丁麗君，巫秀美，張成桂，高鵬飛，嚴(yán)靖婷，楊自忠* ，趙 昱*

（1. 大理大學(xué) 昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院，云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000；2. 大理大學(xué) 昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院，藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000；3. 大理大學(xué) 藥用昆蟲(chóng)及蛛形類生物資源數(shù)字化開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南 大理 671000；4. 云南省科學(xué)技術(shù)院，云南 昆明 650100）

蜘蛛入藥已有幾千年的歷史，在諸多古代醫(yī)學(xué)著作中都有記載，部分種類傳承沿用至今?！侗静菥V目》記述“蜘蛛，微寒，有小毒”；《本草經(jīng)集注》：“蜂及蜈蚣螫人，取置肉上，則能吸毒。又以斷瘧及干嘔、霍亂”；《千金方》：“蜘蛛杵爛，醋和。先挑瘡四畔令出血，根稍露，用藥敷，干即易”[1]?？伸铒L(fēng)鎮(zhèn)驚，破瘀散結(jié)，解毒消腫。主治中風(fēng)口歪、小兒驚風(fēng)、疳積、喉風(fēng)腫閉、疝氣偏墜、瘰疬、痔漏、癰腫疔瘡、頑癬、蟲(chóng)蛇咬傷。在近年研究中發(fā)現(xiàn)蜘蛛毒液在粗毒及單體水平上也具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗癌等良好的生物活性[2]，及高活力、結(jié)構(gòu)多樣、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，引起了廣泛關(guān)注。

有毒動(dòng)物的毒液是自然界捕食—被捕食相互作用關(guān)系中進(jìn)攻與防御生存策略演化的杰作。在捕食—被捕食長(zhǎng)期博弈的共進(jìn)化過(guò)程中，產(chǎn)毒動(dòng)物形成了巨大的動(dòng)物毒素分子多樣性[3]；這些毒素分子往往作用于目標(biāo)生物體關(guān)鍵生理蛋白質(zhì)元件，如細(xì)胞膜受體和離子通道等，即動(dòng)物蛋白多肽毒素的高活性、強(qiáng)專一性（可有效區(qū)分不同的膜受體和離子通道亞型）以及巨大的分子多樣性[4]。蜘蛛擁有生態(tài)多樣性的大集團(tuán)[5]，作為新藥來(lái)源具有巨大潛力，代表了一個(gè)巨大的潛在候選藥物庫(kù)。本研究就國(guó)內(nèi)外近年蛛毒鎮(zhèn)痛、抗菌等生物活性的研究進(jìn)行綜述。

1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)與蛛毒研究

1.1 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象是特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA 的總和，轉(zhuǎn)錄組de novo 測(cè)序是指在不需要物種基因組序列信息的情況下，用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序、組裝得到轉(zhuǎn)錄本序列信息。使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，僅需少量毒腺樣本即可預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄水平上毒素的表達(dá)情況。通過(guò)將樣本中提取的總體 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后進(jìn)行高通量測(cè)序，再用生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)確定樣品中整體轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況。

傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)是基于雜交技術(shù)的cDNA 芯片和寡聚核酸芯片法以及基于Sanger 測(cè)序的SAGE （Serial analysis of gene expression）和MPSS （Massively parallel signature sequencing）、全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)、EST 文庫(kù)等方法，但這兩種技術(shù)存在一定的缺陷。雜交技術(shù)靈敏度有限，對(duì)于低豐度的mRNA，微陣列技術(shù)難以檢測(cè)，也無(wú)法捕獲到目的基因mRNA 表達(dá)水平的微小變化。Sanger 測(cè)序法的通量較低，不能滿足大批量測(cè)序的要求。相比于雜交技術(shù)和 Sanger 測(cè)序技術(shù)，二代測(cè)序技術(shù)具有更高測(cè)序通量、更長(zhǎng)測(cè)序片段、更短運(yùn)行時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，目前將運(yùn)用第二代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組分析稱為 RNA-Seq[6-7]。二代測(cè)序平臺(tái)主要包括454 Life Sciences 公司推出的454 測(cè)序技術(shù)、Illumina公司和 ABI 公司相繼推出的Solexa 和SOLID 測(cè)序技術(shù)等，其中454 測(cè)序技術(shù)平臺(tái)最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。在過(guò)去10 年間，Illumina 公司的Solexa 技術(shù)，即邊合成邊測(cè)序 （Sequencing by synthesis，SBS） 技術(shù)發(fā)展迅速，其 HiSeq 系列的測(cè)序平臺(tái)逐漸成為二代測(cè)序技術(shù)中最被廣泛應(yīng)用的平臺(tái)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在蜘蛛毒液研究中的作用

毒液成分的多樣性、巨大的動(dòng)態(tài)范圍，及其它物理化學(xué)參數(shù)解釋了為什么很多的毒液成分目前還未被發(fā)現(xiàn)。蜘蛛個(gè)體小、分泌毒液量少而且在野外環(huán)境中采集困難，毒液成分復(fù)雜、蛋白多肽分離困難，不可能在個(gè)體或只是粗毒水平上進(jìn)行深入的研究。因此，構(gòu)建毒腺cDNA 文庫(kù)，通過(guò)分子生物學(xué)手段獲得毒腺內(nèi)表達(dá)的毒素分子序列信息，對(duì)其進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，為毒液成分生理活性研究奠定基礎(chǔ)。直到十年前，大多數(shù)毒素都是在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行測(cè)序，現(xiàn)在大多數(shù)報(bào)告出的毒素序列都是由mRNA 或cDNA 測(cè)序產(chǎn)生的，這為以前難以獲得的信息打開(kāi)了大門(mén)。但是，多肽活性往往是通過(guò)同源序列搜索推斷的，并沒(méi)有進(jìn)行體外或體內(nèi)試驗(yàn)的驗(yàn)證，因此神經(jīng)毒素的靶點(diǎn)特異性僅通過(guò)轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行預(yù)測(cè)并不完全可信。最后，通過(guò)分離鑒定獲得毒素單體時(shí)，用膜片鉗技術(shù)對(duì)靶點(diǎn)特異性和效力進(jìn)行研究，很多毒素在毫微摩爾濃度下就有作用效果。然而，毒性作用還取決于獵物的類型、神經(jīng)毒素對(duì)特定通道的特異性以及獵物所表達(dá)的受體[8-9]。

主要技術(shù)流程為提取毒腺總RNA，利用帶有Oligo （dT） 的磁珠與ployA 進(jìn)行A-T 堿基配對(duì)結(jié)合來(lái)分離出mRNA，將mRNA 隨機(jī)斷裂成200 bp 左右的小片段，以 mRNA 為模板合成 cDNA，將合成的cDNA 雙鏈進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭，然后 PCR 擴(kuò)增制備得到文庫(kù)，最后將文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。獲得的短讀 （reads） 使用Trinity 重新組裝，然后用Trinotate 執(zhí)行自動(dòng)轉(zhuǎn)錄組的功能注釋，通過(guò)已知序列進(jìn)行同源性搜索，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域識(shí)別，信號(hào)肽和跨膜域預(yù)測(cè)，并利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋 （Uniprot/NR/KEGG/GO/COG）[10-11]。通過(guò)序列同源性及已知毒素序列結(jié)構(gòu)特征尋找可能表達(dá)毒素的序列，預(yù)測(cè)其前體肽、信號(hào)肽、分子量并進(jìn)行蛋白質(zhì)家族分析。

2 蛛毒中神經(jīng)毒素多樣性

2.1 神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)

蜘蛛毒液由螯肢內(nèi)的毒腺生產(chǎn)和儲(chǔ)存，蜘蛛毒液成分通?？煞譃樗念悾盒》肿踊衔铮ǘ喟?、無(wú)機(jī)鹽等）、抗菌肽（只有少數(shù)種類具有）、神經(jīng)毒素、蛋白質(zhì)和酶[12]。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，蜘蛛入藥經(jīng)常用于治療風(fēng)濕痛以及中風(fēng)、癲癇、面癱等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)與各類離子通道有著密切的聯(lián)系。蜘蛛毒素具有作用離子通道的高活性、強(qiáng)專一性，代表一類潛在的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物候選庫(kù)。富含半胱氨酸的神經(jīng)毒素是毒液成分中極具研究?jī)r(jià)值的部分，存在于大多數(shù)蜘蛛毒液[13]。

蜘蛛毒液通常含有幾十種不同的富含半胱氨酸的肽，通常分子量在3 ～ 9 kDa 之間，含有3 對(duì)或者更多二硫鍵。由于二硫鍵配對(duì)方式不同而形成不同的結(jié)構(gòu)模體。抑制劑胱氨酸結(jié) （Inhibitor cystine knot,ICK） 采用C1-C4、C2-C5、C3-C6 的二硫鍵配對(duì)方式，其中C1-C4、C2-C5 兩對(duì)二硫鍵以及中間的肽鏈形成一個(gè)大環(huán)，而C3-C6 二硫鍵從環(huán)中穿過(guò)使得在空間上形成一個(gè)類似于“結(jié)”的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這種胱氨酸結(jié)構(gòu)通常被稱為胱氨酸結(jié)[14]。二硫鍵定向β-發(fā)夾結(jié)構(gòu) （Disulphide-directed beta-hairpin, DDH），雖然沒(méi)有形成胱氨酸結(jié)，但包含兩對(duì)強(qiáng)制性二硫鍵穩(wěn)定的反平行發(fā)夾；Kunitz 型結(jié)構(gòu)中六個(gè)高度保守的半胱氨酸以C1-C6、C2-C4、C3-C5 的方式形成三對(duì)二硫鍵。許多肽以ICK 為核心基序，但含有其它的半胱氨酸。一個(gè)常見(jiàn)的變化是在簡(jiǎn)單ICK 基序的C5 和C6 之間的β-發(fā)夾的回路中包含了第四個(gè)二硫化物橋[15]。

2.2 毒素作用特異性

在ArachnoServer 數(shù)據(jù)庫(kù)中，約46% 通過(guò)延遲不同亞型的電壓激活鈉通道 （NaV） 的失活 （如：δ-ctenitoxin-pn2c, O76199）， 抑 制 其 開(kāi) 放 （ 如：μ-theraphotoxin-Hs2a_1, P83303），或改變其潛在的激 活 極 限 （ 如：β-theraphotoxin-Cm1a, P84507）。約37% 抑制電壓門(mén)控鈣通道 （如：ω-ctenitoxin-Cs1a, P81694），15%抑制電壓門(mén)控鉀通道 （KV，如：kunitz 型κ-PI-theraphotoxin-Hs1a, P68425）。其它靶點(diǎn)包括酸敏感離子通道 （如：π-theraphotoxin-Pc1a、P60514），天冬氨酸-谷氨酸受體 （如：γ-ctenitoxin-Pn1a、P59367），鈣激活鉀通道 （如：κ-hexatoxin-Hv1e[sic]、S0F1M9） 和瞬時(shí)受體電位 （TRP） 通道 （如：τ-theraphotoxin-Gr1a、M5AXK5）[16]。

毒素的作用不一定局限于一種通道 （β/κ-theraphotoxin-Hlv1a, B3EWN3；μ/ω-theraphotoxin-Hs1a, B3FIR8），還可興奮細(xì)胞膜上的離子通道負(fù)責(zé)適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。鈣通道參與突觸前細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)，電壓門(mén)控鈉通道使動(dòng)作電位沿著可興奮細(xì)胞傳遞，電壓門(mén)控鉀通道對(duì)恢復(fù)去極化細(xì)胞的靜息狀態(tài)至關(guān)重要。通道功能的中斷（如：通過(guò)抑制或通過(guò)毒素非自然激活）可能影響運(yùn)動(dòng)、呼吸和心臟功能，導(dǎo)致包括抽搐、癱瘓?jiān)趦?nèi)的各種癥狀。

3 蛛毒具有鎮(zhèn)痛活性

3.1 蛛毒作為鈉離子通道調(diào)節(jié)劑

由于電壓門(mén)控鈉離子通道 （NaV） 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、平滑肌和骨骼肌的動(dòng)作電位發(fā)生和傳播中起主要作用，參與運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)過(guò)程。因此，NaV通道功能至關(guān)重要，是多種毒素的靶點(diǎn)，可與至少6 個(gè)特定的通道受體位點(diǎn)相互作用。調(diào)節(jié)離子通道的毒素可能的影響有以下三種中的一種或多種：激活、使失活和對(duì)離子通道的選擇性。這使鈉離子通道成為動(dòng)物神經(jīng)毒素的主要作用位點(diǎn)，以使獵物盡快麻痹或致死。有9 種哺乳動(dòng)物亞型，被稱為NaV1.1-NaV1.9，幾項(xiàng)顯著的遺傳研究結(jié)果證明了人類NaV1.7 （hNaV1.7） 作為鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的有效性，且蜘蛛毒素的結(jié)構(gòu)特征對(duì)多數(shù)疼痛模型都有良好的作用[17-18]。

Davus fasciatus毒液中發(fā)現(xiàn)了一種名為μ-TRTXDf1a 的強(qiáng)效NaV抑制劑，電生理實(shí)驗(yàn)顯示Df1a 抑制所有NaV亞型 （hNaV1.1- hNaV1.7）。Df1a 還可減緩NaV1.1、NaV1.3 和NaV1.5 的快速失活，并調(diào)節(jié)大多數(shù)NaV亞型的激活和失活的電壓依賴性，可逆轉(zhuǎn)NaV激活劑OD1（一種增強(qiáng)hNaV1.7 的蝎子毒素）誘導(dǎo)的疼痛[19]；Ornithoctonus hainana毒液中分離的HNTX-III 是一種對(duì)NaV具有相似選擇性的抑制劑，對(duì)NaV1.7、NaV1.2 和NaV1.3 具有相似的選擇性，但對(duì)NaV1.4 和NaV1.5 沒(méi)有選擇性。在完整的弗氏佐劑模型和炎癥性疼痛福爾馬林模型中，HNTX-III 可逆轉(zhuǎn)與嗎啡相當(dāng)效力的痛覺(jué)過(guò)敏。在非神經(jīng)損傷的疼痛模型中，HNTX-III 與美西律相比抑制了痛覺(jué)且不會(huì)引起運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)的損害[20]。μ-TRTX-Hhn1b （HNTXIV） 能有效逆轉(zhuǎn)腹縮模型的急性傷害性疼痛，并顯著降低福爾馬林模型疼痛評(píng)分，μ-TRTX-Hhn1b 在兩種模型上的效率均與嗎啡相當(dāng)。在脊神經(jīng)模型中，μ-TRTX-Hhn1b 對(duì)觸痛的逆轉(zhuǎn)作用比美西律更長(zhǎng)、更高[21]。蜘蛛毒素在以上模型中的良好作用效果證明了其作為鎮(zhèn)痛藥物開(kāi)發(fā)的潛力。

在天然蜘蛛毒素基礎(chǔ)上進(jìn)行多肽修飾，改變其特定位點(diǎn)氨基酸或疏水性等可增強(qiáng)對(duì)鈉離子通道的抑制作用。Ornithoctonus hainana毒液中分離出的μ-TRTX-Hhn2b （HNTX-I），在哺乳動(dòng)物鈉離子通道（包括hNaV1.7）表現(xiàn)微弱的活性，用天冬酰胺取代S23或用天冬氨酸取代H26，對(duì)抗hNaV1.7 的活性增強(qiáng)。此外，多個(gè)位點(diǎn)突變結(jié)合可提高效力，與原HNTX-1在hNaV1.7［IC50= （0.036 ± 0.007） μM］ 的作用相比，生成的模擬E1G-N23S-D26H-L32W 提高了300 倍效能[22]。結(jié)構(gòu)模擬表明，修飾肽的荷電表面和疏水表面可提高與hNaV1.7 的親和力，而可變氨基酸殘基可能決定藥理作用特異性，為針對(duì)hNaV1.7 通道的藥物設(shè)計(jì)提供了思路。

μ-TRTX-Tp1a （Tp1a） 來(lái)自Thrixopelma pruriens蜘蛛毒液，是一種NaV1.7 抑制劑。重組合成的由33個(gè)氨基酸組成的多肽對(duì)NaV1.7 作用選擇性較強(qiáng)，與天然酰胺化形式 （IC50= 2.1 nM） 相比，Tp1a 的C 端酸形式對(duì)NaV1.7 抑制率降低 （IC50= 11.5 nM）、締合率降低，表明C 端與hNaV1.7 相互作用。與大多數(shù)可調(diào)節(jié)NaV通道的蜘蛛毒素不同，Tp1a 抑制了hNaV1.7，但沒(méi)有顯著改變其激活或失活的電壓依賴性。Tp1a 通過(guò)逆轉(zhuǎn)小鼠足底注射OD1 引起的自發(fā)性疼痛而被證明具有鎮(zhèn)痛作用[23]，因此，Tp1a 結(jié)構(gòu)可能有助于指導(dǎo)改進(jìn)NaV1.7 抑制劑的開(kāi)發(fā)。

從Pamphobeteus nigricolor毒液中分離出的μ-phraphotoxin-Pn3a （Pn3a），與其它對(duì)NaV亞型相比，對(duì)NaV1.7 的選擇性提高了40 倍～ 1 000 倍。盡管在小直徑背根神經(jīng)節(jié)、脊髓切片和NaV1.7 激活引起的疼痛小鼠模型中有活性，但Pn3a 單獨(dú)在福爾馬林、卡拉膠或弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的嚙齒動(dòng)物疼痛模型中沒(méi)有鎮(zhèn)痛活性。然而，當(dāng)聯(lián)合使用亞治療劑量的阿片類藥物（羥考酮或丁丙諾啡）或腦啡肽酶抑制劑時(shí)，這些選擇性NaV1.7 抑制劑產(chǎn)生了強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用[24]。設(shè)計(jì)出17 個(gè)Pn3a 類似物，利用膜片鉗電生理學(xué)方法測(cè)定其在hNaV1.7 位點(diǎn)的活性。帶正電荷的氨基酸K22和K24被確認(rèn)為Pn3a 活性的關(guān)鍵氨基酸，而疏水殘基Y4、Y27和W30的去除會(huì)導(dǎo)致效能的喪失，而帶負(fù)電荷的D1和D8殘基被帶正電荷的賴氨酸取代導(dǎo)致效能的增加（＞13 倍）。將D8突變?yōu)樘於０房墒筆n3a 在NaV1.7 的效力得到最大的改善（20 倍），同時(shí)保持對(duì)主要目標(biāo)NaV1.4、NaV1.5 和NaV1.6 >100 倍的選擇性。突變體Pn3a [D8N]在體內(nèi)保留了鎮(zhèn)痛活性，在臨床相關(guān)的術(shù)后疼痛小鼠模型中，劑量比原Pn3a 低3 倍即可顯著減輕機(jī)械觸痛且不引起運(yùn)動(dòng)不良反應(yīng)[25]。為合理設(shè)計(jì)強(qiáng)效、選擇性的多肽NaV1.7 抑制劑，以開(kāi)發(fā)更有效、更安全的鎮(zhèn)痛藥物，并進(jìn)一步研究NaV1.7 在疼痛中的作用提供了基礎(chǔ)。

來(lái)自Glammostola Portori蜘蛛毒液的GpTx-1在NaV1.7 （IC50= 10 nM） 上表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，C端的W29、K31和F34殘基是對(duì)NaV1.7 拮抗作用的關(guān)鍵。GpTx-1 在局部給藥時(shí)顯著減少OD1 誘導(dǎo)的疼痛行為，但在系統(tǒng)給藥時(shí)缺乏療效?？赡苁怯捎谧畲竽褪苋韯┝?（0.1 mg/kg） 在后爪周圍神經(jīng)末梢沒(méi)有達(dá)到足夠高的濃度對(duì)NaV1.7 進(jìn)行抑制[26-27]。對(duì)NaV1.7 （IC50= 10 nM） 的選擇性比對(duì)NaV1.4 和NaV1.5 的選擇性分別高20 倍和1 000 倍。用A 取代F5，對(duì)NaV1.4 提高300 倍的選擇性。最終設(shè)計(jì)出的 [A5, F6, L26, R28] GpTx-1 （IC50= 1.6 nM），其對(duì)NaV1.4 和NaV1.5 的選擇性提高了1 000 倍[27]。疏水殘基的數(shù)量和類型以及它們?cè)诒砻娴某尸F(xiàn)方式?jīng)Q定了GpTx-1 對(duì)膜的親和力，改變這些殘基可以對(duì)抑制NaV的活性產(chǎn)生顯著影響[28]。結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系研究為實(shí)現(xiàn)對(duì)NaV1.7 的高效和選擇性提供了可能。

3.2 鈣離子通道調(diào)節(jié)劑

電壓門(mén)控鈣通道 （CaV） 存在于突觸前神經(jīng)末端，通過(guò)激活CaV通道使鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，直接影響膜電位，促進(jìn)電興奮性、重復(fù)放電模式、興奮-收縮耦合和基因表達(dá)，是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成成分。天然鈣通道一般分為6 種亞型 （T-、L-、N-、P-、Q-和R-），是根據(jù)它們的電生理性質(zhì)和對(duì)各種激活、拮抗劑和離子的敏感性來(lái)歸類的[29]。它們存在于疼痛調(diào)節(jié)區(qū)，如脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和腦干，表明這些類型的CaV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛相關(guān)信息的處理中起著至關(guān)重要的作用。

Phα1β 是Phoneutria nigriventer毒液分離純化的多肽，選擇性地抑制TRPA1 激動(dòng)劑異硫氰酸烯丙酯（AITC） 對(duì)人胚腎293 細(xì)胞、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的鈣反應(yīng)和電流。鞘內(nèi)或足底給藥低劑量的Phα1β 即可減輕急性痛覺(jué)和由AITC 引起的機(jī)械疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏，對(duì)辣椒素或低滲溶液產(chǎn)生的疼痛反應(yīng)無(wú)效。值得注意的是，Phα1β 可減輕硼替佐米誘導(dǎo)的TRPA1 依賴性神經(jīng)性疼痛反應(yīng)[30]。其重組形式CTK 01512-2 基于阻斷CaV2.2 （N 型），減少神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸在脊髓背角的釋放。這些肽在大鼠不同疼痛模型中表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用，且Phα1β 和CTK01512-2 劑量高于鎮(zhèn)痛劑量下，具有良好的安全性[31-32]。

Tx3-3 是一種從Phoneutria nigriventer毒液中分離出來(lái)的另一種多肽毒素，它優(yōu)先抑制P/Q 和R 型鈣通道。在神經(jīng)病理性疼痛模型中，Tx3-3 顯示出持久的鎮(zhèn)痛作用。鞘內(nèi)注射Tx3-3 可降低小鼠坐骨神經(jīng)損傷產(chǎn)生的機(jī)械性痛覺(jué)和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的小鼠和大鼠的痛覺(jué)，但對(duì)炎癥性疼痛無(wú)效，有望作為一種新的治療藥物來(lái)控制神經(jīng)病理性疼痛[33]。

3.3 與其它鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)作用

P2XRs 是ATP 門(mén)控非選擇性陽(yáng)離子通道，包含七個(gè)嘌呤受體亞基，分別為P2X1-P2X7。藥理學(xué)研究表明P2X3Rs 參與急性疼痛、炎癥性疼痛、慢性神經(jīng)病理性疼痛、內(nèi)臟疼痛、偏頭痛和癌癥疼痛[34]。

哺乳動(dòng)物感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)的P2X3 嘌呤受體在包括痛覺(jué)的多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從蜘蛛Geolycosa sp.的毒液中分離出了一種肽，命名為Purotoxin-1 （PT1），這是我們所知的第一個(gè)對(duì)P2X3受體產(chǎn)生強(qiáng)選擇性抑制作用的天然分子。PT1 顯著減緩了這些受體脫敏的去除[35]。該肽在炎癥性疼痛的動(dòng)物模型中顯示出強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，代表了開(kāi)發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物的一個(gè)非常有吸引力的分子基序。

δ-Ctenitoxin-Pn1a （δ-CNTX-Pn1a） 來(lái)自巴西流浪蜘蛛Phoneutria nigriventer毒液，在炎癥性疼痛模型、神經(jīng)性疼痛模型及在前列腺素E2 誘導(dǎo)的急性疼痛模型中，都有良好的鎮(zhèn)痛作用。δ-CNTX-Pn1a 的鎮(zhèn)痛作用既通過(guò)CB1 受體涉及到大麻素系統(tǒng)，也通過(guò)δ 受體涉及到阿片系統(tǒng)[36]，為鎮(zhèn)痛藥物的設(shè)計(jì)提供了方向。目前已發(fā)現(xiàn)大量具有鎮(zhèn)痛活性的蜘蛛毒素，在此基礎(chǔ)上需要更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)—功能研究來(lái)促進(jìn)新型鎮(zhèn)痛藥物的開(kāi)發(fā)。

4 蛛毒的抗菌活性

抗菌肽 （AMPs） 也被稱為溶細(xì)胞肽或陽(yáng)離子肽。AMPs 通常具有較高正電荷和大量疏水氨基酸。它們作為動(dòng)物免疫系統(tǒng)的主要成分廣泛分布，也存在于各種節(jié)肢動(dòng)物毒液中，如：螞蟻、蝎子、蜜蜂和黃蜂[37]。AMP 可破壞細(xì)胞膜的完整性，因?yàn)樗鼈儙д姾傻陌被醾?cè)鏈與帶負(fù)電荷的磷脂或其它帶負(fù)電荷的表面分子的頭部基團(tuán)相互作用被吸引到細(xì)胞膜表面。在膜附近，AMPs 表現(xiàn)出兩親α 螺旋結(jié)構(gòu)，這種兩親性結(jié)構(gòu)有助于AMPs 插入細(xì)胞膜。α-螺旋帶正電荷的部分與帶負(fù)電荷的磷脂頭部基團(tuán)相互作用，α-螺旋的疏水部分與磷脂尾部相互作用[13]。到目前為止，AMPs 只在Cupiennius Salei蜘蛛的毒液和Zodariidae、Lycosidae和Oxyopidae毒液中發(fā)現(xiàn)[8]。

從穴居狼蛛Lycosa singoriensis的毒液中分離出的一種肽 lycosin-I 是一種有效的念珠菌的抑制劑。lycosin-I 的MIC50值可達(dá)到8 μg/mL。試驗(yàn)顯示，lycosin-I 在2 h 內(nèi)減少約70%的菌落形成單位。此外，lycosin-I 在高濃度Mg2+下仍能保持其強(qiáng)大的抗真菌能力。當(dāng)lycosin-I 的濃度從1 MIC 增加到8 MIC 時(shí)，無(wú)論是氟康唑敏感型，還是耐藥型熱帶念珠菌，其生物膜代謝活性均明顯下降。生物膜抑制濃度 （BIC50） 和生物膜根除濃度 （BEC50） 分別約為32 μg/mL 和128 μg/mL。研究表明，lycosin-I 是一種高效、耐鹽、抗生物膜性能強(qiáng)的有效真菌抑制劑[38]；分離并鑒定出的另一種抗菌肽lycosin-II，具有典型的線性兩親性和陽(yáng)離子的α-螺旋構(gòu)象，對(duì)從患者體內(nèi)分離出來(lái)的耐藥菌—給感染治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)的多重耐藥的鮑曼氏菌顯示出強(qiáng)大的抑菌作用。lycosin-II 的抑制能力可能來(lái)源于其與細(xì)胞膜的結(jié)合，因?yàn)镸g2+可以通過(guò)與結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)降低其抑菌力[39]。數(shù)據(jù)表明Lycosin-II 可能是治療耐藥細(xì)菌感染的新型抗生素開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)。

從Ornithoctonus hainana毒液分離純化出的Ohdefensin 抗菌肽，與其它節(jié)肢動(dòng)物抗菌肽具有顯著的序列相似性，對(duì)包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌在內(nèi)的微生物具有抗菌活性，MIC 低至1.25 μg/mL[40]；Acanthoscurria gomesiana毒液中發(fā)現(xiàn)的新肽U1-TRTX-Agm1a 與Acanthoscurria paulensis中U1-TRTX-Ap1a 僅存在一個(gè)氨基酸差異，對(duì)大腸桿菌、陰溝腸桿菌和白色念珠菌菌株具有良好活性[41]；從Vitalius dubius毒液中分離出的VDTX-I，對(duì)14種微生物（包括真菌、酵母菌和細(xì)菌）進(jìn)行了抗菌試驗(yàn)，在白色念珠菌，吉耳菌，黃體小球菌和大腸桿菌中，3.12 ～ 100 μM 時(shí)有劑量反應(yīng)。VDTX-I 約5 min 即可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，比鏈霉素作用更快[42]；來(lái)自Lachesana tarabaevi蜘蛛毒液的抗菌肽Latcarin 2a （LTC 2a） 具有廣譜抗菌活性，化學(xué)合成和重組的LTC 2a 對(duì)抑制革蘭氏陽(yáng)性枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性大腸桿菌等目標(biāo)菌株生長(zhǎng)能力同等有效[43]；Lasiodora sp.粗毒對(duì)細(xì)菌中的氣單胞菌、枯草芽孢桿菌和黃體微球菌均有殺滅作用，對(duì)真菌中假絲酵母菌和白色念珠菌均有殺滅作用，對(duì)肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及熱帶念珠菌和克魯氏念珠菌均有抑菌作用。最低抑菌濃度 （MIC）、最低殺細(xì)菌濃度 （MBC） 和最低殺真菌濃度 （MFC） 為3.9 ～ 500 μg/mL[44]；U1-SCRTX-Lg1a 來(lái)自Loxosceles sp.毒液，對(duì)革蘭氏陰性菌有活性，該肽的序列與Loxosceles中多個(gè)物種的磷脂酶D 區(qū)域非常相似[45]。研究數(shù)據(jù)表明諸多蜘蛛毒素有著良好的抗菌效果，作為抗生素開(kāi)發(fā)有著巨大潛力。

Lachesana tarabaevi毒液中分離出一種獨(dú)特的抗菌肽 CIT1a。構(gòu)建一個(gè)由四環(huán)素依賴人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制的表達(dá)CIT1a 基因的質(zhì)粒載體，用含有CIT1a 基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人胚胎腎HEK293 細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因的控制表達(dá)導(dǎo)致感染細(xì)胞內(nèi)沙眼細(xì)胞存活率顯著降低，表明抗菌肽在病原體生命周期的早期發(fā)揮了強(qiáng)大的抗衣原體作用[46-47]；從Lycosa erythrognatha毒液中分離出抗菌肽 LyeTxI，與LyeTxI 相比作為結(jié)構(gòu)修飾LyeTxI-b 具有乙?；疦-末端和組氨酸殘基的缺失，二級(jí)結(jié)構(gòu)是一個(gè)明確的螺旋段，從第二個(gè)氨基酸到酰胺化的C 端疏水和親水面之間沒(méi)有明確的劃分。此外，LyeTxI-b 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，比天然肽對(duì)大腸桿菌的抑制活性高10 倍[48]。結(jié)果表明，蜘蛛毒素代表了一系列開(kāi)發(fā)新的抗生素潛在的藥物模板。

一系列耐藥菌株的出現(xiàn)嚴(yán)重威脅了人類的生命健康安全，新型抗生素的研發(fā)勢(shì)在必行，蜘蛛毒素為其提供了有價(jià)值的天然分子模板。

5 蛛毒作為殺蟲(chóng)劑

在數(shù)量龐大的節(jié)肢動(dòng)物中，超過(guò)10 000 種被認(rèn)為是有害生物，造成了農(nóng)作物產(chǎn)量的大量損失，目前主要通過(guò)使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑加以控制。但這些農(nóng)用化學(xué)品的廣泛使用導(dǎo)致的遺傳選擇壓力使耐殺蟲(chóng)劑節(jié)肢動(dòng)物快速發(fā)展，以及影響人類健康和造成環(huán)境污染。理想的生態(tài)友好型生物殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)應(yīng)該是具有口服或者局部活性，即使在極端的野外條件下也是穩(wěn)定的，具有快速殺死昆蟲(chóng)或使目標(biāo)昆蟲(chóng)失去能力，并對(duì)人類和其它脊椎動(dòng)物包括魚(yú)類和鳥(niǎo)類不起作用[49]。它們還應(yīng)對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的授粉者和天敵等有益昆蟲(chóng)無(wú)害，不應(yīng)造成生物累積或形成有害的降解產(chǎn)物。蜘蛛是最成功的節(jié)肢動(dòng)物捕食者之一，其毒液已經(jīng)被證明是殺蟲(chóng)肽的豐富來(lái)源，可以通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道而導(dǎo)致昆蟲(chóng)癱瘓或死亡[50]。這些肽通常含有特殊的二硫鍵排列，能穩(wěn)定存在于昆蟲(chóng)的腸道和血淋巴中。

Nephila clavata毒液中鑒定出一種新型毒素μ-NPTX-Nc1a，Nc1a 對(duì)蟑螂背側(cè)未配對(duì)正中神經(jīng)元 （DUM） NaV和KV通道有抑制作用，Nc1a 對(duì)蜚蠊的LD50= 573 ng/g[51]；平甲蛛屬Loxosceles蜘蛛毒液中LiTx 家族以殺蟲(chóng)活性而聞名，它們對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)如草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda和斜紋夜蛾Spodoptera cosmioides具有殺蟲(chóng)活性[52]；Araneus ventricosus毒液可阻斷美洲大蠊Periplaneta americanaDUM 的NaV電流，美洲大蠊注射該毒液后出現(xiàn)明顯的中毒癥狀 （LD50= 30.7 mg/g）[53]。數(shù)據(jù)表明，這些毒素作為殺蟲(chóng)劑應(yīng)用有著較強(qiáng)的有效性和靶向性。

寄生型的小型蜂巢甲蟲(chóng)Aethina tumida以花粉、蜂蜜和歐洲蜜蜂幼蟲(chóng)為食，對(duì)養(yǎng)蜂業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損害。將蜘蛛毒神經(jīng)毒素ω-hexatoxin-Hv1a （Hv1a） 連接snowdrop lectin （Galanthus nivalis agglutinin，GNA）N 端或C 端構(gòu)建重組Hv1a/GNA 和GNA/Hv1a 融合蛋白。兩種毒素對(duì)甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性相似 （LD50分別為1.5 nmol/g 和0.9 nmol/g），而注射大于200 nmol/g對(duì)成年蜜蜂的存活無(wú)影響。GNA/Hv1a 喂食幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)作用明顯高于Hv1a/GNA （LC50分別為0.52 mg/mL和1.14 mg/mL ），但對(duì)成蟲(chóng)的毒性相近。用GNA/Hv1a 注射到卵內(nèi)后，幼蟲(chóng)的存活率顯著降低[54]。該毒素可作為殺蟲(chóng)劑的先導(dǎo)，有望作為新型生物殺蟲(chóng)劑開(kāi)發(fā)。

6 蛛毒與心血管疾病

心腦血管疾病是危害人類健康和生命的重大疾病，特別是在老年人群中患病率較高，在我國(guó)死亡率居各種疾病之首[55]。蜘蛛毒液中的活性多肽有望開(kāi)發(fā)為心腦血管藥物，目前已取得了初步的研究進(jìn)展。

Grammostola spatulate毒液中分離出的肽GsMtx-4 能特異性地阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)離子通道，并抑制成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的容積激活電流。其作用的特異性表現(xiàn)為對(duì)兔心室細(xì)胞和大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的靜息電位無(wú)影響。在不改變靜息動(dòng)作電位的情況下，對(duì)兔心臟擴(kuò)張所引起的心房顫動(dòng)有良好的效果[56]，可能開(kāi)發(fā)為一種新的用于治療纖顫抗心律失常藥物。

Lasiodora sp.蜘蛛毒液及來(lái)自Lycosa singoriensis的Lycosin-I 可誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管擴(kuò)張，這種擴(kuò)張依賴于有功能的內(nèi)皮細(xì)胞的存在，可被一氧化氮合酶 （NOS） 抑制劑L-NAME 所消除[57-58]，有可能通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮依賴性舒張作用成為一種降壓藥。

7 蛛毒具有抗腫瘤活性

目前關(guān)于腫瘤治療的難題仍未攻克，抗腫瘤藥物一般副作用較強(qiáng)，且癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性使治療更加復(fù)雜。腫瘤細(xì)胞在增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中往往涉及離子通道的異常變化，而毒素分子往往作用于目標(biāo)生物體關(guān)鍵生理蛋白質(zhì)元件，如：細(xì)胞膜受體和離子通道等[59]，一些蜘蛛毒素已有研究證實(shí)具有抑制腫瘤或癌細(xì)胞的能力。

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有高發(fā)病率和高死亡率，因此開(kāi)發(fā)新治療方法的研究十分緊要。Phoneutria nigriventer毒液 （PnV） 可增加自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的浸潤(rùn)，并可降低腫瘤的大小，將毒液進(jìn)一步純化得到LW-9，可增加巨噬細(xì)胞吞噬作用[60]，且在腫瘤中的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加而脾臟中沒(méi)有增加，說(shuō)明PnV 激活的巨噬細(xì)胞優(yōu)先被引導(dǎo)到腫瘤[61]。

Gomesin 來(lái) 自Acanthoscurria gomesiana蜘 蛛 毒液，它兼具穩(wěn)定性、抗癌和細(xì)胞穿透特性。通過(guò)在支架中加入D-氨基酸設(shè)計(jì)了一種改進(jìn)的無(wú)毒的環(huán)狀Gomesin 類似物，保留了進(jìn)入癌細(xì)胞的能力，可作為傳遞藥物的支架且不損害健康細(xì)胞[62]，證明了蛛毒可作為模板設(shè)計(jì)抗癌藥的潛力。

8 總結(jié)與展望

近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和蛋白組技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)新的活性多肽的速度越來(lái)越快，這些發(fā)現(xiàn)讓我們認(rèn)識(shí)到蛛毒作為生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)的潛力，也獲得了諸多具有生物活性的分子模板，在天然肽基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾可以揚(yáng)長(zhǎng)避短獲得活性更強(qiáng)、副作用更小的重組肽。

現(xiàn)已鑒定的近5 萬(wàn)種蜘蛛中只有少數(shù)物種進(jìn)行了毒素相關(guān)研究，且研究的深度和廣度都有待發(fā)展，蛛毒作為生物藥開(kāi)發(fā)有著巨大潛力，更多具有研究?jī)r(jià)值的蜘蛛毒素等待被開(kāi)發(fā)利用。我們不可能針對(duì)每種蜘蛛的每種毒素都進(jìn)行分子水平的藥理活性探索，因此如何在眾多物種的大量毒素中尋找到符合人類需求的毒素信息是我們面臨的重要問(wèn)題。