許麥成，程新梅，馬呂麗

銀杏葉提取物調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠模型血脂的有效劑量研究

許麥成，程新梅*，馬呂麗

杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 311100

探索銀杏葉提取物（ginkgo leaf extracts，GBE）調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠模型血脂的有效劑量。SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、DBE（1.2、3.8、12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg?）組、非諾貝特（20 mg/kg）?組。除對照組，其余大鼠以高脂飼料飼養(yǎng)1周建立高脂血癥大鼠模型。除對照組和模型組，其余各組大鼠ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)6周。每2周檢測大鼠血清中三酰甘油（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。給予GBE 2、4、6周后對大鼠調(diào)血脂的最低有效劑量分別為37.9、12.0、3.8 mg/kg?；給予GBE（119.8、378.7 mg/kg）4、6周后對大鼠的調(diào)血脂作用無顯著差異。GBE用于短期治療高脂血癥的有效劑量為37.9～119.8 mg/kg（相當(dāng)60 kg成人每天用量為377.6～1 193.3 mg），用于預(yù)防或保健作用的最低劑量為3.8 mg/kg（相當(dāng)60 kg成人每天用量為37.8 mg）。

銀杏葉提取物；有效劑量；高脂血癥；三酰甘油；總膽固醇；低密度脂蛋白膽固醇；高密度脂蛋白膽固醇

銀杏葉提取物（ginkgo leaf extracts，GBE）作為食品補(bǔ)充劑，在美國連續(xù)多年處于銷量前10名，2018年銀杏葉制劑、保健食品和化妝品的全球市場總銷售額超過70億美元。文獻(xiàn)報道?[1]的GBE臨床前藥效學(xué)研究劑量和臨床使用劑量范圍極大，GBE調(diào)節(jié)大鼠血脂的最低劑量為4 mg/kg，最高劑量為5000 mg/kg。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）數(shù)據(jù)庫顯示，GBE作為膳食補(bǔ)充劑每人的最小劑量為2.5 mg/d，最大劑量為660 mg/d。我國原國家藥品食品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫顯示，GBE作為藥品的劑量為17.5～240 mg/d，作為保健食品的劑量為20～190 mg/d。GBE引發(fā)的不良反應(yīng)如內(nèi)出血?等，提示應(yīng)關(guān)注GBE臨床使用的劑量和療程，其不良反應(yīng)與劑量和療程呈正相關(guān)?[2-5]。本研究對GBE調(diào)血脂作用劑量進(jìn)行探索，旨在為其臨床合理使用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

GBE（棕褐色粉末，批號GBE-202-201401003）含總黃酮醇苷25.57%、萜類內(nèi)酯6.62%、銀杏總酸1.24×10?6，購自浙江紹興東靈保健食品有限公司；非諾貝特（批號18862，規(guī)格200 mg/粒）購自法國Abott Labratories Limited公司；三酰甘油（triglycerides，TG）測定試劑盒（批號07010/00000210）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒（批號07014/00000267）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒（批號17411/00000152）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（批號17410/00000156），購自德國DiaSys Diagnostic Systems GmbH公司；高脂飼料（添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉），購自浙江省實驗動物中心。

1.2 動物

清潔級SD雄性大鼠100只，7周齡，體質(zhì)量190～240 g，由浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號1609180003。動物飼養(yǎng)于SPS級動物實驗室，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照明暗交替各12 h，通風(fēng)每小時大于15次，自由攝食與飲水，動物實驗設(shè)施條件合格證號SYXK（浙）2013-0188。動物實驗操作遵循浙江省中藥研究所實驗動物管理和使用規(guī)定，符合3R原則。

1.3 儀器

7020全自動生化分析儀（日本日立株式會社）；L-550離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 劑量設(shè)定依據(jù)

GBE臨床用于調(diào)血脂的劑量中位數(shù)約為120 mg/d，根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量的體表面積折算，相當(dāng)于200 g大鼠的劑量為12 mg/kg。以12 mg/kg作為中間劑量，以3.16倍級間距向下設(shè)置2個劑量：3.8、1.2 mg/kg?；向上設(shè)置3個劑量：37.9、119.8、378.74 mg/kg??[6]。

2.2 藥物配制

稱定0.12、0.38、1.20、3.79、11.98、37.87 g GBE粉末，加1000 mL蒸餾水，攪拌混勻，分別配制成質(zhì)量濃度為0.12、0.38、1.20、3.79、11.98、37.87 mg/mL的溶液，于4 ℃保存。稱定2 g非諾貝特，溶于1000 mL蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，于4 ℃冰箱保存。

2.3 高脂血癥大鼠模型的建立、分組與給藥

10只SD大鼠給予基礎(chǔ)飼料作為對照組，其余大鼠給予高脂飼料1周后，眼內(nèi)眥采血，4000 r/min離心10 min，分離血清，測定血清中TC、TG水平。剔除血清TG＜3.0 mmol/L?、TC＜2.0 mmol/L的10只大鼠，將余下大鼠按TG、TC水平隨機(jī)分成模型組，GBE（1.2、3.8、12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg，按體表面積折算相當(dāng)于60 kg成人每天用量為12.0、37.8、119.5、377.6、1 193.3、3 770.9 mg）組和非諾貝特（20 mg/kg，相當(dāng)于人用劑量的6倍）組，每組10只。分組后各給藥組與模型組比較TC、TG水平均無顯著性差異，與對照組比較TC、TG水平有顯著差異，表明模型制備成功?[7]。

對照組大鼠給予維持飼料，其余各組給予高脂飼料。每天上、下午，各給藥組ig相應(yīng)藥物（5 mL/kg），模型組與對照組ig等體積生理鹽水，連續(xù)6周，每周測定并記錄大鼠體質(zhì)量。實驗結(jié)束，麻醉后脫頸椎處死。

2.4 大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的檢測

每2周測定1次大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。給藥1 h后，各組大鼠眼內(nèi)眥采血，4000 r/min離心10 min，分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 GBE對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響

如表1所示，各組大鼠體質(zhì)量無顯著性差異，表明GBE對大鼠體質(zhì)量無明顯影響。

3.2 GBE對高脂血癥大鼠血清中TG和TC水平的影響

如圖1、2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清TG、TC水平顯著升高（＜0.001）。與模型組比較，非諾貝特組第2、4、6周TG、TC水平均顯著降低（＜0.01、0.001）；GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組自第2周血清TG、TC水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），呈劑量相關(guān)性，但第4、6周無明顯劑量相關(guān)性；GBE（12 mg/kg）組自第4周TG、TC水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；GBE（3.8 mg/kg）組自第6周TG、TC水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.3 GBE對高脂血癥大鼠血清HDL-C、LDL-C水平的影響

如圖3、4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清HDL-C水平顯著降低（＜0.05），LDL-C水平顯著升高（＜0.001）。與模型組比較，非諾貝特組第6周HDL-C水平顯著升高（＜0.01），第4、6周LDL-C顯著降低（＜0.001）。GBE（119.8、378.7 mg/kg）組自第2周血清HDL-C水平顯著升高（＜0.01、0.001），LDL-C水平顯著降低（＜0.01、0.001）；GBE（37.9 mg/kg）組第4周血清HDL-C水平顯著升高（＜0.05、0.01），自第2周LDL-C水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；GBE（12 mg/kg）組第6周血清HDL-C水平顯著升高（＜0.05），LDL-C水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

本研究結(jié)果表明，給藥第2周，GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低，GBE（119.8、378.7 mg/kg）組血清HDL-C水平顯著升高，呈劑量相關(guān)性。給藥第4周，GBE（12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC水平顯著降低，GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清HDL-C水平顯著升高，血清LDL-C水平顯著降低。給藥第6周，GBE（3.8、12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC水平顯著降低，GBE（37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清HDL-C水平顯著升高，GBE（12.0、37.9、119.8、378.7 mg/kg）組血清LDL-C水平顯著降低。給藥第4、6周，GBE（119.8、378.7 mg/kg）組血清TG、TC水平與劑量無明顯相關(guān)性。以上結(jié)果表明，GBE用藥時間對藥效影響較大，用藥時間越長，藥效越明顯。用藥2周GBE的最低有效劑量為37.9 mg/kg，用藥4周GBE的最低有效劑量為12.0 mg/kg，用藥6周GBE的最低有效劑量為3.8 mg/kg。當(dāng)療程大于4周，且劑量大于119.8 mg/kg時，提高劑量并不能增強(qiáng)療效。

GBE組和非諾貝特組大鼠血清TC、TG水平未恢復(fù)到正常水平，可能與模型大鼠用藥過程給予高脂飼料有關(guān)，提示適當(dāng)控制飲食有益于調(diào)血脂。Drago等?[8]研究結(jié)果顯示，與每日1次口服80 mg GBE比較，成人每日2次口服40 mg GBE，血藥濃度與時間曲線下面積（AUC）、半衰期（1/2）和平均滯留時間（mean residence time，MRT）均明顯提高，表明每日2次比每日1次給藥更有利于發(fā)揮藥效。本研究的最低有效劑量為3.8 mg/kg，低于文獻(xiàn)報道的最低有效劑量?[9-13]，可能與每日給藥2次且給藥時間較長有關(guān)。

GBE的臨床不良反應(yīng)涉及全身各系統(tǒng)，如出血（嚴(yán)重顱內(nèi)出血、嚴(yán)重蛛網(wǎng)膜下腔血、自發(fā)性前房出血、嚴(yán)重雙側(cè)硬膜下血腫），過敏反應(yīng)，高血壓，粒細(xì)胞減少，血管紅腫，癲癇發(fā)作，中樞神經(jīng)興奮，急性腸胃炎等?[13]。因此，GBE用于臨床治療時劑量不宜大于119.8 mg/kg（根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量的體表面積折算，每日用量為1 193.3 mg），用于預(yù)防和保健時用量可低至3.8 mg/kg（根據(jù)60 kg成人體質(zhì)量的體表面積折算，每日用量為37.8 mg）。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張琪, 馬博, 朱玲玲, 等. 銀杏葉提取物對實驗性高脂血癥大鼠的調(diào)脂機(jī)制 [J]. 華西藥學(xué)雜志, 2007, 22(6): 605-608.

[2] 劉磊, 衛(wèi)昊, 陳丹丹, 等. 銀杏葉提取物調(diào)控TLR4/ NF-κB通路減輕急性腦缺血小鼠腦皮質(zhì)缺血研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(21): 5282-5288.

[3] 金鑫. 銀杏葉提取物藥理研究進(jìn)展 [J]. 天津藥學(xué), 2012, 24(2): 69-71.

[4] 韋麗華. 31例銀杏葉提取物制劑不良反應(yīng)的文獻(xiàn)分析 [J]. 內(nèi)科, 2007, 2(6): 994-996.

[5] Matthews M K Jr. Association ofwith intracerebral hemorrhage [J]., 1998, 50(6): 1933-1934.

[6] 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學(xué) [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1991: 178-179.

[7] 輔助降血脂功能評價方法[S]. 2012: 60.

[8] Drago F, Floriddia M L, Cro M,. Pharmacokinetics and bioavailability of aextract [J]., 2002, 18(2): 197-202.

[9] 陳為健. 銀杏葉對高血脂大鼠血脂水平的影響 [J]. 全科口腔醫(yī)學(xué)電子雜志, 2019, 6(28): 173.

[10] 豐飛, 金偉東, 吳翔. 銀杏葉提取物對動脈粥樣硬化大鼠斑塊及血脂水平影響 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2009, 5(10): 10-13.

[11] 彭亮, 趙鵬, 李彬, 等. 銀杏葉提取物對大鼠血脂調(diào)節(jié)作用的研究 [J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012, 18(4): 249-250.

[12] 陳梅霞, 蘇潔, 張玥莉, 等. 銀杏葉提取物與銀杏黃酮對高脂血癥大鼠血脂水平影響的比較研究 [J]. 中國新藥雜志, 2014, 23(7): 833-838.

[13] 鄭楠, 孫毅坤. 銀杏葉提取物不良反應(yīng)16例總結(jié) [J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2014, 30(3): 110-111.

Study on effective dosages of ginkgo leaf extracts on regulating blood lipid of hyperlipidemia rats

XU Mai-cheng, CHENG Xin-mei, MA Lyu-li

Hangzhou Huqing Yutang Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 311100, China

To study the effective dosages of ginkgo leaf extracts（GBE）on regulating blood lipid of hyperlipidemia rats.SD rats were randomly divided into control group, model group, GBE (1.2, 3.8, 12.0, 37.9, 119.8, 378.7 mg/kg) group and fenofibrate (20 mg/kg) group. Rats were feed with high-fat diet for one week to establish hyperlipidemia model except control group. Rats were igadministrated corresponding drugs except control and model group, once daily for six week. The levels of triglycerides (TG), total cholesterol (TC), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in serum of rats were measured every two week.After being given GBE for 2, 4, 6 weeks, the minimum effective dosages of GBE for regulating blood lipid in rats were 37.9, 12.0 and 3.8 mg/kg, respectively; GBE at dosages of 119.8 mg/kg and 378.7 mg/kg had no significant difference in regulating blood lipid in rats after 4 and 6 weeks,.The dosages of GBE in the short-term treatment of hyperlipidemia were 37.9—119.8 mg/kg?, which was equivalent to 377.6—1 193.3 mg for 60 kg adults per day), the minimum dose for preventive or health effects was 3.8 mg/kg?, which was equivalent to 37.8 mg for 60 kg adults per day).

ginkgo leaf extracts; effective dosage; hyperlipidemia; triglycerides; total cholesterol; low density lipoprotein cholesterol; high density lipoprotein cholesterol

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0454 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.019

2020-11-16

許麥成，高級工程師，從事中藥制劑工藝和藥效學(xué)研究。Tel: (0571)86503610 E-mail: xxmmcc6505@sina.com

程新梅 Tel: (0571)86503627 E-mail: 379900738@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]