益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞HPAEpiC間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用

陳麗娟,肖 泓*,蘭成仲,楊彥斌,祁向榮,歐陽麗,張曉麗,王鳳英,金其花,孫 毅

(1云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,云南省中醫(yī)醫(yī)院肺病科,昆明 650000;2云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,云南省中醫(yī)醫(yī)院泌尿科;*通訊作者,E-mail:xiaohong0575@163.com)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是一種慢性疾病,其特征是細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度積聚,導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)瘢痕和損傷,從而限制氣體交換。最終,大多數(shù)PF患者死于不可逆轉(zhuǎn)的肺功能惡化[1]。目前,PF在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐漸增加,中位生存期約為3-5年[2]。因此,PF的治療仍然是一個亟待解決的主要問題。研究顯示肺泡上皮細胞在炎癥、氧化應(yīng)激以及某些細胞因子特別是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的刺激下逐漸失去緊密連接以及上皮表型E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等間充質(zhì)表型,并沿著新分泌的Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)遷移,這個從上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變,由此產(chǎn)生成纖維細胞和肌成纖維細胞,分泌更多細胞外基質(zhì)的過程即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),研究已證實EMT是PF的重要病理過程[3,4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是導(dǎo)致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂的一種亞細胞器病理狀態(tài),其下游的效應(yīng)器與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)發(fā)生解離,最終引起EMT和上皮細胞凋亡,在PF發(fā)病起始過程中起著至關(guān)重要的作用[5]。因此,針對EMT在PF形成過程中的重要性,是否可以影響EMT的過程,且可能通過誘導(dǎo)ERS的發(fā)生進而介導(dǎo)EMT的形成,可能會為PF的治療提供一種有前途的策略。

益肺湯是在反復(fù)辨治肺痿患者取效的基礎(chǔ)上,傳承與創(chuàng)新后總結(jié)而成的,由炙桑白皮、白術(shù)、枳實、桃仁、丹參、桔梗、甘草組成,具有臟腑兼顧,宣降結(jié)合,氣血同調(diào),上下同治,攻補兼施之特點[6]。線粒體輔酶Q(mitoquinone,MitoQ)是新型線粒體靶向抗氧化劑,可作為一個重要的親脂抗氧化劑,通過激活解偶聯(lián)蛋白,減少自由基的生成,阻止自由基對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA的氧化修飾[7]。PF過程中線粒體在氧化應(yīng)激過程中壓力過大后就會激活TGF-β1通路,同時NADPH氧化酶中NOX4過表達,進一步促進PF的過程[8],這可能是PF過程中最關(guān)鍵的過程之一,而通過MitoQ可能有效地逆轉(zhuǎn)這一過程。然而,益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞內(nèi)EMT的直接影響尚不清楚。本研究旨在探討益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞內(nèi)EMT的直接影響,并探討其可能的分子機制,為PF的治療及進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

HPAEpiC細胞株,購自上海橋杜生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

益肺湯全部藥材購于云南省中醫(yī)醫(yī)院藥房;MitoQ(澳大利亞Antipodean Pharmaceuticals公司);TGF-β1人重組蛋白(批號:081735,美國Peprotech公司);DMEM培養(yǎng)基(批號:060711,美國Gibco公司);CCK-8試劑盒(Beyotime Technology,江蘇);活性氧(ROS)測定試劑盒(批號:238240413,南京建成生物科技有限公司);RNA Trizol Reagent(批號:vs18061730,合肥博美生物科技有限公司生產(chǎn));PrimeScript RT reagent Kit(貨號:RR047A,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(貨號:RR820A,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));Western細胞裂解液(貨號:P0013,Beyotime);BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0009,Beyotime);ECL發(fā)光試劑盒(貨號:KF001,Affinity);Immobilon-PSQ PVDF膜(貨號:ISEQ00010,Sigmaaldrich);GRP78一抗(貨號:ab21685,英國abcam-艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司);實時熒光定量(RT-PCR)儀(型號PIKORed 96,美國ThermoFisher儀器有限公司生產(chǎn));全功能酶標(biāo)儀MK3(美國ThermoFisher儀器有限公司)。

1.3 益肺湯水煎液藥物制備

益肺湯由炙桑白皮12 g、白術(shù)10 g、枳實12 g、桃仁12 g、丹參18 g、桔梗12 g、甘草6 g組成,取中藥飲片置于電動煎藥壺內(nèi),加入800 ml的礦泉水浸泡1 h,大火煮沸30 min,紗布過濾。藥渣再加600 ml礦泉水繼續(xù)煎煮,煮沸20 min,過濾。合并兩次濾液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮,濃縮至約生藥含量3 g/ml的溶液,分裝,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 益肺湯含藥血清制備

SD大鼠30只,6-8周,體質(zhì)量約(200±20)g,購自四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗動物中心,許可證號:SYXK(川)2018-119。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機將大鼠分為空白對照組和益肺湯組,每組15只?？瞻讓φ战M大鼠灌胃生理鹽水,益肺湯組大鼠每日灌服益肺湯水煎液(10 ml/kg,生藥含量3 g/ml),每日1次。連續(xù)給藥4周。末次給藥1 h腹主動脈采血,離心,取上清,56 ℃水浴30 min滅活,0.22 μm微孔濾膜過濾,-20 ℃保存。按合適濃度加入細胞培養(yǎng)基。其中,MitoQ使用劑量參考陳勝利等[9]的報道,益肺湯水煎液使用劑量參考張偉等[10]和張文斌等[6]的報道。

1.5 細胞培養(yǎng)及實驗分組

前期研究[11]報道濃度為10 ng/ml的TGF-β1能顯著刺激肺上皮細胞增殖,5%益肺湯含藥血清對細胞增殖有明顯抑制作用,以此為依據(jù)建立細胞模型并給藥?？瞻讓φ战M:正常培養(yǎng)HPAEpiC細胞;模型組:10 ng/ml TGF-β1誘導(dǎo);模型+MitoQ組:10 ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)+0.1 μmol/L MitoQ;模型+益肺湯組:10 ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)+益肺湯含藥血清(5%含藥血清);模型+MitoQ+益肺湯組:10 ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)+0.1 μmol/L MitoQ+益肺湯含藥血清(5%含藥血清)。選對數(shù)生長期的細胞(HPAEpiC細胞),胰蛋白酶消化,制成細胞懸液,離心,棄上清,加入培養(yǎng)基(10% FBS)重懸細胞中板,培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)24 h后,加入無血清培養(yǎng)基饑餓12 h,加入10 ng/ml TGF-β1及含藥血清,培養(yǎng)48 h后,收集細胞進行指標(biāo)檢測。

1.6 CCK-8檢測細胞存活率

收集不同培養(yǎng)組細胞,使用細胞CCK-8試劑盒說明評估細胞增殖。將不同處理組細胞接種到96孔板(1×104細胞/孔)中,并設(shè)置空白組(無細胞),在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入10 μl CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)3 h,肉眼觀察細胞孔中顏色由黃色變成深橙色,通過酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光值。細胞存活率(%)=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.7 qRT-PCR檢測細胞E-cadherin、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達

使用TRIzol試劑盒按照制造商說明從細胞中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于qRT-PCR分析。使用SYBR PreMix Taq在ABI PRISM 7900熱循環(huán)器上進行PCR擴增。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參,qRT-PCR反應(yīng)條件為:95 ℃初始變性10 min,隨后95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,45個循環(huán),記錄Ct值,采用2-ΔΔCt分析基因相對表達水平。

表1 qRT-PCR中用于特異性mRNA擴增的引物序列

1.8 流式細胞術(shù)測定細胞內(nèi)ROS水平

用二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。收集不同處理組細胞接于EP管中,1 800 r/min離心5 min,棄掉上清液后,將細胞與1 ml的DCFH-DA溶液(10 μmol/L)在37 ℃避光孵育30 min。胰蛋白酶分離細胞,在4 ℃下1 800 r/min離心5 min。然后用PBS洗滌2次,放在冰上黑暗中保存,采用流式細胞儀488 nm激發(fā)光和525 nm發(fā)射光下檢測ROS含量。以熒光強度或ROS含量高的細胞占總細胞的百分比表示ROS水平,每組實驗重復(fù)3次。

1.9 Western blot檢測GRP78蛋白表達水平

收集細胞用PBS洗滌3次,然后在RIPA緩沖液中用蛋白酶和磷酸酶抑制劑在冰上溶解10 min,蛋白質(zhì)濃度用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法測定,等量的蛋白質(zhì)樣品用12% SDS-PAGE分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟化膜上,然后用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后用一抗GRP78(稀釋比1 ∶1 000)和β-catin(稀釋比1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜,隨后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二級抗體(1 ∶3 000)室溫孵育1 h。ECL暗室顯色,顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin為內(nèi)參,結(jié)果以目的蛋白相對表達量表示。目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞存活率的影響

與空白對照組比較,藥物作用48 h時,模型組TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞存活率明顯增加(P<0.01);與模型組比較,模型+MitoQ+益肺湯含藥血清組培養(yǎng)48 h時對TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞存活率具有明顯抑制作用(P<0.05);藥物作用24 h時,各組間細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果說明MitoQ+益肺湯含藥血清對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞存活具有抑制作用(見表2)。

2.2 益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞E-cadherin、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達的影響

與空白對照組比較,模型組Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達明顯增加,E-cadherin mRNA表達明顯降低(P<0.01);與模型組比較,模型+益肺湯含藥血清組和模型+MitoQ+益肺湯含藥血清組Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達明顯降低,E-cadherin mRNA表達明顯升高(P<0.05,見表3),表明MitoQ+益肺湯含藥血清能有效地調(diào)控EMT過程,抑制細胞引起EMT。

表2 益肺湯聯(lián)合MitoQ對細胞于24 h和48 h細胞存活率的影響

表3 益肺湯聯(lián)合MitoQ對細胞中E-cadherin、ColⅠ、α-SMA mRNA表達的影響

2.3 益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞中ROS水平的影響

與空白對照組比較,模型組ROS熒光強度明顯增加(P<0.01);與模型組比較,模型+MitoQ組、模型+益肺湯含藥血清組、模型+MitoQ+益肺湯含藥血清組ROS熒光強度均明顯降低(P<0.01,見圖1),表明MitoQ+益肺湯含藥血清的保護作用可能是通過降低細胞內(nèi)ROS水平實現(xiàn)的。

2.4 益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞中GRP78蛋白表達的影響

與空白對照組比較,模型組GRP78蛋白表達明顯增加(P<0.05);與模型組比較,模型+MitoQ組、模型+益肺湯含藥血清組、模型+MitoQ+益肺湯含藥血清組GRP78蛋白表達均明顯降低(P<0.05,見圖2),表明MitoQ+益肺湯含藥血清可抑制GRP78蛋白表達。

與空白對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01圖1 益肺湯聯(lián)合MitoQ對細胞中ROS水平的影響Figure 1 Effect of Yifei decoction combined with MitoQ on the level of ROS in cells

與空白對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05圖2 益肺湯聯(lián)合MitoQ對細胞中GRP78蛋白表達的影響Figure 2 Effect of Yifei decoction combined with MitoQ on GRP78 protein expression in cells

3 討論

PF是一種嚴(yán)重的炎癥性間質(zhì)性肺疾病,其具有較高的發(fā)病率和死亡率,預(yù)后較差[12]。目前,除了肺移植,PF的進展和結(jié)果不能被其他特殊治療有效地阻止[13]。探索治療PF的新型藥物仍是亟待解決的問題。EMT一直被認(rèn)為是纖維化疾病的機制之一,在PF的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,由于TGF-β1是PF的主要誘導(dǎo)者,研究TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞HPAEpiC內(nèi)細胞轉(zhuǎn)化對理解PF的發(fā)病機制具有重要意義。本研究證明益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞HPAEpiC間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用,可能為肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)疾病提供一種新的治療方法。

PF的特點是成纖維細胞/肌成纖維細胞和細胞外基質(zhì)在肺內(nèi)過度堆積,破壞了其結(jié)構(gòu)和功能[14]。雖然肺纖維化的發(fā)病機制尚不清楚,但肺上皮細胞,特別是Ⅱ型肺泡上皮細胞已被確定為該病的關(guān)鍵參與者之一。原代人Ⅱ型肺泡上皮細胞經(jīng)歷TGF-β1依賴的上皮細胞轉(zhuǎn)化,從而獲得產(chǎn)生膠原的能力,促進PF進展[15]。研究表明,益肺湯可以有效抑制PDGF表達,同時PDGF的表達可以影響下游的細胞因子網(wǎng)絡(luò)從而干預(yù)TGF-β1通路影響肺纖維化過程[16]。此外,MitoQ通過抑制線粒體的活性氧的水平,減少線粒體的氧化損傷從而阻斷因氧化應(yīng)激而激活的TGF-β1通路和NOX4表達[17]。然而,益肺湯聯(lián)合MitoQ對TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的直接作用尚不確定,在本研究,我們發(fā)現(xiàn)益肺湯聯(lián)合MitoQ明顯抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞增殖及EMT過程。E-cadherin的丟失被認(rèn)為是EMT發(fā)病過程中的一個關(guān)鍵因子,可以與β-catenin相互作用,介導(dǎo)細胞黏附[18]。相應(yīng)地,Col Ⅰ、α-SMA在TGF-β1刺激后均升高[19]。益肺湯聯(lián)合MitoQ可抑制Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達,上調(diào)E-cadherin mRNA的表達,表明益肺湯聯(lián)合MitoQ對EMT樣細胞行為有抑制作用。以上結(jié)果提示益肺湯聯(lián)合MitoQ的抗纖維化作用至少部分是由于其對TGF-β1介導(dǎo)的間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干擾,因此抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT參與了益肺湯聯(lián)合MitoQ對PF的保護作用。

此外,ROS是氧化應(yīng)激的主要參與因子,并通過改變包括血管內(nèi)皮細胞在內(nèi)的上皮細胞的基因表達、細胞骨架重排和細胞遷移而在TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細胞轉(zhuǎn)化中起重要作用[20]。當(dāng)發(fā)生氧化劑/抗氧化劑失衡時,過量的ROS合成,導(dǎo)致包括EMT在內(nèi)的一系列病理事件[21]。研究報道,穿心蓮內(nèi)酯可以顯著抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的A549細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[22]。然而,目前尚不清楚益肺湯聯(lián)合MitoQ是否介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)化中ROS的產(chǎn)生。本研究表明,益肺湯聯(lián)合MitoQ明顯減少了TGF-β1誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生。提示益肺湯聯(lián)合MitoQ可能通過抑制ROS途徑抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。GRP78是一種廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶,是主要的UPR調(diào)節(jié)因子,促進蛋白質(zhì)折疊,防止蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集,穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象,促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊,是識別、保留和最終消除靶點的質(zhì)量控制系統(tǒng)[23]。研究報道博萊霉素?fù)p傷后小鼠AT2細胞出現(xiàn)GRP78免疫反應(yīng)[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可通過Smad2和Src途徑誘導(dǎo)肺泡上皮細胞發(fā)生EMT[25]。本研究顯示TGF-β1誘導(dǎo)HPAEpiC細胞GRP78蛋白表達明顯增加,益肺湯聯(lián)合MitoQ明顯減少了TGF-β1誘導(dǎo)的GRP78蛋白表達。提示益肺湯聯(lián)合MitoQ可抑制GRP78蛋白表達改善TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化。

綜上所述,益肺湯聯(lián)合MitoQ通過抑制TGF-β1激活的GRP78來減弱TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮HPAEpiC細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。益肺湯聯(lián)合MitoQ還可減少TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化過程中ROS的產(chǎn)生。本研究認(rèn)為益肺湯聯(lián)合MitoQ是一種有前途的PF治療策略。