LRP5蛋白對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的影響及機(jī)制

閆 坤,楚光華,王欣茹,胡春艷,劉 晨,陳 巍,李 佩

(1西北婦女兒童醫(yī)院婦二科,西安 710061;2西安市中心醫(yī)院普外科;3陜西省第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:1913115956@qq.com)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見病,這種疾病已成為不孕不育和盆腔疼痛的最重要原因之一,影響到6%-10%的育齡婦女[1,2]。雖然子宮內(nèi)膜異位癥被認(rèn)為是一種良性疾病,但它在臨床上仍表現(xiàn)出組織粘連、侵襲、血管生成等惡性生物學(xué)行為[3]。關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的病因,目前學(xué)術(shù)界已經(jīng)存在諸多種見解,包括月經(jīng)逆行、體腔上皮化生、遺傳和環(huán)境等因素。然而,子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

研究報(bào)告稱[4],子宮內(nèi)膜異位組織中許多基因的異常表達(dá)可能會(huì)增加子宮內(nèi)膜異位癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此,檢測基因表達(dá)水平的改變,將為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)在損傷的大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜和外膜區(qū)域過表達(dá),它可抑制膠原的形成并誘導(dǎo)細(xì)胞遷移[5]。同時(shí),LRP5也在不同類型的惡性腫瘤和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中過表達(dá)[6]。最近的研究[7]表明,LRP5通過促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和通過眾多信號(hào)通路誘導(dǎo)血管生成來觸發(fā)癌癥轉(zhuǎn)移。

此外,LRP5通過靶向Wnt/β-catenin通路增加肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和卵巢上皮癌的細(xì)胞侵襲力[8,9],該通路被認(rèn)為是與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖能力相關(guān)的關(guān)鍵途徑。然而,LRP5是否參與子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展及其潛在機(jī)制仍很不清楚。本研究旨在檢測LRP5在子宮內(nèi)膜細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平,進(jìn)一步揭示子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清、SYBR PreMix ExTaq試劑盒和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑購于Thermo fish公司(美國);膠原酶Ⅰ、青霉素、GAPDH、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、RNA-IMAX購于Sigma公司(德國);70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)購于BD Falcon公司(美國);鏈霉素購于Supelco公司(美國);細(xì)胞培養(yǎng)板購于NEST公司(中國);恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購于AODEMA澳德瑪公司(中國);TRIzol RNA分離試劑購于Invitrogen公司(美國);PrimeScript RT試劑盒購于Takara公司(日本);酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Transwell小室購于Corning公司(美國);聚碳酸酯過濾器購于默克Millipore公司(美國)。LRP5小干擾RNA(siRNA;si-LRP5)和陰性對(duì)照siRNA(si-NC)由生工生物工程(上海)股份有限公司(中國上海)合成。LRP5抗體、β-catenin抗體、CD44抗體、CyclinD1抗體、MM7抗體、c-myc抗體、微管蛋白抗體以及抗鼠/抗兔二抗購自Cell Signaling公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集、制備及分組 在位子宮內(nèi)膜組織和異位子宮內(nèi)膜組織的標(biāo)本分別取自2019年1-12月在本院接受腹腔鏡卵巢子宮異位內(nèi)膜囊腫切除術(shù)和行常規(guī)宮腔鏡檢查的20例婦女[平均年齡(31.56±4.23)歲]的卵巢囊腫和子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。根據(jù)美國生殖醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的子宮內(nèi)膜異位癥分類[10],所有患者均被確診為Ⅲ-Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥。對(duì)照子宮內(nèi)膜標(biāo)本取自20例[平均年齡(30.62±3.72)歲]接受宮腔鏡治療子宮縱隔的婦女。此外,在手術(shù)前從子宮內(nèi)膜異位癥組和對(duì)照組患者采集了血清樣本。

所有組織和血清標(biāo)本在收集后30 min內(nèi)用于細(xì)胞培養(yǎng)或放置在-80 ℃下保存。子宮內(nèi)膜異位組織的納入標(biāo)準(zhǔn)為:月經(jīng)周期正常,子宮內(nèi)膜無腫瘤、息肉,無內(nèi)分泌疾病或急性炎癥,在過去6個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。所有涉及人體血液和組織樣本的實(shí)驗(yàn)獲得本院醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),研究參與者在樣本采集前簽署了書面知情同意書。

為確認(rèn)異位內(nèi)膜組織中LPR5的mRNA和蛋白表達(dá)水平是否發(fā)生改變,將患者子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本分為在位內(nèi)膜組(在位組,9例)和異位內(nèi)膜組(異位組,11例),取正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組(20例)。為評(píng)價(jià)LRP5在子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)展中的作用,將異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ectopic endometrial stromal cells,EESC)分別轉(zhuǎn)染LRP5 siRNA(si-LRP5組)和空質(zhì)粒的陰性對(duì)照(si-NC組)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將5例腹腔鏡卵巢囊腫切除術(shù)后的異位內(nèi)膜組織置于DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco)中,切成小塊,在37 ℃恒溫水浴鍋中用膠原酶Ⅰ消化1 h,然后用70 μm的濾網(wǎng)去除殘留組織碎片和其他雜質(zhì)。2 500 r/min離心8 min后,再懸浮于含10%胎牛血清(FBS;Gibco)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中。隨后,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到6孔板中并在37 ℃含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 cDNA與RT-qPCR分析LRP5表達(dá)水平 將保存的組織樣本從-80 ℃轉(zhuǎn)移到4 ℃,選取直徑約5 mm的組織,用TRIzol RNA分離試劑(InvitrogenTM)提取總RNA;PrimeScript RT試劑盒(Takara)用于cDNA合成。使用SYBR PreMix Ex Taq試劑盒(Thermofish)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)。每個(gè)組織樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。用于RT-qPCR反應(yīng)的引物序列均從GeneBank中檢索,并由生工生物工程(上海)股份有限公司(中國上海)合成。引物序列如下:LRP5-F,5′-AACGTGGTCATCTCCGGCCTGGTCTCT-3′;LRP5-R,5′-GGGGTCCAAGGCGATGGCCCTCGGCT-3′;GAPDH-F,5′-GCACCGTCAAGGCTGAAC-3′;GAPDH-R,5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平 根據(jù)文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。收集內(nèi)膜組織樣本或細(xì)胞,使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解處理,然后低溫高速離心收集蛋白樣品,使用BCA分析試劑盒測量蛋白濃度,總蛋白(20 μg)用10% SDS-PAGE分離,然后轉(zhuǎn)移到PDVF膜上,并在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h;然后將膜與一抗LRP5(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶5 000)、CD44(1 ∶1 000)、CyclinD1(1 ∶1 000)、MM7(1 ∶1 000)、c-myc(1 ∶1 000)和Tublin(1 ∶5 000)在4 ℃下孵育過夜。隨后,將它們與抗鼠/抗兔二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑檢測結(jié)合抗體復(fù)合物,并使用ImageJ軟件將微管蛋白表達(dá)歸一化后,用條帶密度計(jì)法測定相對(duì)蛋白表達(dá)量。每個(gè)組織或細(xì)胞樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和siRNA轉(zhuǎn)染分析LRP5的相對(duì)水平 血清中可溶性LRP5濃度用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)進(jìn)行測定。將70%融合的異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(EESC)接種到6孔板中,按照說明書,將siRNA與RNA-IMAX共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染72 h后,收集細(xì)胞,使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解出來,然后低溫高速離心收集蛋白樣品,經(jīng)BCA分析試劑盒測量蛋白濃度后,總蛋白(20 μg)用10% SDS-PAGE分離,然后轉(zhuǎn)移到PDVF膜上,并在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h;然后將膜與方法1.2.4涉及的一抗在4 ℃下孵育過夜。隨后,將它們與抗鼠/抗兔二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑檢測結(jié)合抗體復(fù)合物,并使用ImageJ軟件將微管蛋白表達(dá)歸一化后,用條帶密度計(jì)法測定相對(duì)蛋白表達(dá)量并分析轉(zhuǎn)染效率。每個(gè)細(xì)胞樣本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法測定細(xì)胞增殖 為評(píng)估轉(zhuǎn)染72 h后EESC的增殖能力,將細(xì)胞接種于96孔板中,每孔約4×103個(gè)細(xì)胞,然后用si-NC或si-LRP5做轉(zhuǎn)染處理。按照細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)說明書方法測定,使用Varioskan Flash微板讀取器(Thermo Science)分別在0,1,2,3,4 d測量450 nm處的吸光度變化。每組細(xì)胞樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 Transwell和Matrigel分析細(xì)胞遷移和侵襲情況 使用Transwell小室和孔徑8 mm的聚碳酸酯過濾器進(jìn)行Transwell遷移和Matrigel侵入分析。將si-LRP5或si-NC轉(zhuǎn)染EESC 48 h,然后分別以4×104和1×105個(gè)細(xì)胞/室懸浮于200 μl無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液中進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。隨后將懸浮細(xì)胞分別轉(zhuǎn)接含或不含Matrigel涂層至頂室。同時(shí),將含有10%胎牛血清的500 μl DMEM/F-12放入底室。在37 ℃孵育24 h(遷移)或48 h(侵襲)后,取出保留在膜表面的細(xì)胞,用0.1%結(jié)晶紫染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察(×200)。從每個(gè)腔室中隨機(jī)選擇5個(gè)視野,并使用ImageJ軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)量,取平均值。每組細(xì)胞樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 傷口劃痕試驗(yàn)分析細(xì)胞愈合情況 將細(xì)胞接種于6孔板中,然后用si-LRP5或si-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,待EESC的細(xì)胞密度大于或等于95%,然后用200 μl無菌移液管的尖端刮擦細(xì)胞單層傷口。然后在無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)12 h,分別在0 h和12 h時(shí)間點(diǎn)于光學(xué)顯微鏡下(×100)采集圖像。使用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞單層上愈合區(qū)域的大小,并使用ImageJ軟件分析計(jì)算傷口面積及愈合面積(打開ImageJ軟件,對(duì)劃痕圖片進(jìn)行Process->Smooth平滑處理后,進(jìn)行Process->Find Edges尋找邊緣,然后進(jìn)行劃痕面積分析,即可計(jì)算傷口或愈合面積)。其相對(duì)傷口面積=轉(zhuǎn)染后12 h的傷口面積/轉(zhuǎn)染后0 h的傷口面積;其相對(duì)愈合面積=轉(zhuǎn)染后12 h的愈合面積/轉(zhuǎn)染后0 h的愈合面積。每組細(xì)胞樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選分析細(xì)胞周期 為進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,取對(duì)數(shù)生長期的EESC細(xì)胞,按1×105個(gè)細(xì)胞/ml以1 ml接種于100 mm培養(yǎng)皿內(nèi);24 h后,將si-LRP5或si-NC轉(zhuǎn)染EESC并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞,并用低速離心機(jī)離心(1 000 r/min,5 min);使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后,加入3.5 ml無水乙醇混勻細(xì)胞,于4 ℃固定30 min后,再次使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞;然后加入200 μl和2 μl RNA酶于37 ℃孵育30 min,加入PI進(jìn)行避光染色30 min后,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。使用細(xì)胞周期染色試劑盒和FACS系統(tǒng)(美國)對(duì)轉(zhuǎn)染的EESC進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。每個(gè)細(xì)胞樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,多重比較采用單因素方差分析,然后進(jìn)行Newman-Keuls檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LRP5在子宮內(nèi)膜異位組織和血清中高表達(dá)

與在位組和對(duì)照組相比,異位組患者子宮內(nèi)膜異位組織中LRP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01,見圖1)。ELISA法檢測血清可溶性LRP5濃度,結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中LRP5濃度明顯高于對(duì)照組(P<0.01,見圖2)。

A.Western blotting檢測LRP5的表達(dá) B.RT-PCR檢測LRP5 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較,**P<0.01;與在位組比較,##P<0.01圖1 LRP5在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)Figure 1 The expression of LRP5 in endometrium

與對(duì)照組比較，**P<0.01圖2 異位癥患者血清中可溶性LRP5的含量變化Figure 2 Content of soluble LRP5 in serum of endometriosis by ELISA

2.2 LRP5基因敲除降低EESC體外增殖能力

CCK-8檢測結(jié)果顯示,從第2天起,si-LRP5組EESC的增殖能力均顯著低于si-NC組(P<0.01,見圖3)。

與si-NC組比較,**P<0.01圖3 CCK-8檢測si-NC組和si-LRP5組EESC的增殖情況Figure 3 Proliferation of EESC in si-NC group and si-LRP5 group by CCK-8

2.3 LRP5基因敲除降低EESC體外遷移和侵襲能力

Western blotting分析結(jié)果顯示,si-LRP5組EESC中LRP5的表達(dá)水平相較于si-NC組明顯降低(P<0.01,見圖4)。傷口劃痕試驗(yàn)以及Transwell遷移和侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-LRP5組EESC的遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01,見圖4,5)。

與si-NC組比較,**P<0.01圖4 LRP5基因敲除后對(duì)蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of LRP5 gene knockout on protein expression and cell migration

與si-NC組比較,**P<0.01圖5 LRP5基因敲除對(duì)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的影響Figure 5 Effect of LRP5 gene knockout on migration and invasion of ectopic endometrial stromal cells in vitro

2.4 LRP5基因敲除降低EESC S期細(xì)胞的比例

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-LRP5組EESC中G1期細(xì)胞比例較高,S期細(xì)胞比例較低(P<0.01),而G2/M期細(xì)胞變化不顯著(P>0.05,見圖6)。

圖6 si-NC組和si-LRP5組EESC在不同細(xì)胞周期時(shí)的比例Figure 6 Ratio of EESC in different cell cycles in si-NC group and si-LRP5 group

2.5 下調(diào)LRP5表達(dá)對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響

Western blotting對(duì)Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、MMP7、c-myc、CD44和CyclinD1的檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染72 h后,與si-NC組相比,si-LRP5組EESC中β-catenin、MMP7、c-myc、CD44和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01,見圖7)。

與si-NC組比較,**P<0.01圖7 LRP5基因敲除對(duì)Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of LRP5 gene knockout on Wnt/β-Catenin pathway protein expression

3 討論

雖然子宮內(nèi)膜異位癥通常被認(rèn)為是一種良性疾病,但異位內(nèi)膜細(xì)胞可以表現(xiàn)出惡性的生物學(xué)行為,類似于腫瘤細(xì)胞[12,13]。這些惡性行為是由一系列因素誘發(fā),這些因素在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。

此前的研究表明,在子宮內(nèi)膜異位組織和正常子宮內(nèi)膜之間,許多基因的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化,這與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的惡性行為有關(guān)[14,15]。有報(bào)道稱,LRP5在骨髓瘤和卵巢癌中的表達(dá)較高,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16,17]。

然而,目前對(duì)LRP5與子宮內(nèi)膜異位癥的病理關(guān)系知之甚少。因此,本研究通過檢測子宮內(nèi)膜組織中LRP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平,探討LRP5在異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的(EESC)增殖、遷移和侵襲能力中的作用。本研究結(jié)果表明,LRP5在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織,而在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平與正常子宮內(nèi)膜組織相比無明顯差異。此外,LRP5基因敲除還影響EESC的增殖、遷移和侵襲。綜上所述,LRP5可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中起促進(jìn)作用。

Wnt途徑是一條在進(jìn)化上高度保守的途徑,影響許多細(xì)胞過程,如增殖、分化和自我更新等[18]。最具特征性的Wnt經(jīng)典途徑是Wnt/β-catenin途徑,該途徑需要β-catenin的核轉(zhuǎn)位來啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。在細(xì)胞核內(nèi),β-catenin可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而影響Wnt靶基因的水平,如CD44、c-myc、MMP7和細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)[20]。有研究報(bào)道,通過靶向c-myc和CCND1可加速腫瘤細(xì)胞增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常和細(xì)胞凋亡[21]。Alapati等[22]的研究結(jié)果表明,LRP5可通過Wnt/β-catenin途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的增殖、遷移和侵襲。因此,本研究重點(diǎn)探究了LRP5與Wnt/β-catenin通路的調(diào)控關(guān)系,結(jié)果表明與轉(zhuǎn)染si-NC相比,轉(zhuǎn)染si-LRP5的EESCz中β-catenin、MMP7、c-myc、CD44和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低。提示LRP5可能通過Wnt/β-catenin途徑誘導(dǎo)EESC的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述,LRP5在子宮內(nèi)膜異位組織中高表達(dá),并通過Wnt/β-catenin途徑在EESC的增殖、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。然而,仍需要更多的研究來確定LRP5在子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)展過程中的具體機(jī)制,以及它作為子宮內(nèi)膜異位癥生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。