基于Wilson病模型論肝主疏泄對(duì)銅穩(wěn)態(tài)晝夜節(jié)律調(diào)控的現(xiàn)代研究構(gòu)想*

王共強(qiáng)，汪世靖，馬心鋒，韓詠竹，楊任民

安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所 安徽合肥 230061

肝主疏泄與銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)

肝主疏泄理論是在古代醫(yī)家不斷總結(jié)既有學(xué)說(shuō)并結(jié)合臨床實(shí)踐反復(fù)驗(yàn)證，最終抽象概括的基礎(chǔ)上才得以確立的。肝主疏泄在晝夜節(jié)律調(diào)控下的人體衛(wèi)氣和血液的運(yùn)行和分布也有著晝夜節(jié)律的變化[1]。松果體通過(guò)分泌褪黑素調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)，從而完成了肝應(yīng)五時(shí)而變功能的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)制。其調(diào)控與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)有關(guān)，并有各種神經(jīng)遞質(zhì)、激素的參與，有其生理學(xué)基礎(chǔ)，肝主疏泄應(yīng)五時(shí)而變是多網(wǎng)絡(luò)多層次的復(fù)雜聯(lián)系[2-3]，但其具體微觀相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)包括金屬離子穩(wěn)態(tài)等尚需進(jìn)一步研究。

銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)涉及多種疾病，包括癌癥、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病（阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）等）及Wilson?。╓ilson's disease，WD）等。線粒體及三磷酸腺苷（ATP）也受到生物鐘的控制，細(xì)胞需要通過(guò)線粒體融合的互補(bǔ)作用來(lái)抵抗衰老。Cu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATPase的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性[4]。若是線粒體之間分裂-融合的動(dòng)態(tài)平衡受到干擾，可能會(huì)導(dǎo)致健康問(wèn)題，而介導(dǎo)線粒體分裂及融合的關(guān)鍵基因DRP1的磷酸化在線粒體生物節(jié)律調(diào)控中其中關(guān)鍵作用[5]。線粒體銅負(fù)荷的不斷增加可能嚴(yán)重影響這些細(xì)胞器，如同Wilson?。╓ilson’s disease，WD）一樣，肝銅超載會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體破壞，肝細(xì)胞死亡引起肝衰竭，尤其是在WD和動(dòng)物模型肝臟中，線粒體逐漸受損的生化功能是肝臟細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素[6]。因此，有必要揭示銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞最初是如何試圖抵消這種銅超載引發(fā)的線粒體衰變的，它們?yōu)槭裁醋罱K失敗以及晝夜節(jié)律在其間的調(diào)控作用。

WD作為銅穩(wěn)態(tài)失衡相關(guān)疾病研究最佳模型之一，是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病，在以D-青霉胺、曲恩汀等為代表的銅螯合藥物治療WD臨床提高了療效，但仍有超過(guò)20%患者出現(xiàn)癥狀加重，同時(shí)還要預(yù)防過(guò)度螯合引發(fā)銅缺乏等毒副作用。為此，有學(xué)者提出WD治療策略的變革，不再提倡驅(qū)銅療法以去除堆積的銅，而是使血液中的游離銅離子濃度常態(tài)化以逆轉(zhuǎn)銅中毒[7]。近年來(lái)學(xué)者不斷嘗試探索非螯合治療方法以減少目前螯合治療的毒副作用，比如生物聚合物8-羥基喹啉、α-硫辛酸、甲烷菌素等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得初步療效，近期有學(xué)者提出抗氧化劑褪黑激素可以充當(dāng)銅螯合劑的研究假設(shè)[8]。因此，如何盡快恢復(fù)WD患者銅穩(wěn)態(tài)平衡以及篩選最佳銅螯合治療條件是目前急需解決的科學(xué)問(wèn)題。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療理論的展開，如何精確了解銅代謝的途徑及銅穩(wěn)態(tài)維持的機(jī)制，研究將為以WD代表的銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)相關(guān)疾病嘗試建立更有效、安全、經(jīng)濟(jì)“精準(zhǔn)驅(qū)銅”的螯合治療時(shí)效模式[9]，對(duì)幫助其病情恢復(fù)和提高生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。

WD為肝失疏泄之病機(jī)理論的探索

祖國(guó)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中尚未見WD有明確的記載，依據(jù)本病多見的腹痛、黃疸、腹水、言語(yǔ)不清、手抖、流涎、肢體扭轉(zhuǎn)、情緒障礙、精神行為異常等多種臨床癥狀及體征，可將該病歸于“強(qiáng)直”“顫振”“癲狂”“黃疸”“積聚”等范疇。歷來(lái)醫(yī)家多認(rèn)為本病病因是由于先天稟賦不足，臟腑氣血功能失調(diào)所致。楊任民等[10]根據(jù)大多數(shù)WD患者所表現(xiàn)出目黃、口中發(fā)苦、晨起口氣、尿黃、便秘、舌紅苔黃膩、脈弦數(shù)或弦滑等證候，推斷本病主要病因病機(jī)為銅毒內(nèi)蘊(yùn)而導(dǎo)致日久肝膽濕熱，聚而不散為病。作者團(tuán)隊(duì)前期從絡(luò)病理論出發(fā)認(rèn)為WD病機(jī)在于毒損絡(luò)脈，其演變過(guò)程有毒邪伏絡(luò)期、毒損肝絡(luò)期、肝絡(luò)瘀阻期、毒邪逆?zhèn)髌谒膫€(gè)時(shí)期。邪毒屬于內(nèi)生伏毒，“銅毒”只是發(fā)病的始動(dòng)之毒，除“銅毒”之外還有各種級(jí)聯(lián)內(nèi)生之毒，提出扶正解毒通絡(luò)的基本治療原則[11]。肝主疏泄功能存在季節(jié)性的變化，通過(guò)自身的季節(jié)性變化引起氣血津液以及各項(xiàng)身體機(jī)能隨之發(fā)生變化，認(rèn)為這種季節(jié)性改變的生理機(jī)制是與機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)密切相關(guān)[12]，臨床上軀體外傷及精神刺激等創(chuàng)傷應(yīng)激常是誘發(fā)WD病情發(fā)生和加重的主要因素，可見，這與肝失疏泄導(dǎo)致銅毒在體內(nèi)的重新分布有關(guān)[13]?！案沃魇栊埂弊钤鐏?lái)源可追溯到《黃帝內(nèi)經(jīng)》，泛指肝臟通過(guò)肝氣疏通暢達(dá)全身氣機(jī)，從而調(diào)節(jié)全身氣血精津液的運(yùn)行輸布，又對(duì)脾胃的運(yùn)化、肺氣的升降、腎精的封藏等臟腑功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。肝主疏泄的核心是調(diào)暢氣機(jī)，中醫(yī)學(xué)“天人相應(yīng)”，“五臟應(yīng)時(shí)”，其中肝應(yīng)春的實(shí)質(zhì)是肝氣疏泄的功能在春季加強(qiáng)，推動(dòng)氣血津液升發(fā)，以適應(yīng)春 “生”之氣; 在其他季節(jié)則是通過(guò)肝主疏泄對(duì)氣的調(diào)控功能隨季節(jié)而變化，協(xié)同其他四臟共同完成對(duì)人體氣機(jī)的調(diào)節(jié)，從而適應(yīng)自然界生、長(zhǎng)、化、收、藏的季節(jié)變化。從情志病季節(jié)性發(fā)病的角度探索肝主疏泄功能發(fā)現(xiàn)與之相對(duì)應(yīng)的下丘腦-垂體分泌的褪黑素呈現(xiàn)季節(jié)性分泌的變化趨勢(shì)，由此體現(xiàn)肝主疏泄四季變化的趨勢(shì)[14]。而晝夜與四季也存在相似的變化，根據(jù)中醫(yī)“子午流注”理論，子午流注即人體氣血于十二時(shí)辰間在經(jīng)脈中流動(dòng)的盛衰現(xiàn)象，因此，肝主疏泄調(diào)控下人體衛(wèi)氣營(yíng)血的運(yùn)動(dòng)和分布也有著晝夜節(jié)律的變化[15]。

線粒體銅穩(wěn)態(tài)與晝夜節(jié)律

銅作為一種重要的微量元素，在細(xì)胞內(nèi)作為細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase CcO）和銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase SOD1）合成的輔助因子參與氧化還原反應(yīng)，而線粒體作為細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的重要細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)、利用銅的主要場(chǎng)所，而線粒體需要維持氧化還原的穩(wěn)定，必須要有維持一個(gè)恒定的銅穩(wěn)態(tài)，而當(dāng)機(jī)體銅穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)異常時(shí)，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量蓄積的銅也會(huì)有線粒體來(lái)處理，此時(shí)，線粒體內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)被破壞，進(jìn)而引起線粒體氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，活性氧的大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前研究認(rèn)為，參與線粒體銅轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白主要有：銅伴侶蛋白細(xì)胞色素氧化酶（COX）17、19、23，他們均是含有半胱氨酸殘基的可溶性小蛋白，它們與Cu（I）結(jié)合，參與CcO和SOD的裝配；或通過(guò)谷胱甘肽（glutathione，GSH）和陰離子非蛋白銅配體（anionic non-protein copper ligand，GuL）進(jìn)入線粒體，而后兩者的具體轉(zhuǎn)運(yùn)方式目前尚不明確[5]。而WD作為銅代謝障礙引發(fā)銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)疾病，過(guò)量銅蓄積導(dǎo)致肝腦損傷是其重要的病理基礎(chǔ)，而銅過(guò)量導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損是其重要的病理機(jī)制。目前，有關(guān)銅離子晝夜節(jié)律變化的研究尚不明確，銅離子在細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可能是通過(guò)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctr1和ATP7A蛋白的晝夜表達(dá)來(lái)實(shí)驗(yàn)，但此想象僅在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，尚未見動(dòng)物細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)[16]，其中復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

近年來(lái)，時(shí)間生物學(xué)是研究熱點(diǎn)，下丘腦視上交叉核（SCN）是調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律的中樞部位，光照及環(huán)境變化均是刺激其生物活動(dòng)的重要外界因素，通過(guò)復(fù)雜的環(huán)狀調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境的變化，這與中醫(yī)學(xué)“天人合一”的整體觀念一致[17]。目前發(fā)現(xiàn)了與晝夜節(jié)律相關(guān)的基因有CLOCK、Bmal1、Per1/2/3、Cry1/2等，其中Clock/Bmal1是重要的上游基因，可以啟動(dòng)下游基因Pers、Crys的表達(dá)產(chǎn)生正反饋的晝夜節(jié)律，而負(fù)反饋機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，除下游Pers/Crys基因的激活外，機(jī)體的代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)等均可參與[18]。研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸拉鏈家族的核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 relatedfactor 2，Nrf2）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子及中樞調(diào)節(jié)者，正常情況下Nrf2是以無(wú)活性的形式與Keap1結(jié)合復(fù)合物，當(dāng)細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)重要的能量調(diào)節(jié)感受器磷酸腺苷蛋白活化激酶（AMPK）被激活，后者可加速Nrf2與Keapl解離，促使Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE）結(jié)合，轉(zhuǎn)錄抗氧化和細(xì)胞保護(hù)的基因，發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用[19]。當(dāng)而當(dāng)機(jī)體處于晝夜節(jié)律失衡出現(xiàn)氧化應(yīng)激增強(qiáng)時(shí)，節(jié)律基因Bmal1可以上調(diào)Nrf2的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生抗氧化作用，而后者可通過(guò)激活線粒體沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirt3）的表達(dá)，促進(jìn)線粒體mDNA的表達(dá)，激活超氧化物歧化酶（SOD2），減少GSPx的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化作用，同時(shí)，Nrf2又能夠上調(diào)Per2和Cry2的表達(dá)，發(fā)生晝夜節(jié)律的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[20]。除外受晝夜節(jié)律中樞的調(diào)控之外，機(jī)體其他臟器亦具有自身獨(dú)立的晝夜調(diào)節(jié)機(jī)制，如高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)研究表明，肝臟具有獨(dú)特的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)功能，對(duì)代謝過(guò)程如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）補(bǔ)救途徑和糖原轉(zhuǎn)換具有特異性。研究證明在其他組織生物鐘功能喪失的情況下，肝臟晝夜節(jié)律的自律性也可以維持一定的功能，并可以獨(dú)立于中樞生物鐘而對(duì)光照改變做出應(yīng)答，監(jiān)測(cè)晝夜光強(qiáng)度的變化而行使組織功能[21]。生物體銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)存在晝夜節(jié)律變化，受到細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激等多種因素的影響，從節(jié)律基因表達(dá)環(huán)路的中實(shí)現(xiàn)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的調(diào)控，而Nrf2作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在銅蓄積導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，激活下游Sirt3發(fā)揮線粒體保護(hù)作用，同時(shí)阻斷上游的AMPK磷酸化以及參與節(jié)律基因Per2和Cry2表達(dá)的調(diào)控。因此，明確線粒體銅的轉(zhuǎn)運(yùn)通路晝夜節(jié)律變化及其機(jī)制，對(duì)于引導(dǎo)螯合治療以及尋找最佳螯合時(shí)效具有重要意義。

展 望

肝的疏泄功能與生命活動(dòng)息息相關(guān)，參與人體氣血運(yùn)行、水谷運(yùn)化、水液代謝、精神情志活動(dòng)等。WD主要病機(jī)為先天稟賦不足，后天運(yùn)化失常，銅毒內(nèi)聚傷及臟腑，并根據(jù)患者主要表現(xiàn)從肝膽濕熱、經(jīng)脈瘀阻入手，創(chuàng)立以清熱解毒、通腑利濕為治法治則的方劑肝豆湯，使患者臨床改善率明顯提高[22]。中西醫(yī)觀的不同對(duì)時(shí)間生物學(xué)的研究提供了新的研究思路，同時(shí)時(shí)間生物學(xué)也為研究中西醫(yī)結(jié)合提供了廣闊的前景。通過(guò)梳理肝主疏泄的晝夜節(jié)律，探究WD其生理病理機(jī)制。同時(shí)也將為AD、PD等其他銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)相關(guān)疾病尋找新的治療思路和借鑒，并結(jié)合臨床研究，尋求新的組方思路，對(duì)臨床具有重要的指導(dǎo)意義。因此，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)層面，結(jié)合時(shí)間醫(yī)學(xué)相關(guān)研究結(jié)果與肝主疏泄功能和銅穩(wěn)態(tài)平衡結(jié)合進(jìn)行交叉研究，以闡述肝主疏泄對(duì)線粒體銅穩(wěn)態(tài)晝夜節(jié)律調(diào)控的科學(xué)內(nèi)涵，對(duì)揭示肝主疏泄從多層次、多因素統(tǒng)一認(rèn)識(shí)機(jī)體整體調(diào)節(jié)規(guī)律的深層內(nèi)涵具有重要意義。