黃 蕓,秦 榕,張志波,黃維康,王麗昆,王 輝

(昆明市延安醫(yī)院消化內(nèi)科,昆明 650051;*通訊作者,E-mail:weihool@163.com)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種結(jié)腸受累的慢性炎癥性疾病,發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1,2]。其主要臨床癥狀為腹痛、腹瀉、黏液膿血便。UC的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,病程長(zhǎng)易復(fù)發(fā),活動(dòng)期和緩解期常交替出現(xiàn),難以治愈。研究表明氧化應(yīng)激和免疫紊亂參與了UC的發(fā)生發(fā)展,這些發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有可能成為新藥研發(fā)靶點(diǎn)[3,4]。馬齒莧是馬齒莧科馬齒莧屬植物,具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、修復(fù)潰瘍等多種藥理作用[5-7],已被廣泛用作食用植物和民間藥物[8]。國(guó)內(nèi)外研究表明馬齒莧在UC臨床治療中潛力巨大。馬齒莧含有多種生物活性成分,其中酚類生物堿oleracein E(OE)是一種從馬齒莧中首次分離得到的四氫異喹啉,具有較強(qiáng)抗氧化活性[9]。然而OE對(duì)UC的影響還不清楚。因此,本研究擬通過三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠UC模型探討OE能否通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和減輕炎癥反應(yīng)來發(fā)揮治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)資料與方法

1.1 藥品與試劑

Oleracein E(貨號(hào):561010)購自美國(guó)MedKoo公司。5%三硝基苯磺酸(TNBS)(貨號(hào):P2297)購于美國(guó)Sigma公司。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(貨號(hào):A044-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號(hào):A001-3-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號(hào):A003-1-2)、一氧化氮(NO)試劑盒(貨號(hào):A012-1-2)和一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(貨號(hào):A014-2-2)均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002。環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于試驗(yàn)。大鼠的飼養(yǎng)、繁殖和使用均符合中國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。所有實(shí)驗(yàn)均按照倫理準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.3 主要儀器

Thermo Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Labsystem公司);T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);IKA-WERKE T8.01手握式組織勻漿器(德國(guó)IKA-WERKE公司);Eppendorf高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);電子恒溫水浴鍋(上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模及分組給藥 將SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=12):正常組、TNBS組、OE低劑量組、OE中劑量組和OE高劑量組。大鼠吸入乙醚麻醉后將硅膠管(外徑2 mm)經(jīng)肛門插入結(jié)腸內(nèi),頭端距肛門約8 cm,按100 mg/kg劑量緩慢注入預(yù)混的TNBS 50%乙醇溶液1 ml,正常對(duì)照組則注入生理鹽水1 ml。緩慢拔出硅膠管,夾閉肛門并將大鼠尾部提起倒置60 s,防止灌入液體流出。將OE溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液中配置成三種不同濃度備用(1.8,3.6,7.2 mg/ml)。OE低劑量組、OE中劑量組、OE高劑量組在造模后第3天開始分別按9,18,36 mg/kg灌腸給藥,每天1次,連續(xù)10 d。正常組和TNBS組灌腸給予等體積0.5% CMC-Na溶液。

1.4.2 結(jié)腸炎癥評(píng)估和標(biāo)本制備 各組大鼠每天稱重。第14天頸椎脫臼處死,迅速開腹切除全結(jié)腸,沿腸系膜緣縱向切開,冷生理鹽水沖洗去除殘留糞便。立即將結(jié)腸平鋪于冰屑上,根據(jù)大體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見表1),對(duì)結(jié)腸黏膜損傷進(jìn)行評(píng)分。取一小塊(0.5 cm×0.5 cm)病變明顯處結(jié)腸組織,用4%多聚甲醛固定24 h。其余病變明顯處結(jié)腸組織液氮速凍后移至-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。

表1 UC大鼠結(jié)腸黏膜大體損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 組織病理學(xué)評(píng)估 多聚甲醛固定標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,封片后鏡檢,圖像采集分析。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生根據(jù)組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見表2)使用雙盲法進(jìn)行評(píng)分。

表2 UC大鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.4 結(jié)腸組織中MPO、SOD、NOS、MDA和NO的測(cè)定 將儲(chǔ)存于-80 ℃的結(jié)腸組織制成10%的組織勻漿液。其中一份勻漿液用于測(cè)定MPO活性。剩余勻漿液在4 ℃下3 000g離心10 min后將上清液移入多個(gè)試管中,根據(jù)試劑盒說明書步驟測(cè)定SOD、MDA、NO和NOS的活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化及結(jié)腸損傷評(píng)分

實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量變化見圖1。正常組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)良好,大便正常,活動(dòng)靈活。TNBS組大鼠精神狀態(tài)差,大便稀溏,飲食減少,體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)。OE低劑量組、OE中劑量組和OE高劑量組大鼠解黏液稀便情況得到不同程度改善,體質(zhì)量有所回升。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),TNBS組大鼠體質(zhì)量與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。治療后OE低劑量組、OE中劑量組和OE高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著高于TNBS組(P<0.01,見圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量變化Figure 1 The weight of rats in each group during the experiment

TNBS組、OE低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸大體損傷評(píng)分與正常組相比明顯增加(P<0.01)。OE灌腸治療后,OE中、高劑量組大體損傷評(píng)分降低,與TNBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而OE低劑量組與TNBS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

正常組結(jié)腸壁各層結(jié)構(gòu)完整,黏膜上皮腺體規(guī)則,杯狀細(xì)胞豐富;TNBS組結(jié)腸組織表現(xiàn)為大片狀黏膜層缺失、脫落,黏膜下層明顯水腫,彌漫性炎性細(xì)胞浸潤(rùn);OE低、中、高劑量組結(jié)腸組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜層缺損較TNBS組減少,腸黏膜水腫及潰瘍減輕(見圖4)。

與正常組比較,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖2 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠體質(zhì)量比較Figure 2 Comparison of body weight of rats at the end of the experiment between groups

與正常組比較,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖3 各組大鼠結(jié)腸大體損傷評(píng)分比較Figure 3 Comparison of colonic gross injury scores between groups

A.正常組;B.TNBS組;C.OE低劑量組;D.OE中劑量組;E.OE高劑量組;紅色箭頭表示黏膜層脫落缺失,黑色箭頭表示中性粒細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)圖4 OE治療后各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化 (IHC,×400)Figure 4 Histopathological changes of colonic mucosa in rats after OE treatment (IHC,×400)

與正常組相比,TNBS組、OE低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸的組織學(xué)損傷評(píng)分均明顯增加(P<0.01)。OE中、高劑量組在OE治療后組織學(xué)損傷評(píng)分顯著低于TNBS組(P<0.01,見圖5)。

2.2 OE對(duì)大鼠結(jié)腸組織MPO、MDA、SOD、NO和NOS的影響

TNBS組、OE低、中、高劑量組MPO活性較正常組顯著升高(P<0.01)。OE高劑量組和OE中劑量組MPO活性顯著低于TNBS組(P<0.01),OE低劑量組與TNBS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。

與正常組比較,TNBS組SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.01)。與TNBS組比較,OE高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.01),OE高劑量組和OE中劑量組MDA水平顯著降低(P<0.01),而OE低劑量組與TNBS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。

與正常組比較,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖5 各組大鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分比較Figure 5 Comparison of histological injury scores of colon between groups

與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與TNBS組比較,##P<0.01圖6 OE對(duì)各組大鼠結(jié)腸組織MPO、MDA、SOD、NO和NOS的影響Figure 6 Effects of OE on MPO, MDA, SOD, NO and NOS in colon tissue of rats in each group

TNBS組、OE低、中、高劑量組NOS活性和NO水平較正常組顯著升高(P<0.01)。與TNBS組比較,OE低、中、高劑量組NOS活性和NO水平均呈下降趨勢(shì)。與TNBS組比較,OE三個(gè)劑量組NOS活性均有所下降,但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而OE高劑量組NOS活性與正常組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。此外,OE高劑量組NO水平較TNBS組顯著降低(P<0.01),而OE低劑量組和OE中劑量組與TNBS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。

3 討論

UC作為一種多因素參與、機(jī)制不明的消化系統(tǒng)疑難疾病,臨床治療一直面臨巨大挑戰(zhàn)。近年來,中醫(yī)藥因其副作用小、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于UC治療,收效良好。UC患者中約63%表現(xiàn)為末段結(jié)腸炎,包括直腸炎、左半結(jié)腸炎。在眾多方案中,包括灌腸在內(nèi)的局部治療對(duì)輕中度末段結(jié)腸炎患者有良好的療效和安全性[10]。我們的前期研究顯示馬齒莧灌腸能夠明顯改善TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎[11]。另一項(xiàng)研究表明,口服馬齒莧乙醇提取物對(duì)硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有預(yù)防和治療作用[12]。由此可見馬齒莧外用內(nèi)服對(duì)UC均有一定治療作用。

MPO是一種主要存在于中性粒細(xì)胞中的酶,其活性測(cè)定已被用作胃腸道中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的評(píng)估指標(biāo)。研究表明,TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織中MPO活性顯著升高,提示存在中性粒細(xì)胞募集和急性炎癥反應(yīng)。OE灌腸治療可呈劑量依賴性減少結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),提示與其抗炎作用有關(guān)。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是自由基釋放的觸發(fā)因素。生理?xiàng)l件下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)受大量抗氧化系統(tǒng)調(diào)控。炎癥性腸病中腸道ROS顯著增加。ROS和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇,促進(jìn)了UC的發(fā)生發(fā)展。機(jī)體質(zhì)量要的抗氧化酶包括SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。MDA是一種典型的脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物。SOD是機(jī)體抵御ROS的第一道防線,能催化O2生成H2O2。H2O2在CAT、GSH-Px和過氧化物氧還蛋白(Prx)的作用下轉(zhuǎn)化為H2O和O2。已有研究證實(shí)OE具有抗凋亡、減少氧化應(yīng)激和下調(diào)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)等作用[13,14]。本研究表明OE提高了結(jié)腸組織的抗氧化能力,提示OE能夠抑制脂質(zhì)過氧化,從而發(fā)揮結(jié)腸炎癥的治療作用。

NO具有多種生物學(xué)功能,包括維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)、宿主防御和神經(jīng)傳遞等。過量NO卻有促炎和細(xì)胞毒性作用。NO還可誘導(dǎo)IL-8、TNF-α和IL-1β釋放。此外,炎癥腸道的超氧化物明顯增加。NO與超氧化物反應(yīng)可能導(dǎo)致體內(nèi)生成更強(qiáng)的氧化劑過氧亞硝酸鹽。研究已證實(shí)過氧亞硝酸鹽與炎癥性腸病的發(fā)病有關(guān)。本研究提示治療組NO生成減少,NOS活性下降,推斷OE可通過抑制過氧亞硝酸鹽形成和炎性細(xì)胞因子釋放,直接或間接減輕UC的炎癥反應(yīng)。

綜上所述,OE灌腸治療能夠有效改善TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎。其作用機(jī)制可能與修復(fù)結(jié)腸黏膜損傷、增強(qiáng)抗氧化能力、減輕腸道炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究為篩選馬齒莧有效成分、探討作用機(jī)制及其臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。