過下調(diào)Akt磷酸化從而抑制乳腺癌細胞增殖[19]。本研究結(jié)果顯示,黃芪、莪術(shù)對乳腺癌細胞裸鼠成瘤都有顯著的抑制作用。而黃芪對乳腺腫瘤的消除能力大于莪術(shù),并且對促癌PI3K/Akt信號通路的抑制作用顯著優(yōu)于莪術(shù)。但是黃芪-莪術(shù)聯(lián)合給藥對乳腺癌的抑制能力增強,明顯大于黃芪、莪術(shù)單獨給藥。且在調(diào)整黃芪莪術(shù)聯(lián)合濃度為2 ∶1時,腫瘤體積最小,促進乳腺腫瘤細胞凋亡,PI3K、Akt1和Akt2基因表達水平相對于模型組降低幅度最大,抑癌基因PTEN基因表達水平相對于模型組升高的最多。這說明黃芪 ∶莪術(shù)濃度為2 ∶1時,對乳腺癌的抑制最強,在配伍時應該按照此比例,黃芪是主要治療藥物。黃芪莪術(shù)2 ∶1組乳腺腫瘤細胞排列最松散。說明黃芪的作用很可能是切斷腫瘤細胞之間的聯(lián)系,使細胞膜之間的黏附性降低。而莪術(shù)的作用需要后續(xù)深入研究。

目前有多項研究表明磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路的異?；罨艽龠M乳腺癌細胞的增殖和遷移,抑制癌細胞的凋亡[19]。激活PI3K能促使質(zhì)膜上產(chǎn)生的第二信使PIP3與含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白Akt和PDK1結(jié)合,促進PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308,使得Akt活化。活化的Akt能通過磷酸化作用激活或抑制其下游的靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等,從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等,引發(fā)癌癥[20,21]。PTEN是一個PIP3-磷酸酶,它的功能與PI3K相反。PTEN能通過去磷酸化將PIP3轉(zhuǎn)化為PI-4,5-P2,從而減少Akt的活化,阻止所有由Akt調(diào)控的下游信號的傳導,抑制PI3K-Akt信號通路[22]。

我們的研究將黃芪、莪術(shù)對乳腺癌的治療作用與PI3K/Akt信號通路聯(lián)系起來,黃芪、莪術(shù)的提取物對PI3K/Akt通路有顯著抑制作用,并能促進PTEN基因的表達,從而抑制關(guān)鍵因子PIP3,阻斷PI3K/Akt通路向下游傳導。但對于黃芪、莪術(shù)聯(lián)合給藥是否抑制了PI3K/Akt通路中的其他因子及其具體機制,以及對乳腺癌的其他相關(guān)信號通路的抑制作用及其機制仍有待研究。黃芪、莪術(shù)聯(lián)合給藥對乳腺癌的抑制作用最強的絕對比例仍有待繼續(xù)探究,但我們的研究中2 ∶1的比例較優(yōu),應在未來研究中對比例進行細化。

黃芪、莪術(shù)因具有散瘀疏氣的作用而對腫瘤有一定的療效。在黃芪:莪術(shù)濃度為2:1時,對乳腺癌的治療效果最好,并且其對乳腺癌的治療作用很可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路,并激活PTEN基因而達到的。在乳腺癌的輔助治療中,可以用中藥黃芪莪術(shù)2 ∶1進行配伍治療。