空化射流對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)及乳化特性的影響

江連洲，楊宗瑞，任雙鶴，郭增旺，王中江,3，尹金富

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 臨邑禹王植物蛋白有限公司，德州 251200；3. 山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，東營(yíng) 257500；4. 濰坊第一春食品有限公司，濰坊 262699）

0 引 言

大豆分離蛋白（SPI，Soy Protein Isolate）具有較高的食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。然而，未經(jīng)改性的天然SPI理化性質(zhì)易受環(huán)境因素影響，因而使其應(yīng)用受到一定程度的限制[2]，不能滿足特定食品加工的要求。

現(xiàn)有研究表明，空化射流處理具有高熱、高壓、強(qiáng)剪切、強(qiáng)沖擊波等特點(diǎn)[3-4]。處理中產(chǎn)生的能量可以打開各種材料的分子鏈，產(chǎn)生的沖擊波和微射流通過沖蝕作用使物料粉碎。作為一種操作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、易于工業(yè)化的新技術(shù)，空化射流近年來逐漸得到各界學(xué)者的廣泛關(guān)注。Oliete等[5]發(fā)現(xiàn)空化射流產(chǎn)生的空化效應(yīng)可改變豌豆球蛋白聚集體的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了其乳液穩(wěn)定性，具有較高的工業(yè)化價(jià)值。Subirade等[6]發(fā)現(xiàn)空化效應(yīng)對(duì)β-乳球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響比較顯著。解長(zhǎng)遠(yuǎn)等[7]研究了空化射流處理時(shí)間對(duì)不同質(zhì)量濃度大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響，結(jié)果表明處理后的大豆11S球蛋白功能特性得到改善。同時(shí)蛋白質(zhì)濃度也會(huì)影響物理場(chǎng)對(duì)蛋白改性的效果。李笑笑[8]的研究表明高場(chǎng)強(qiáng)超聲波處理大豆蛋白后，所有樣品的溶解度均呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)，其中5%濃度的SPI具有更高的溶解度，但超聲處理對(duì)3%濃度的SPI溶解性提升的幅度相對(duì)更大。李雨楓等[9]的研究表明不同濃度下的肌原纖維蛋白也會(huì)影響高壓均質(zhì)對(duì)其的改性效果。但是目前關(guān)于空化射流物理場(chǎng)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和界面特性影響的互作機(jī)制還尚未見報(bào)道。

本文采用空化射流處理對(duì)SPI進(jìn)行物理改性，探究空化射流處理時(shí)間對(duì)不同大豆蛋白濃度下的結(jié)構(gòu)及乳液界面性質(zhì)的影響，為SPI工業(yè)改性應(yīng)用提供新方法及相應(yīng)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（食品級(jí)，純度92%）：山東禹王實(shí)業(yè)有限公司。

十二烷基硫酸鈉（SDS，Sodium Dodecyl Sulfate）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；lowery蛋白試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS，8-Anilino-1-Naphthalenesulfonic acid）：美國(guó)Sigma公司。所用其他試劑最低純度為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD 5-3型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM公司；2L實(shí)驗(yàn)室小型射流空化機(jī)，北京中森匯嘉科技發(fā)展有限責(zé)任公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，中國(guó)上海雷磁公司；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立公司；Zetasize Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；D-6L超高壓均質(zhì)機(jī)，美國(guó)PhD科技有限公司；1600PC紫外-可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；RST-CPS流變儀，美國(guó)博勒飛公司；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

參考解長(zhǎng)遠(yuǎn)等[7]的方法并加以改動(dòng)，將SPI以2%和5%的濃度溶解于pH值為7.0，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌直至樣品充分溶解。將樣品溶液用空化射流機(jī)在0.01 MPa壓力、20 ℃下分別處理2、4、6、8、10 min，得到樣品溶液（2種濃度SPI溶液及對(duì)應(yīng)的5種不同空化射流處理時(shí)間的SPI溶液）共12種。凍干后即得樣品。

1.3.2 氨基酸含量的測(cè)定

參考Wu等[10]的測(cè)量方法，將樣品溶液在110 ℃條件下加入6.0 mol/L的HCl溶液酸解24 h后，用氨基酸分析儀測(cè)定，進(jìn)樣量為30μL。

1.3.3 還原性SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）電泳

參考Laemmli[11]的方法并加以改動(dòng)，將樣品以0.01 g/mL濃度溶于pH值為7.0，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，再與上樣緩沖液等量混合，煮沸5 min，上樣量為12μL。電泳過程采用恒壓模式，在濃縮膠中電壓為80 V，分離膠中電壓為120 V。停止電泳后將分離膠移入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色0.5 h，再于脫色液中浸泡至無色，拍照記錄結(jié)果。

1.3.4 溶液粒徑的測(cè)定

用pH值為7.0，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液將樣品配成0.2%的蛋白溶液，在室溫下采用Zetasize Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀進(jìn)行測(cè)量。參數(shù)設(shè)置為顆粒折射率1.45，分散劑折射率1.34，吸附率0.001。

1.3.5 乳液樣品的制備

將樣品以0.01 g/mL濃度溶于pH值為7.0，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，混勻后在4 ℃冰箱過夜，使其充分水合。向溶液中加入5%的大豆油，經(jīng)11 000 r/min粗均1.5 min后，在60 MPa下高壓均質(zhì)3次，得到新鮮乳液。

1.3.6 乳液ζ-電位的測(cè)定

將乳液用pH值為7.0，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液稀釋（1∶100），充分混勻后，裝入電位杯，用Zetasize Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀測(cè)量電位，重復(fù)3次。

1.3.7 界面蛋白含量的測(cè)定

界面蛋白含量的測(cè)定參照Keerati等[12]的方法并加以改動(dòng)。將乳液在室溫下20 000 r/min離心40 min，離心后乳液分為上下2層。取下層的蛋白水相過0.22μm濾膜后用lowry法測(cè)定其蛋白含量。界面蛋白含量計(jì)算公式如式（1）：

式中Γ為界面吸附蛋白量，mg/m2；Ctotal為乳液中總蛋白濃度，(g/g)；Cserum為水相的蛋白濃度，(g/g)；B為液滴的比表面積，（m2/g）。

1.3.8 乳液粒徑的測(cè)定

乳液的粒度分布采用Chen等[13]的方法，將乳液用去離子水稀釋（1∶1 000），充分混勻后，通過Zetasize Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀測(cè)定。參數(shù)設(shè)置為顆粒折射率1.45，分散劑折射率1.33，吸附率0.001。在環(huán)境溫度下進(jìn)行測(cè)量，并重復(fù)3次。記錄乳狀液滴粒徑分布曲線和體積平均粒徑（D4,3）。

1.3.9 乳液動(dòng)態(tài)流變學(xué)的測(cè)定

根據(jù)Niu等[14]的方法并加以改動(dòng)，設(shè)置2個(gè)板間距為0.5 mm，直徑為40 mm的平板。取1 mL乳液加到流變儀感應(yīng)板上，在角頻率為0.63 rad/s的條件下進(jìn)行溫度掃描，最大應(yīng)變?yōu)?.02%。測(cè)定期間樣品以5 ℃/min的速率從25 ℃升溫至90 ℃，恒溫20 min后再以5 ℃/min的速率降至25 ℃。記錄下彈性模量G′的數(shù)值變化。

1.3.10 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定根據(jù)汪菁琴[15]的方法并加以改動(dòng)，將乳液用1 g/L的SDS溶液稀釋（1∶250），充分混勻后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500 nm下測(cè)量其吸光值A(chǔ)。30 min后再次測(cè)量其吸光值A(chǔ)0。用1 g/L的SDS溶液作為空白對(duì)照。乳化活性（EAI，Emulsifying Activity Index）和乳化穩(wěn)定性（ESI，Emulsifying Stability Index）的計(jì)算公式如式（2）、式（3）：

式中A為樣品溶液吸光值；A0為30 min后樣品溶液的吸光值；C為乳化液形成之前的溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，(g/mL)；φ為油占乳化液的體積分?jǐn)?shù)；N為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 2019b軟件作圖。采用SPSS 26軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸含量分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的人體必需氨基酸及含硫氨基酸含量的影響見表1。

由表1可知，空化射流處理對(duì)不同濃度的SPI氨基酸含量具有顯著的影響，其中含硫氨基酸含量發(fā)生了顯著的變化。這表明適當(dāng)?shù)目栈淞魈幚砜梢酝ㄟ^氨基酸間的相互轉(zhuǎn)化，改變SPI的氨基酸組成[16]。隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2%和5%濃度下SPI組分中的含硫氨基酸（即甲硫氨酸和半胱氨酸）均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，且丙氨酸含量的變化趨勢(shì)大致與含硫氨基酸的變化趨勢(shì)相反。這可能是因?yàn)榭栈淞魑锢韴?chǎng)的空化效應(yīng)所產(chǎn)生的局部瞬時(shí)高溫使甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，而半胱氨酸發(fā)生了脫硫反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為丙氨酸，進(jìn)而導(dǎo)致含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）含量的下降[17]。這表明空化射流處理可以通過改變SPI中的氨基酸組成及含量影響蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)SPI功能活性的調(diào)節(jié)。

2.2 SDS-PAGE圖譜分析

采用SDS-PAGE 分析不同空化射流處理時(shí)間下SPI的組成，結(jié)果見圖1。

表1 不同空化射流處理時(shí)間對(duì)2%及5%濃度的大豆分離蛋白部分氨基酸組成的影響Table 1 Effect of different cavitation jet treatment time on the amino acid composition of 2% and 5% concentration of soybean protein isolate %

由圖1可知，空化射流處理對(duì)不同濃度的SPI的亞基組成無顯著影響，未改變SPI的7S和11S亞基部分，但隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，亞基條帶的變化趨勢(shì)出現(xiàn)了區(qū)別。2%濃度下大豆蛋白的亞基條帶的呈現(xiàn)了α（67 kDa）、α′（71 kDa）、β（50 kDa）和A（36 kDa）亞基部分逐漸變淺，B（18 kDa）亞基部分逐漸變深的趨勢(shì)；而5%濃度下大豆蛋白的亞基條帶則呈現(xiàn)出α、α′、β和A亞基部分先變淺后變深，B亞基部分先變深后變淺的趨勢(shì)。同時(shí)在空化射流處理初期，腔體內(nèi)的高溫、高壓力、高剪切力等極端環(huán)境使得分子間和分子內(nèi)的氫鍵斷裂，蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)被破壞，大分子的蛋白骨鏈斷開，形成小分子的蛋白，導(dǎo)致電泳結(jié)果上部的條帶變淺，下部條帶變深[18]。但隨著空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生過處理效應(yīng)導(dǎo)致蛋白分子的疏水性基團(tuán)暴露，在疏水作用力的作用下蛋白亞基重新聚集。較高濃度的蛋白溶液中暴露的疏水基團(tuán)更多，更易重新聚合，使得溶液中的大分子再次增多。因而導(dǎo)致5%濃度條件下的電泳結(jié)果在8 min開始出現(xiàn)上部條帶（＞16 kDa）變深，下部條帶（＜16 kDa）變淺的情況出現(xiàn)。而5%濃度條件下SPI的大分子亞基含量減少程度顯著高于2%濃度，這可能是因?yàn)榭栈淞髯饔糜诟邼舛鹊腟PI溶液時(shí)，同體積空化泡內(nèi)的分子碰撞機(jī)率更大，導(dǎo)致對(duì)蛋白的解聚作用更加明顯[19]。因此，5%蛋白濃度的經(jīng)空化射流處理后70～120 kDa分子量的亞基消失，20 kDa分子量的亞基增多。

2.3 溶液平均粒徑分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的溶液平均粒徑的影響如圖2所示。

由圖2可知，空化射流處理對(duì)不同濃度的SPI粒徑產(chǎn)生了顯著的影響。隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2%的和5%SPI濃度下的蛋白粒徑都是呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)的，且2%、5%的SPI溶液分別在處理為8和6 min時(shí)達(dá)到最低。這可能是由于空化作用后引發(fā)的剪切力和高溫高壓作用將穩(wěn)定蛋白分子的疏水作用力等破壞并將蛋白骨架打散[20]，使得蛋白分子裂解，SPI中7S和11S組分隨之出現(xiàn)了展開現(xiàn)象，從而導(dǎo)致蛋白聚集體更加分散，使其在空間結(jié)構(gòu)上更加疏散[21]，這就導(dǎo)致了蛋白溶液接受空化射流處理后蛋白粒徑的下降。Arzeni等[22]在研究超聲波處理卵清蛋白時(shí)也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象。但是隨著空化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白分子不斷展開，導(dǎo)致其中的疏水性基團(tuán)暴露，同時(shí)由于出現(xiàn)了過處理效應(yīng)，產(chǎn)生的空化泡的振幅最大值增加，空化泡潰滅時(shí)的最高溫度和最大壓力逐漸減小[23]，這就導(dǎo)致蛋白分子聚集[24-25]，于是溶液的平均粒徑在達(dá)到最小值后呈逐漸增大的趨勢(shì)。在各處理時(shí)間內(nèi)5%的蛋白溶液的平均粒徑均高于2%的蛋白樣品，但隨空化處理時(shí)間延長(zhǎng)，在8 min時(shí)2種濃度的溶液平均粒徑差距最大，5%的蛋白溶液比2%的蛋白溶液高了53.79%，這是因?yàn)榭栈淞魈幚磉^程中會(huì)破壞疏水作用力，使得蛋白分子中的疏水基團(tuán)暴露，而5%的蛋白樣品中暴露的疏水基團(tuán)要高于2%的蛋白，因此在過處理以后5%濃度的蛋白樣品中疏水性基團(tuán)間的碰撞概率更高，進(jìn)而導(dǎo)致會(huì)形成更多微小的聚集體，使溶液的平均粒徑增加得更快。

2.4 乳液ζ-電位分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的乳液ζ-電位的影響如圖3所示。

ζ-電位可以表征乳液體系的穩(wěn)定性，其絕對(duì)值的高低和體系的穩(wěn)定性呈正比。由圖3可知，隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2%和5%的SPI下的ζ-電位的變化趨勢(shì)都是先下降后增長(zhǎng)的，且5%濃度下的ζ-電位一直低于2%濃度。2%濃度的SPI在8 min時(shí)達(dá)到最低值-14.11 mV；5%濃度的SPI在6 min時(shí)達(dá)到最低值-17.67 mV。這可能是因?yàn)榭栈淞魑锢韴?chǎng)能通過場(chǎng)能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生舒展，蛋白亞基展開，形成更多的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，進(jìn)而暴露出更多的帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，導(dǎo)致蛋白分子表面的電荷量增多，ζ-電位絕對(duì)值升高[24-26]。同時(shí)由于5%濃度的SPI溶液接受空化處理時(shí)含有的SPI分子較多，分子間碰撞更強(qiáng)，氨基酸殘基暴露更多[27]，所以5%濃度下處理的SPI的ζ-電位一直較低。隨著空化射流處理時(shí)間達(dá)到了一定的限度后，乳液中的蛋白分子因過處理現(xiàn)象又重新聚合，形成一些大的聚集體，這導(dǎo)致一些原本暴露于分子表面帶負(fù)電荷的氨基酸殘基被重新包埋，導(dǎo)致乳液的ζ-電位開始出現(xiàn)增加的趨勢(shì)。這和平均粒徑結(jié)果相一致。

2.5 界面蛋白含量分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的界面蛋白含量的影響如圖4所示。

在乳化體系中，油水界面處吸附的蛋白質(zhì)量是衡量界面活性一個(gè)重要指標(biāo)，它通過影響界面蛋白膜的覆蓋率和厚度來影響乳液的穩(wěn)定性[28]，界面蛋白吸附量主要受蛋白擴(kuò)散能力的影響。由圖4可知，空化射流處理對(duì)不同濃度的SPI的界面蛋白含量產(chǎn)生了顯著的影響。隨空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2%和5%的SPI濃度下的界面蛋白含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且均明顯高于未處理的SPI乳液界面蛋白含量。這表明空化射流處理可以顯著地增加SPI中的界面蛋白含量，但與蛋白濃度和空化射流處理時(shí)間有關(guān)。蛋白質(zhì)在油水界面的吸附具有濃度依賴性，即蛋白質(zhì)濃度越高，吸附量越大[29-30]。所以可以看到，未經(jīng)處理時(shí)5%的SPI濃度相比于2%SPI濃度的界面蛋白含量就更大。隨著空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2%和5%濃度的蛋白乳液的界面蛋白濃度不斷上升。這可能是因?yàn)榭栈淞魈幚硎沟脕喕c亞基之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，改變了SPI的結(jié)構(gòu)，暴露了更多的疏水基團(tuán)[27]，進(jìn)而提高了SPI的表面疏水性，使吸附蛋白間的疏水作用力增加，可以促進(jìn)蛋白與界面的接觸[31]，同時(shí)因?yàn)榭栈轁鐣r(shí)產(chǎn)生的高溫而導(dǎo)致了乳液油滴界面蛋白濃度的增加[12]，這會(huì)導(dǎo)致界面蛋白膜的厚度增大，有利于乳液中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。但是當(dāng)處理時(shí)間到達(dá)6 min時(shí)，5%濃度的蛋白乳液的界面蛋白濃度達(dá)到最大值3.23 mg/m2；2%濃度的蛋白乳液的界面蛋白濃度則在8 min時(shí)達(dá)到最大值3.19 mg/m2。進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間時(shí)，界面蛋白濃度出現(xiàn)輕微下降。這可能與以下2個(gè)原因有關(guān)，一是界面吸附量越大，蛋白在界面上進(jìn)行結(jié)構(gòu)展開的空間越小，結(jié)合新蛋白的機(jī)會(huì)就越小[32]；二是乳液中蛋白聚集體的存在可能會(huì)通過位阻效應(yīng)使吸附在界面處的蛋白濃度降低[33]。電位大小主要取決于液滴界面物質(zhì)所帶電荷的多少，而SPI在其乳液體系中均充當(dāng)乳化劑的作用，經(jīng)剪切乳化和高壓均質(zhì)后吸附于液滴表面，是主要的界面物質(zhì)，因此2種不同濃度的乳液體系的電位也會(huì)受其界面蛋白含量影響，界面蛋白含量越多，乳液電位的絕對(duì)值越大[34]。

2.6 乳液粒徑分布分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的乳液粒徑分布的影響如圖5所示。

乳液粒徑是衡量乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，液滴粒徑越小，乳析速度越慢，乳液就越穩(wěn)定[35]，同時(shí)SPI乳液的粒徑分布還能體現(xiàn)乳液中的蛋白聚集過程。由圖5可知，2種蛋白濃度下未經(jīng)處理的SPI粒徑分布都在10～100μm處有主峰，100～1 000μm處有小峰。經(jīng)空化射流處理后，其粒徑分布發(fā)生變化，100～1 000μm處的小峰消失并在0～10μm處新出現(xiàn)小峰，同時(shí)粒徑分布更加集中。這是因?yàn)榭栈淞魈幚懋a(chǎn)生的空化效應(yīng)如剪切力、沖擊波和微射流等作用，破壞了蛋白質(zhì)分子間的作用力，使得蛋白質(zhì)分子展開，使蛋白中大分子的聚集體解離成小分子，打散了溶液中較大的聚集體[36]，這與聚丙烯酰胺電泳顯示的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。粒徑分布越集中，乳化穩(wěn)定性越強(qiáng)[37]，這也與前文中ζ-電位和后文中的乳化穩(wěn)定性結(jié)論相對(duì)應(yīng)。此外，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，2%蛋白濃度的SPI乳液粒徑明顯降低，體積平均粒徑D4,3從50.12μm減小至31.50μm，而5%蛋白濃度的SPI乳液粒徑呈現(xiàn)先下降然后在6 min后增加的趨勢(shì)。乳液粒徑的下降可能是因?yàn)榭栈淞魈幚懋a(chǎn)生的空化效應(yīng)破壞了蛋白分子間的相互作用，使聚集體解離引起的[38-39]，這與李楊等[40]研究結(jié)論相同。但是空化效應(yīng)的過處理現(xiàn)象也會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)分子的聚集，而使其平均粒徑增加，這就是為何6 min后5%濃度的SPI乳液粒徑呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

2.7 乳液流變學(xué)分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的乳液流變性質(zhì)的影響如圖6所示。

彈性模量（G′）表示待測(cè)樣品在受外力而發(fā)生彈性形變過程中所蓄積的能量，是衡量待測(cè)樣品黏彈性的一種尺度[41]。圖6為2%和5%濃度的SPI分散液及其經(jīng)受不同空化射流處理時(shí)間后的彈性模量（G′）在加熱、保溫及冷卻過程中隨時(shí)間變化的彈性模量。

由圖6可知，不同空化射流時(shí)間下的SPI乳液的彈性模量總體變化趨勢(shì)相同，都是呈現(xiàn)逐步上升且上升越來越快的趨勢(shì)。在初始階段，SPI乳液的彈性模量隨時(shí)間變化非常緩慢。這是因?yàn)榇藭r(shí)維持SPI乳液中蛋白結(jié)構(gòu)的力還較弱，如氫鍵等[42]。隨著溫度的升高，樣品開始發(fā)生部分變性，蛋白質(zhì)分子逐步解折疊，暴露分子內(nèi)部的疏水性殘基，分子間疏水作用力增強(qiáng)，靜電斥力較弱，所以此時(shí)的彈性模量升高不明顯。在保溫過程中，彈性模量開始逐漸升高，這表明，隨著溫度升高，有更多的蛋白和被蛋白包裹的油滴進(jìn)入乳液網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中[43]且SPI分子內(nèi)部肽鏈展開[44-45]，蛋白質(zhì)完全變性。在降溫過程中，樣品彈性模量持續(xù)上升，此時(shí)蛋白質(zhì)分子間的氫鍵、二硫鍵等作用力大于疏水作用力，使展開的肽鏈發(fā)生交聯(lián)形成類似于凝膠網(wǎng)絡(luò)狀的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的骨鏈增大導(dǎo)致其粒徑增大。冷卻至約70 ℃，SPI乳液的彈性模量顯著遞增，說明此時(shí)乳液中可能開始形成凝膠。即未經(jīng)處理的SPI表現(xiàn)出更具黏性的流體性質(zhì)，而經(jīng)過空化射流處理的SPI表現(xiàn)出更具彈性的類固體性質(zhì)。同時(shí)我們可以看出，彈性模量的變化還與ESI、EAI呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)[46]。

同時(shí)我們還可以從圖中看出，接受不同空化射流處理時(shí)間的2%和5%濃度SPI乳液在同一時(shí)間的彈性模量均呈現(xiàn)高于未經(jīng)空化射流處理的特征，且均呈現(xiàn)隨空化射流處理時(shí)間的增加而先上升后下降的趨勢(shì)，2%濃度在8 min達(dá)到最大值，5%濃度在6 min達(dá)到最大值。這一變化趨勢(shì)符合我們?cè)谄渌笜?biāo)中看到的變化規(guī)律。空化射流處理初期，SPI乳液的彈性模量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，這可能是因?yàn)槌跏嫉目栈饔幂^弱，分子間的交聯(lián)能力較差，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間交聯(lián)能力逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致彈性模量增加。而隨著空化處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)彈性模量開始出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這主要是由于當(dāng)空化射流作用達(dá)到飽和后，過高的空化壓力和時(shí)間導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成少量不溶性聚集體，降低了蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)，導(dǎo)致了彈性模量的降低。還有一部分原因是由于過處理也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的7S組分增多，7S組分為球狀蛋白質(zhì)，吸附至界面展開所需的能量較大，所以吸附速度較慢[47]，導(dǎo)致出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)出現(xiàn)。同時(shí)Baldursdottir等[48]指出，球狀蛋白質(zhì)會(huì)在界面處展開和結(jié)構(gòu)重排。而G′的增加有可能是界面處的蛋白質(zhì)分子通過疏水相互作用建立網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，也可能是多層吸附結(jié)構(gòu)的形成[49]。此外，據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)分子間相互作用和交聯(lián)是在部分展開時(shí)建立的，這也會(huì)導(dǎo)致G′增加[50]。

2.8 乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析

空化射流對(duì)2%和5%濃度大豆分離蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響如圖7所示。

由圖7可知，SPI樣品的乳化活性及乳化穩(wěn)定性受到了空化射流處理的影響，產(chǎn)生了顯著的變化（P＜0.05）。其中2%濃度的SPI樣品的乳化活性及乳化穩(wěn)定性的變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在處理8 min時(shí)分別達(dá)到71.01 m2/g和168.75 min，較最低值分別提升248.94%和95.58%；5%濃度的SPI樣品的乳化活性及乳化穩(wěn)定性隨空化處理時(shí)間增加而呈現(xiàn)先升高再降低而后又升高的規(guī)律，雖然中間出現(xiàn)了一定的波動(dòng)，但是整體呈上升趨勢(shì)，在處理10 min時(shí)分別達(dá)到52.91 m2/g和126.97 min，較最低值分別提升70.29%和101.83%。

濃度為2%的蛋白樣品乳化活性及乳化穩(wěn)定性一開始呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，這是因?yàn)榭栈淞魈幚砗髽悠分械膩喕饩?，蛋白質(zhì)分子伸展，分子內(nèi)部基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子趨于無序，剛性結(jié)構(gòu)減弱柔性結(jié)構(gòu)增加，同時(shí)由于11S組分展開，形成了更多的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)分散到油-水界面因此使得樣品的乳化活性有顯著提高[14]。而在空化處理后期，蛋白樣品的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均有下降，這可能是因?yàn)樵诳栈幚砗笃冢谶^高的壓力和高速?zèng)_擊波作用下，分子間疏水相互作用、二硫鍵、靜電相互作用及氫鍵等作用力會(huì)使其發(fā)生聚集產(chǎn)生不溶性聚集體，導(dǎo)致乳化活性降低。同時(shí)，在高速剪切機(jī)械作用與熱效應(yīng)的雙重影響下，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，也會(huì)導(dǎo)致其乳化活性下降。乳化穩(wěn)定性的下降則是因?yàn)榭栈幚砗笃谑菇饩鄣膩喕约靶》肿拥鞍装l(fā)生了聚集，而聚集后構(gòu)象穩(wěn)定性增強(qiáng)，不易快速在油-水界面上穩(wěn)定，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性降低[51]。

5%濃度的SPI的乳化活性及乳化穩(wěn)定性隨空化射流時(shí)間的變化，可能是由于空化射流處理初期，空化腔內(nèi)的局部極端熱導(dǎo)致SPI先發(fā)生聚集，隨后在空化效應(yīng)和高速機(jī)械剪切作用下蛋白質(zhì)分子逐漸伸展，聚集體發(fā)生解聚，分子內(nèi)部基團(tuán)暴露，在乳化過程中有更多的小分子聚集在油水界面上，因此使得樣品的乳化活性呈現(xiàn)出先升高再降低而后又升高的規(guī)律[14]。而經(jīng)空化射流處理后乳化穩(wěn)定性的明顯增加可能是因?yàn)殡S著空化射流時(shí)間的延長(zhǎng)，空化效應(yīng)和剪切效應(yīng)使得蛋白質(zhì)分子中的疏水性基團(tuán)逐漸暴露出來，導(dǎo)致蛋白液滴的比表面積增加，加強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與油滴間的吸引作用，使蛋白質(zhì)分子的體積減小，降低了分子的沉降速率，從而增加了蛋白溶液的乳化穩(wěn)定性[52]。

當(dāng)乳化活性增加時(shí)，意味著乳化體系中粒子間的作用較強(qiáng)，發(fā)生了一定的交聯(lián)作用[53]，這也導(dǎo)致了流變學(xué)測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)SPI體系中是彈性成分占較大優(yōu)勢(shì)。同時(shí)可以看出，2%濃度的SPI的乳化活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都是高于5%濃度的。這是因?yàn)樵诘偷鞍诐舛鹊那闆r下，空化作用會(huì)破壞SPI結(jié)構(gòu)，致使蛋白中的親水基團(tuán)愈發(fā)親水，疏水基團(tuán)愈發(fā)疏水，從而使得乳狀液的穩(wěn)定性有所增加；當(dāng)?shù)鞍诐舛仍龃髸r(shí)，空化作用對(duì)SPI分子結(jié)構(gòu)的作用會(huì)變小，導(dǎo)致SPI的乳化活性也逐漸減小[54]。

3 結(jié) 論

1）空化射流處理2%濃度SPI能有效提高其乳化活性及乳化穩(wěn)定性。當(dāng)處理時(shí)間為8 min時(shí)，乳化活性為71.01 m2/g，乳化穩(wěn)定性為168.75 min，較最低值分別提升248.94%和95.58%。同時(shí)ζ電位絕對(duì)值達(dá)到最大值為-14.11 mV，界面蛋白含量達(dá)到最大值為3.19 mg/m2，且粒徑最小。說明此時(shí)大豆分離蛋白分布均勻，最為穩(wěn)定，有利于提高其乳化活性。

2）5%濃度SPI空化射流處理10 min時(shí)，乳化活性為52.91 m2/g，乳化穩(wěn)定性為126.97 min，較最低值分別提升70.29%和101.83%。但ζ-電位絕對(duì)值、界面蛋白含量已經(jīng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。說明此時(shí)大豆分離蛋白雖然乳化性能還維持在較好水平，但是已經(jīng)出現(xiàn)過處理現(xiàn)象。

3）空化射流處理2種濃度的大豆分離蛋白都可以使部分亞基解聚，降低含硫氨基酸的含量。同時(shí)空化效應(yīng)使蛋白質(zhì)分子展開，暴露更多的疏水性氨基酸，提高其流變性能。且SPI濃度為5%時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)相比2%時(shí)都更易達(dá)到極值。

本研究對(duì)大豆工業(yè)化利用及提升大豆蛋白加工技術(shù)具有重要的理論及實(shí)踐價(jià)值，而且對(duì)研發(fā)新型大豆蛋白飲料、蛋白生物凝膠等具有重要的科學(xué)意義。