尿酸對(duì)急性發(fā)作期痛風(fēng)患者外周血中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成的影響及其臨床意義

滿達(dá)夫,侯云霞,李鴻斌

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,呼和浩特 010050;*通訊作者,E-mail:lhbwb73@126.com)

痛風(fēng)是由嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄障礙所致的一組異質(zhì)性疾病,是由于單鈉尿酸鹽(monosodium urate,MSU)結(jié)晶在關(guān)節(jié)和軟組織中積聚所致,其臨床表現(xiàn)包括無癥狀高尿酸血癥、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石、慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、尿酸性腎病和尿路尿酸鹽結(jié)石等[1]。除關(guān)節(jié)損傷外,痛風(fēng)患者還可合并心血管和腎臟疾病[2]。目前我國痛風(fēng)的患病率在1%-3%,并呈逐年上升趨勢[3,4]。盡管多數(shù)痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)炎癥狀會(huì)在2周內(nèi)自愈,但其治療不充分、患者依從性差是痛風(fēng)管理的主要挑戰(zhàn)。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),血尿酸濃度增高形成高尿酸血癥、尿酸沉積后形成的MSU可刺激單核巨噬細(xì)胞活化和多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)活化脫顆粒引發(fā)局部炎癥反應(yīng),是痛風(fēng)發(fā)作的關(guān)鍵因素[5]。事實(shí)上,PMN激活后可釋放由細(xì)胞質(zhì)與顆粒的內(nèi)容物及DNA組成的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs),以消除細(xì)胞外病原體。從宿主-病原體的角度上考慮,NETs對(duì)宿主早期發(fā)揮抗感染免疫具有重要作用,然而研究表明中性粒細(xì)胞的過度活化可參與炎癥和自身免疫過程,包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[6]。動(dòng)物模型及體外實(shí)驗(yàn)表明沉積于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的MSU可激活NETs的形成,從而誘發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎到痛風(fēng)石形成的一系列病理機(jī)制[7]。但是,外周血的中性粒細(xì)胞是否能在MSU誘導(dǎo)下激活NETs形成,參與痛風(fēng)的病情活動(dòng)尚未見確切報(bào)道。本研究旨在探討MSU誘導(dǎo)的NETs水平是否與痛風(fēng)的病情活動(dòng)度和嚴(yán)重程度相關(guān),即中性粒細(xì)胞對(duì)MSU的敏感性是否在急性痛風(fēng)發(fā)作期與健康對(duì)照、緩解期之間存在差異。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究納入的所有研究對(duì)象來源于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,其中健康對(duì)照(healthy control,HC)組來源于體檢中心25名成年男性健康志愿者,痛風(fēng)(gout)組來源于風(fēng)濕免疫科2017年1月至2018年1月期間住院及門診的56名痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期患者,同時(shí)痛風(fēng)組患者經(jīng)治療后1個(gè)月后處于緩解期(remission)作為疾病的陰性對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)2015年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟痛風(fēng)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[8](ACR-EULAR Gout Classification Criteria),≥8分符合痛風(fēng)診斷,或1977年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)分類標(biāo)準(zhǔn)急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的分類標(biāo)準(zhǔn)[9]。排除標(biāo)準(zhǔn):入組患者需除外其他風(fēng)濕病史、骨關(guān)節(jié)病、血栓相關(guān)疾病和近期感染史。痛風(fēng)組患者在接受治療前完成外周靜脈血采集和臨床相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測,作為基線期數(shù)據(jù)。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):KY20163202-1),所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

Leica DMI4000 B智能型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司),BD FACSCalibur全自動(dòng)雙激光四色流式細(xì)胞分析分選系統(tǒng)(美國BD公司),Sorvall ST 40R離心機(jī)、HeraeusTMFrescoTM21 Microcentrifuge、Heraeus Labofuge 400 R離心機(jī)購自美國Thermo Fisher Scientific公司),Bio Tek SNergy H4(美國伯騰儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 入組對(duì)象外周血中性粒細(xì)胞的分離 收取患者或健康對(duì)照的新鮮外周抗凝血5 ml,按照PolymorphprepTM密度梯度離心法分離人外周血中性粒細(xì)胞[10],吸取中性粒細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入10 ml HBSS,上下顛倒數(shù)次,懸浮細(xì)胞,室溫下400g離心10 min,棄上清。加入2 ml紅細(xì)胞裂解液重懸,上下吹打混勻,300g離心5 min,棄上清,加入RPMI-1640培養(yǎng)基,計(jì)數(shù),調(diào)至1×106/ml后待測純度。

1.3.2 中性粒細(xì)胞純度的檢測 分別吸取10 μl細(xì)胞至3個(gè)潔凈的1.5 ml EP管,300g離心5 min,棄上清。每管均加入200 μl PBS重懸細(xì)胞,一管加入20 μl CD16單抗作為實(shí)驗(yàn)組,另一管加入20 μl Mouse IgG1 kappa作為同型對(duì)照,最后一管則加入20 μl PBS作為空白對(duì)照。4 ℃避光孵育30 min,PBS洗滌2次,最后一次離心后加入200 μl PBS重懸細(xì)胞,上機(jī)分析,純度大于95%的中性粒細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs 24孔板中預(yù)先置入多聚賴氨酸處理的無菌玻璃片,按4×105個(gè)/孔接種上述實(shí)驗(yàn)分離出的中性粒細(xì)胞,CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)細(xì)胞1 h。根據(jù)中性粒細(xì)胞來源不同,分為健康對(duì)照組(HC組)及痛風(fēng)急性發(fā)作組分別加入等體積100 nmol/L佛波酯(PMA),125,250,500 μg/ml尿酸鹽(MSU)分別誘導(dǎo)細(xì)胞,空白對(duì)照組(PBS組)予等體積PBS;3 h后收集細(xì)胞上清,用于檢測游離cfDNA、NE濃度。

1.3.4 免疫熒光法檢測NETs形成 細(xì)胞爬片固定,用1%BSA封閉30 min,用抗H3Cit、抗MPO孵育1 h,PBS洗滌后用相應(yīng)二抗避光孵育1 h,之后DAPI染核1 min,洗滌后封片在熒光顯微鏡下成像觀察。

1.3.6 病情評(píng)價(jià)指標(biāo) 包括患者疼痛視覺模擬評(píng)分法[11](visual analogue scale,VAS)、痛風(fēng)疾病評(píng)估問卷2.0版[12](gout assessment questionnaire,GAQ 2.0)及痛風(fēng)疾病活動(dòng)性評(píng)分[13](gout activity score,GAS)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,根據(jù)數(shù)據(jù)的分布特點(diǎn)兩組間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)(急性發(fā)作期和緩解期的相關(guān)數(shù)據(jù))、獨(dú)立t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。變量間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 19.0,以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床特征

痛風(fēng)急性發(fā)作組與健康對(duì)照組在年齡、性別、BMI、血糖和低密度脂蛋白之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。痛風(fēng)急性發(fā)作組甘油三酯和血清尿酸水平高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見表1)。

表1 入組研究對(duì)象的臨床特征

2.2 中性粒細(xì)胞純度的鑒定

根據(jù)CD16標(biāo)記中性粒細(xì)胞鑒定分離純度(見圖1),FITC-CD16單抗標(biāo)記分離的中性粒細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD16陽性細(xì)胞純度可達(dá)97.08%(圖1紅色矩形標(biāo)出)。

2.3 HC組與痛風(fēng)組中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)形成cfDNA濃度的比較

圖2為熒光顯微鏡NETs形成圖,中性粒細(xì)胞經(jīng)PMA刺激后,細(xì)胞釋放至上清的cfDNA含量明顯升高。痛風(fēng)急性發(fā)作期組中性粒細(xì)胞經(jīng)125,250,500 μg/ml尿酸鹽誘導(dǎo)3 h,即可產(chǎn)生大量cfDNA,高于同一濃度下健康對(duì)照組(HC組)產(chǎn)生的cfDNA濃度,并且高于同一組內(nèi)空白對(duì)照組(PBS組)的cfDNA濃度(P<0.01,見表2),該結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致(見圖3)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞純度Figure 1 The purity of neutrophils detected by flow cytometry

A.免疫熒光顯微鏡評(píng)估NETs (×400)B.NETs形成細(xì)胞的百分比圖2 熒光顯微鏡鑒定NETs形成Figure 2 NETs formation identified by fluorescence microscopy

表2 痛風(fēng)患者與健康對(duì)照細(xì)胞上清液cfDNA濃度的比較 (ng/ml)

圖3 痛風(fēng)患者與健康對(duì)照中性粒細(xì)胞對(duì)不同誘導(dǎo)劑的反應(yīng)Figure 3 Neutrophil response to various inducers in patients with gout and healthy controls

2.4 急性發(fā)作期痛風(fēng)患者NETs水平與臨床特征的相關(guān)性分析

痛風(fēng)急性發(fā)作期患者血漿中cfDNA和NE水平具有很強(qiáng)的正相關(guān)性(r=0.762,P<0.01)。痛風(fēng)急性發(fā)作期患者血漿cfDNA和NE濃度與患者的年齡、BMI無相關(guān)性(P>0.05,見表3)。在患者的常規(guī)生化指標(biāo)中,僅甘油三酯與cfDNA呈現(xiàn)出弱相關(guān)性(r=0.277,P<0.05)。血尿酸水平與cfDNA呈顯著強(qiáng)正相關(guān)性(r=0.612,P<0.01),與NE水平呈中等程度正相關(guān)性(r=0.564,P<0.01)。在3個(gè)病情評(píng)價(jià)指標(biāo)中,GAS和GIS與患者的NETs水平呈現(xiàn)出明顯的強(qiáng)正相關(guān)性(r>0.6)。臨床中常用到非特異炎癥評(píng)價(jià)指標(biāo),血沉與NETs水平顯示出中等程度相關(guān)(r>0.4),C反應(yīng)蛋白呈現(xiàn)弱相關(guān)(r>0.2)。以上結(jié)果的差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

2.5 急性發(fā)作期與發(fā)作緩解期NETs水平的差異

痛風(fēng)急性發(fā)作期患者56例經(jīng)相關(guān)治療后1月,收集其外周血,檢測cfDNA和NE水平,再次復(fù)查相關(guān)指標(biāo),構(gòu)成前后對(duì)照。與急性發(fā)作期比較,緩解期除低密度脂蛋白外,各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善,甘油三酯、血尿酸水平、炎性指標(biāo)、病情評(píng)價(jià)指標(biāo)和循環(huán)NETs濃度明顯下降(P<0.05,見表4)。

為了進(jìn)一步研究痛風(fēng)患者血漿NETs水平與病情的相關(guān)性,我們對(duì)上述指標(biāo)的變化值(Δ值)進(jìn)行相關(guān)性分析。在SPSS軟件中,將每位患者急性發(fā)作期的單項(xiàng)數(shù)值減去緩解期的數(shù)值,定義為該患者該項(xiàng)指標(biāo)的變化值(Δ值)。

表3 痛風(fēng)急性發(fā)作期患者NETs水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

表4 急性發(fā)作期與發(fā)作緩解期臨床特征的比較

每項(xiàng)指標(biāo)Δ值之間做Pearson相關(guān)分析,結(jié)果見表5。痛風(fēng)病情評(píng)價(jià)指標(biāo)中,△GAS與血漿NETs的變化(ΔDNA,ΔNE)顯示中等程度的正相關(guān)性(r>0.5,P<0.01)。ΔCRP與ΔESR未顯示出與病情評(píng)價(jià)指標(biāo)變化值之間明確的相關(guān)性,但二者之間存在中等程度正相關(guān)性(r=0.565,P<0.01)。ΔsUA與ΔGAS之間存在中等程度正相關(guān)性(r=0.580,P<0.01)。

表5 觀測指標(biāo)值的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明,急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時(shí),MSU晶體可誘導(dǎo)大量的炎癥細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)募集、浸潤于晶體沉積部[10]。這些免疫細(xì)胞釋放的IL-1進(jìn)一步激活促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放,如IL-8、IL-6和CXCL8,上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面的選擇素和整合素,進(jìn)一步增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的募集。此外,MSU晶體還可激活局部浸潤的PMNs,誘導(dǎo)其解離cfDNA,釋放NE、MPO及胞漿蛋白,形成NETs[14,15]。本研究通過MSU體外誘導(dǎo)NETs生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)痛風(fēng)急性發(fā)作期患者的中性粒細(xì)胞對(duì)MSU的敏感性較健康對(duì)照、痛風(fēng)緩解期患者的高,且NETs水平與疾病活動(dòng)度、病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。

首先,通過比較痛風(fēng)組和HC組的基線情況,發(fā)現(xiàn)兩組在一般情況(年齡、性別和BMI)與常規(guī)生化指標(biāo)(血糖和低密度脂蛋白)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而痛風(fēng)組的尿酸顯著高于HC組,表明兩組樣本具有代表性和可比性。其次,本研究利用目前國際上主流的、可靠的免疫熒光法鑒定NETs結(jié)構(gòu)[16],在不同濃度梯度的MSU誘導(dǎo)下,痛風(fēng)組的中性粒細(xì)胞較HC組產(chǎn)生更高濃度的cfDNA和NE,提示痛風(fēng)急性發(fā)作期患者的中性粒細(xì)胞對(duì)MSU誘導(dǎo)產(chǎn)生的NETs更敏感[17]。結(jié)合臨床現(xiàn)象,部分患者的血尿酸水平持續(xù)性或波動(dòng)性升高,但未發(fā)生痛風(fēng),從高尿酸血癥發(fā)展至痛風(fēng)可長達(dá)數(shù)年至數(shù)十年,且有部分患者并不發(fā)生急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎,稱為“無癥狀高尿酸血癥”[18]。根據(jù)本文的研究結(jié)果,可推測發(fā)生痛風(fēng)患者的中性粒細(xì)胞可能在先天、后天因素的累積影響下發(fā)生缺陷,增加其對(duì)MSU的敏感性,誘導(dǎo)NETs的大量生成,從而導(dǎo)致痛風(fēng)的急性發(fā)作[19]。這與既往研究結(jié)果一致[20],即體外MSU能誘導(dǎo)循環(huán)中性粒細(xì)胞NETs的形成。其具體機(jī)制目前尚未明確,一個(gè)假說認(rèn)為關(guān)節(jié)局部的MSU小晶體可進(jìn)入外周循環(huán),活化中性粒細(xì)胞而導(dǎo)致NETs的形成[7];亦有可能局部炎癥觸發(fā)全身炎癥狀態(tài),在沒有MSU直接刺激下啟動(dòng)中性粒細(xì)胞的活化和NETs的形成。

另外,本研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)急性發(fā)作期患者外周血中NETs水平與病情活動(dòng)度(GAS評(píng)分)和病情嚴(yán)重程度(GIS評(píng)分)呈正相關(guān)性,揭示NETs水平可用于痛風(fēng)病情嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)。這符合NETs為廣義的致病性DNA復(fù)合物的定義,機(jī)體的炎癥狀態(tài)與NETs水平相關(guān)。然而Vedder等[21]發(fā)現(xiàn)cfDNA水平與痛風(fēng)患者疾病活動(dòng)或炎癥標(biāo)志物無關(guān),有可能與該研究對(duì)痛風(fēng)病情活動(dòng)和嚴(yán)重程度的評(píng)分工具與本研究不同,且該研究直接檢測的循環(huán)cfDNA而不是體外MSU誘導(dǎo)的cfDNA水平。

在對(duì)急性發(fā)作期組和緩解組的NETs分析時(shí),可發(fā)現(xiàn)緩解組的非特異炎性指標(biāo)、血尿酸水平、NETs水平、病情的活動(dòng)性和嚴(yán)重程度均較急性發(fā)作期組明顯降低,提示目前的痛風(fēng)急性期治療方案可有效控制病情,使疾病進(jìn)入緩解期。在各項(xiàng)指標(biāo)變化值(值)的相關(guān)性分析中,僅有GAS與GIS之間具有高度相關(guān)性(r>0.6,P<0.01),提示GAS和GIS評(píng)分較為穩(wěn)定。而GAS與NETs之間具有中等程度的相關(guān)性(r>0.5,P<0.01),說明患者外周血NETs水平在評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度方面穩(wěn)定性較好。

本研究具有一定的局限性。首先,本研究納入的研究對(duì)象均為男性,結(jié)果可能由性別帶來的差異而產(chǎn)生偏倚。其次,本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)高尿酸血癥患者和痛風(fēng)患者之間的NETs水平差異進(jìn)行深入研究。最后,由于本研究檢測的NETs指標(biāo)(包括cfDNA和NE)均為體外MSU誘導(dǎo)下進(jìn)行,未能闡釋機(jī)體真實(shí)的循環(huán)NETs水平,對(duì)未來的臨床應(yīng)用仍需更多的研究支持。